CC BY
101
Фармацевтические науки
УДК 615.099.07:543.51
ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ОТРАВЛЕНИЯ ТРОПИКАМИДОМ, ВВЕДЕННЫМ В ЖЕЛУДОК ТЕПЛОКРОВНЫХ, НА ОСНОВЕ ОБНАРУЖЕНИЯ В ОРГАНАХ И КРОВИ ИСХОДНОГО ТОКСИЧЕСКОГО АГЕНТА И БЛИЗКИХ ПО СТРУКТУРЕ СОЕДИНЕНИЙ
© Шорманов В.К.1, Правдюк М. Ф.* 1 2
1 Кафедра фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета, Курск;
2 Республиканский наркологический диспансер Минздрава Республики Северная Осетия-Алания, Владикавказ
E-mail: [email protected]
Изучена возможность доказательства отравления тропикамидом при его пероральном введении теплокровным животным на основе обнаружения в отравленных организмах как самого исходного токсического агента, так и близких к нему по структуре соединений (продуктов трансформации). Через различные промежутки времени после внутрижелудочного введения полуторной ЛД50 тропикамида в организм теплокровных (крысы) проводился поиск в различных органах и крови отравленных организмов исходного отравляющего агента и возможных продуктов его трансформации. Установлено присутствие тропикамида во всех исследованных органах и крови отравленных животных. В печени, ткани желудка, его содержимом и в ткани тонкого кишечника обнаружены и идентифицированы близкие по структуре к тропикамиду ^этил-Ы-(пиридин-4-ил-метил)-фенилацетамид, ^этил-2-фенил-Ы-(пиридин-4-ил-метил)-пропенамид и ^этил-3-ацетокси-2-фенил-Ы-(пиридин-4-ил-метил)-пропанамид. Обоснована возможность доказательства отравления тропикамидом на основе обнаружения в отравленных организмах исходного отравляющего агента и трех близких по структуре продуктов его трансформации.
Ключевые слова: тропикамид, продукты трансформации, обнаружение в организме и идентификация, доказательство отравлений.
PROOF OF POISONING WITH TROPICAMIDE INTRODUCED INTO STOMACH OF WARM-BLOODEDANIMALS, BASED ON THE DETECTION OF THE ORIGINAL TOXIC AGENTS AND THE COMPOUNDS WITH THE SIMILAR STRUCTURE IN ORGANS AND BLOOD
Shormanov V.K.1, PravdyukM.F.2
1 Department of Pharmaceutical, Toxicological and Analytical Chemistry of Kursk State Medical University, Kursk;
2 Republican Dispensary of Narcology of Ministry of Health of Republic of North Ossetia-Alania, Vladikavkaz
The possibility of poisoning with tropicamide after its oral introduction to warm-blooded animals has been studied in terms of the detection of the toxic agent and compounds with the similar structure (products of transformation) in poisoned organisms. After introducing LD50 of tropicamide intragastrically to warm-blooded animals (rats) in various intervals we were searching for the toxic agent and possible products of its transformation in various organs and blood of poisoned animals. The presence of tropicamide in all the examined organs and blood of poisoned animals was established. There we determined and identified compounds with the similar structure, such as N-ethyl-N-(pyridin-4-yl-methyl)-phenilacetamide, N-ethyl-2-phenyl-N-(pyridin-4-yl-methyl)-propenamid and N-ethyl-3-acetoxy-2-phenyl-N- (pyridin-4-yl-methyl)-propanamide in liver, stomach tissue and its contents, and in small intestine tissue. The possibility of poisoning by tropicamide as evidenced by detection in poisoned organisms of the toxic agent and three products of transformation with the similar structures was grounded.
Keywords: tropicamide, products of transformation, the detection and identification in the body, the proof of poisoning.
Т ропикамид (N-Этил-3 -гидрокси-2-фенил-К -(пиридин-4-ил-метил)-пропанамид) (синонимы: мидриацил, бистропамид) - биологически активное вещество, обладающее м-холинобло-кирующим действием и применяющееся в медицинской практике как мидриатическое средство при исследовании глазного дна, а также при диагностике некоторых форм деменции [2, 8, 9].
Широко известно немедицинское применение тропикамида. В частности, данное соединение наркозависимые люди вводят в организм перорально или внутривенно для достижения одурманивающего эффекта или для усиления состояния
эйфории, обусловленной последующим приемом опиатов и опиоидов [1, 3, 6].
Тропикамид (молярная масса -284,353 г/моль) представляет собой белые кристаллы без выраженного запаха, плавящиеся при температуре 97°C, способные хорошо растворяться в ацетоне и хлороформе, растворимые (5,7 г в 100 г растворителя) в эталоне и ДМСО и практически нерастворимые (<1 г в 100 г растворителя) в воде.
Рассматриваемое соединение достаточно токсично для теплокровных организмов. LD50 для крыс составляет 865 мг/кг при пероральном,
96
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2015, № 2
1210 мг/кг - при интраперитонеальном и 1210 мг/кг при подкожном введении.
Описаны многочисленные случаи отравления людей тропикамидом различной степени тяжести как в случае его совместного применения с различными наркотиками, так и самостоятельно [3].
Вопросы определения тропикамида в органах и биожидкостях человека до настоящего времени разработаны недостаточно [4, 7].
Учитывая несомненное судебно-химическое значение тропикамида, совершенствование способов доказательства отравлений данным веществом, в особенности летальных, представляет собой важную задачу теории и практики химикотоксикологического анализа [1, 4].
Цель исследования: изучение возможности доказательства отравления тропикамидом при его пероральном введении теплокровным животным на основе обнаружения в отравленных организмах как самого исходного токсического агента, так и близких к нему по структуре соединений (продуктов трансформации).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования - ^этил-3-гидрокси-2-фенил-К-(пиридин-4-ил-метил)пропанамид (тро-пикамид) (РСО с содержанием основного вещества > 99,0% (определено методом неводного титрования)).
Определяли возможность присутствия в организме всеядных теплокровных организмов (на примере лабораторных крыс) исходного отравляющего агента и близких к нему по структуре веществ (возможных продуктов трансформации) через различные промежутки времени после внутрижелудочного введения тропикамида в организм (20 мин, 2,5 часа, 6 часов). При этом в каждом случае 25 крысам-самцам породы Wistar 5-месячного возраста (5 опытных групп по 5 особей в каждой) с массой от 290 до 305 г вводили через зонд в желудок однократно ^этил-3-гидрокси-2-фенил-К-(пиридин-4-ил-ме-тил) пропанамид (1300 мг на 1 кг массы животного - полуторная LD50) в виде смеси водного раствора и водной суспензии. После декапитации животных через заданный промежуток времени их трупы вскрывали, одинаковые органы и биожидкости, взятые от животных внутри каждой из групп, объединяли и исследовали на наличие в них ^этил-3-гидрокси-2-фенил-К-(пиридин-4-
ил-метил)пропанамида (тропикамида) и близких по структуре веществ (продуктов трансформации). Исследованию подвергали также органы и биожидкости животных контрольной группы (5 особей), которым вводили в желудок дистил-
лированную воду без анализируемого вещества
[5].
Изолирование. Измельченную ткань органов (размеры частиц 0,2-0,5 см) или кровь настаивали при периодическом перемешивании дважды (по 45 минут) с порциями ацетона, масса каждой из которых в два раза превышала массу биоматериала, но была не меньшей, чем 4 мл по объему. Отдельные извлечения объединяли в выпарительной чашке, растворитель испаряли в токе воздуха при температуре 18-22оС до получения остатка.
Очистка извлечений. Остаток, полученный на завершающей стадии этапа изолирования, растворяли в 5 мл 6% раствора щавелевой кислоты, полученный щавелевокислый раствор подщелачивали 10% раствором гидроксида натрия до рН 9 и экстрагировали двукратно хлороформом порциями по 5 мл каждая. Экстракты объединяли, обезвоживали путем фильтрования через двухслойный бумажный фильтр, фильтрат упаривали в выпарительной чашке в токе воздуха при температуре 18-22оС до сухого остатка.
Обнаружение и идентификация веществ методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ МС). Сухой остаток, полученный на завершающей очистки извлечений, растворяли в 2 мл хлороформа. При необходимости (в случае присутствия больших количеств анализируемого вещества) раствор разбавляли хлороформом. 2 мкл хлороформного раствора вводили в газовый хроматограф «Маэстро» ГХ модели 7820 с квадруполь-ным масс-селективным детектором «Agilent Technologi» 5975. Введение пробы осуществляли без деления потока. Условия анализа: колонка -кварцевая капиллярная HP-5MS (30 м* 0,25 мм* 0,25 мкм) с неподвижной фазой (5%-фенил)метилполисилоксан; температура инжектора - 260оС, интерфейса детектора - 280оС; начальная температура термостата колонки -90оС, затем температура колонки изменялась от 90оС до 280оС со скоростью 20оС/мин; температура квадруполя составляла 150оС, источника ионов 230оС; газ-носитель - гелий, подаваемый со скоростью 23,10 мл/мин с задержкой на растворитель в
3 минуты. Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Сигнал регистрировали по полному ионному току. Диапазон сканирования - 40-500 m/z. Тропикамид и близкие к нему по структуре соединения обнаруживали в виде пиков на хроматограммах с определенными значениями времени удерживания и идентифицировали их по особенностям масс-спектров, совпадающих с масс-спектрами стандартных веществ электронной библиотеки на 86% и более.
97
Фармацевтические науки
Таблица 1
Вещества, обнаруженные в организме отравленных животных (крыс) через различные промежутки времени после однократного внутрижелудочного введения тропикамида в количестве 1300 мг на кг массы животного
Биологический объект (орган или биожидкость), подвергнутый исследованию Промежуток времени с момента введения тропикамида до момента гибели животных (начала исследования) Вещества, обнаруженные в биологическом объекте
Печень 20 минут Тропикамид ЮК-(П-4-ил-М)-ФАА ЮЗА02Ф]Ч-(П-4-ил-М)-ПА
2,5 часа Тропикамид Ю2ФК-(П-4-ил-М)-ПА Ю]Ч-(П-4-ил-М)-ФАА
6 часов Тропикамид
Ткань желудка 20 минут Тропикамид Ю2ФК-(П-4-ил-М)-ПА Ю]Ч-(П-4-ил-М)-ФАА
2,5 часа Тропикамид Ю2ФК-(П-4-ил-М)-ПА ЮК-(П-4-ил-М)-ФАА ЮЗА02Ф]Ч-(П-4-ил-М)-ПА
6 часов Тропикамид
Содержимое желудка 20 минут Тропикамид
2.5 часа Тропикамид
6 часов Тропикамид ЮК-(П-4-ил-М)-ФАА Ю2ФК-(П-4-ил-М)-ПА
Ткань кишечника 20 минут Тропикамид ЮТКП-4-ил-М)-ФАА
2.5 часа Тропикамид
6 часов Тропикамид
Содержимое кишечника 20 минут Тропикамид
2,5 часа Тропикамид
6 часов Тропикамид
Почки 20 минут Тропикамид
2,5 часа Тропикамид
6 часов Тропикамид
Кровь 20 минут Тропикамид
2,5 часа Тропикамид
6 часов Тропикамид
Лёгкие 20 минут Тропикамид
2,5 часа Тропикамид
6 часов Тропикамид
Селезенка 20 минут Тропикамид
2,5 часа Тропикамид
6 часов Тропикамид
Мышцы (бедренные) 20 минут Тропикамид
2,5 часа Тропикамид
6 часов Тропикамид
Сердце 20 минут Тропикамид
2,5 часа Тропикамид
6 часов Тропикамид
Мозг 20 минут Тропикамид
2,5 часа Тропикамид
6 часов Тропикамид
Примечание: используемые сокращения: NЭN-(П-4-ил-М)-ФАА - №этил-Ы-(пиридин-4-ил-метил)-фенилацетамид (время удерживания 9,37 мин); NЭ2ФN-(П-4-ил-М)-ПА - №этил-2-фенил-Ы-(пиридин-4-ил-метил)-пропенамид (время удерживания 9,59 мин); NЭ3АО2ФN-(П-4-ил-М)-ПАN - №этил-3-ацетокси-2-фенил-Ы-(пиридин-4-ил-метил)-пропанамид (время удерживания 10,25 мин).
98
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2015, № 2
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ
Результаты обнаружения и идентификации тропикамида, а также близких по структуре соединений в органах и крови отравленных животных, погибших через различные промежутки времени после введения отравляющего агента в желудок, представлены в таблице 1. Как свидетельствуют полученные результаты, тропикамид через 20 мин, 2,5 часа и 6 часов после его введения присутствовал во всех исследованных органах и крови отравленных организмов.
Из приводимой таблицы также видно, что, помимо исходного отравляющего вещества, в ряде органов отравленных животных обнаруживались вещества, близкие по структуре к тропика-миду, возможно, продукты его трансформации. Так, через 20 минут после введения тропикамида в печени были найдены ^этил-К-(пиридин-4-ил-метил)-фенилацетамид (II) и N-этил-З-ацеток-си-2-фенил-К-(пиридин-4-ил-метил)-пропанамид (III), в ткани желудка - N-этил^-фенил-^(пиридин-4-ил-метил)-пропенамид (IV),
^этил-К-(пиридин-4-ил-метил)-фенилацетамид, в ткани тонкого кишечника - ^этил-К-(пиридин-4-ил-метил)-фенилацетамид. Через 2,5 часа после введения тропикамида в печени присутствовали ^этил-К-(пиридин-4-ил-метил)-фенилацетамид и ^этил-2-фенил-К-(пиридин-4-ил-метил)-пропе-намид, в ткани желудка - ^этил-К-(пиридин-4-ил-метил)-фенилацетамид, N-этил^-фенил-^(пиридин-4-ил-метил)-пропенамид и N-этил-3-ацетокси-2-фенил-К-(пиридин-4-ил-метил)-про-панамид. Спустя 6 часов после введения исходного отравляющего вещества в содержимом желудка обнаруживались ^этил-К-(пиридин-4-ил-метил)-фенилацетамид и N-этил^-фенил-
^(пиридин-4-ил-метил)-пропенамид.
Хроматограммы тропикамида и ряда близких по структуре соединений (продуктов его трансформации), извлеченных из ткани желудка и из печени через 2,5 часа после введения отравляющего вещества, представлены на рис. 1 и 2.
Время удерживания тропикамида (I), извлеченного из биологических объектов, составляло на хроматограммах (10,04±0,09 мин).
В его масс-спектре присутствовали сигналы характерных осколков (заряженных частиц) с m/Z 44, 65, 92, 121, 137, 163, 183, 209, 225, 254, 284.
Основным (интенсивность которого принимается за 100%) является осколок с m/Z 92. В масс-спектре присутствовал молекулярный ион (m/Z 284).
Время удерживания ^этил-К-(пиридин-4-ил-метил)-фенилацетамида (II), извлеченного из биологических объектов, составляло 9,37 мин.
В его масс-спектре присутствовали сигналы характерных осколков (заряженных частиц) с m/Z 51, 65, 80, 92, 107, 121, 135, 163, 254. Основным (интенсивность которого принимается за 100%) является осколок с m/Z 92. В масс-спектре присутствовал молекулярный ион (m/Z 254).
Время удерживания ^этил-3-ацетокси-2-фе-нил-К-(пиридин-4-ил-метил)-пропанамида (III), найденного в биоматериале, составляло 10,25 мин.
В его масс-спектре присутствовали сигналы характерных осколков (заряженных частиц) с m/Z 65, 92, 104, 118, 135, 163, 225, 251, 266, 326. Основным (интенсивность которого принимается за 100%) является осколок с m/Z 92. В масс-спектре присутствовал молекулярный ион (m/Z 326).
Время удерживания ^этил-2-фенил-К-
(пиридин-4-ил-метил)-пропенамида (IV), найденного в биоматериале, составляло 9,59 мин.
В его масс-спектре присутствовали сигналы характерных осколков (заряженных частиц) с m/Z 51, 65, 77, 92, 103, 131, 135, 149, 188, 251, 266. Основным (интенсивность которого принимается за 100%) является осколок с m/Z 92. В масс-спектре присутствовал молекулярный ион (m/Z 266).
99
Фармацевтические науки
4-ил-метил)-пропенамид; 2 - ^этил-К-(пиридин-4-ил-метил)-фенилацетамид; 3 - тропикамид; 4 - N-этил-3-ацетокси-2-фенил-К-(пиридин-4-ил-метил)-пропанамид.
Рис. 2. Хроматограмма очищенного извлечения из ткани печени: 1 - ^этил-2-фенил-К-(пиридин-4-ил-метил)-пропенамид; 2 - ^этил-К-(пиридин-4-ил-метил)-фенилацетамид; 3 - тропикамид.
Как свидетельствуют полученные данные, в предлагаемых условиях хроматографическая подвижность тропикамида и трех найденных в биоматериале близких к нему по структуре веществ в колонке с (5%-фенил)метилполисилоксаном уменьшается, вероятно, с ростом полярности анализируемых структур: II > IV > I > III.
При исследовании извлечений из тканей органов, содержимого желудка и кишечника, а также крови крыс, не получавших тропикамид, установлено отсутствие на газожидкостных хромато-
граммах пиков исходного токсического агента, а также близких по структуре соединений - возможных продуктов его трансформации. Отсутствие заметного сдвига базовой линии и выраженных пиков соэкстрактивных веществ биоматериала с временем удерживания < 11 мин свидетельствовало о достаточной эффективности предлагаемой схемы очистки извлечений из биоматериала.
Таким образом, можно заключить, что доказательство отравления тропикамидом, введенным в
100
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2015, № 2
желудок теплокровных, может быть проведено с использованием предлагаемой методики на основе обнаружения в органах и крови исходного токсического агента, а также ряда близких к нему по структуре соединений (К-этил-К-(пиридин-4-ил-метил)-фенилацетамида, N-этил-Э -ацетокси-2-фе-нил-К-(пиридин-4-ил-метил)-пропанамида и ^этил-2-фенил-К-(пиридин-4-ил-метил)-пропе-намида).
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Проведен поиск и идентификация исходного отравляющего вещества и близких по структуре продуктов его трансформации в организме теплокровных животных (крысы) через различные промежутки времени после однократного введения 1300 мг/кг тропикамида в желудок.
2. Установлено, что во всех исследованных полых и паренхиматозных органах, а также крови лабораторных животных, взятых на анализ через 20 мин, 2,5 часа и 6 часов после введения тропи-камида, присутствует исходное отравляющее вещество.
3. В печени, тканях желудка и кишечника, а
также содержимом желудка отравленных организмов обнаруживались близкие по структуре к тропикамиду соединения, идентифицированные как ^этил-К-(пиридин-4-ил-метил)-
фенилацетамид, ^этил-2-фенил-К-(пиридин-4-ил-метил)-пропен-амид и ^этил-3-ацетокси-2-фенил-К-(пиридин-4-ил-метил)-пропанамид.
4. Доказательство отравления тропикамидом может основываться на обнаружении в отравленных организмах как самого отравляющего агента, так и возможных продуктов его трансформации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дворская О.Н., Карпенко Ю.Н., Тумилович Е.Ю.,
Порсева Н.Ю. О проблеме немедицинского использования лекарственного препарата тропика-
мид в Пермском крае // Медицинская экспертиза и право. - 2011. - № 1. - С. 17-19.
2. Коваленко Н.Я., Мациевский Д.Д., Решетняк В.К. Влияние селективной блокады М4-холиноре-цепторов тропикамидом на кровоснабжение мозга, непарных органов спланхнического бассейна и нижних конечностей интактных крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2013. - Т. 156, № 12. - С. 697-700.
3. Лаврентьева А.В., Банникова Г.А., Мелентьев А.Б. Определение тропикамида в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором // Проблемы экспертизы в медицине. - 2011. -Т. 11, № 1-2. - С. 16-18.
4. Тумилович Е.Ю., Крылова Е.В., Карпенко Ю.Н., Дворская О.Н. Определение оптимальных условий обнаружения тропикамида в биологических жидкостях методом тонкослойной хроматографии // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. - 2011. - № 8. - С. 133-134.
5. Шорманов В.К., Галушкин С.Г., Коваленко Е.А., Терских А.П. Изучение особенностей распределения карбофурана в организме теплокровных животных // Судебно-медицинская экспертиза. -2015. - Т. 58, № 1. - С. 40-43.
6. Bersani F.S., Corazza O., Simonato P., Mylokosta A., Levari E., Lovaste R., Schifano F. Drops of madness? Recreational misuse of tropicamide collyrium; early warning alerts from Russia and Italy // General Hospital Psychiatry. - 2013. - Vol. 35, N 5. - Р. 571-573.
7. Galmier M.J., Frasey A.M., Meski S., Beyssac E., Petit J., Aiache J.M., Lartigue C. High-performance liquid chromatographic determination of phenylephrine and tropicamide in human aqueous humor // Biomed Chromatogr. - 2000. - Vol. 14, N 3. - Р. 202-204.
8. Shoaibi Z.A., Gouda A.A. Extractive spectrophotomet-ric method for the determination of tropicamide // J. Young Pharmacists. - 2012. - Vol. 4. - Р. 42-48.
9. Souri E., Amanlou M., Shahbazi S., Bayat M. Development and Validation of a Rapid Derivative Spectro-photometric Method for Determination of Tropicamide in Eye DropsIranian // Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2010. - Vol. 6, N 3. - P. 171-178.
101
