CC BY
20
УДК: 591.8:618.36:636.082.455 DOI 10.24412/2409-3203-2021 -25-41 -46
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ 1 И 9 В ПЛАЦЕНТЕ КОРОВ ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ И ОСЛОЖНЕННОЙ ПРЕЭКЛАМПИЕЙ
БЕРЕМЕННОСТИ
Приходько Светлана Алексеевна
ведущий специалист «Научно-образовательный центр молекулярно-генетических
технологий» Шаронов Дмитрий Сергеевич старший лаборант «Научно-образовательный центр молекулярно-генетических
технологий»
ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный аграрный университет»
Россия, г. Волгоград.
Великородная Юлия Ивановна заведующий лабораторией патоморфологии Антонов Валерий Алексеевич д.м.н., профессор
ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии»
Россия, г. Волгоград
Аннотация: Матриксные металлопротеиназы (ММР) играют ключевую роль в ремоделировании и функционировании маточно-плацентарного барьера на протяжении всей беременности и могут использоваться как прогностические маркеры преэклампсии и преждевременных родов. В настоящем исследовании изучена локализация MMP-1 и MMP-9 в плаценте крупного рогатого скота при нормальной и осложненной преэклампсией беременности с помощью иммуногистохимического метода. Результаты проведенного исследования продемонстрировали клеточно-специфическую локализацию ММР-1 и ММР-9 в маточно-плацентарных структурах. При этом в плаценте коров с физиологическим течением беременности уровень экспрессии ММР-9 превалировал над ММР-1, в то время как в плацентах коров с преэклампсией содержание ММР-9 было значительно снижено. Таким образом, изменение баланса металлопротеиназ в плаценте коров может способствовать развитию преэклампсии. А возможность неинвазивного их определения в биосредах может использоваться в качестве диагностических маркеров для проведения лечебных или профилактических мероприятий, направленных на нивелирование патологического процесса.
Ключевые слова: плацента, корова, преэклампсия, матриксные металлопротеиназы, иммуногистохимия
DISTRIBUTION OF METALLOPROTEINASES 1 AND 9 IN THE PLACENTA OF COWS DURING PHYSIOLOGICAL AND COMPLICATED PREECLAMPIA OF
PREGNANCY
Prikhodko Svetlana Alekseevna
leading specialist of the Scientific and Educational Center for Molecular Genetic Technologies
Sharonov Dmitry Sergeevich Senior Laboratory Assistant, Scientific and Educational Center for Molecular Genetic
Technologies
Federal State Budget Educational Institution of Higher Education «Volgograd State Agrarian University»
Russia, Volgograd Velikorodnaya Yu. I.
Head of the Pathomorphology Laboratory Antonov Valery Alekseevich
Ph.D., Professor
Federal State Unitary Enterprise «Research Institute of Hygiene, Toxicology and Occupational Pathology» of the Federal Medical and Biological Agency of Russian Federation
Russia, Volgograd
Abstract: Matrix metalloproteinases (MMPs) play a key role in the remodeling and functioning of the uteroplacental barrier throughout pregnancy and can be used as prognostic markers of preeclampsia and preterm labor. In the present study, the localization of MMPs-1 and MMPs-9 in the placenta of cattle during normal and complicated pregnancy with preeclampsia was studied using the immunohistochemical method. The results of the study demonstrated the cell-specific localization of MMPs-1 and MMPs-9 in the uteroplacental structures. At the same time, in the placenta of cows with a physiological course of pregnancy, the level of expression of MMPs-9 prevailed over MMPs-1, while in the placenta of cows with preeclampsia, the content of MMPs-9 was significantly reduced. Thus, changes in the balance of metalloproteinases in the placenta of cows may contribute to the development of preeclampsia. And the possibility of their non-invasive determination in biological media can be used as diagnostic markers for therapeutic or prophylactic measures aimed at leveling the pathological process.
Key words: placenta, bovine, preeclampsia, matrix metalloproteinases, immunohi stochemi stry
Введение
Проблемы репродуктивных функций у крупного рогатого скота, связанные с вынашиванием и отелом, привлекают большое внимание из-за их негативного воздействия на продуктивность и последующую фертильность коров [1]. Понимание физиологических событий, регулирующих формирование и реорганизацию плаценты, является предпосылкой для лечения и профилактики у коров таких патологических состояний как гестоз, преэклампсия и задержка плаценты и плодных оболочек.
В формировании и реорганизации плаценты, а также в поддержании ее функций важную роль играет внеклеточный матрикс (ВКМ), регуляторными медиаторами которого являются матриксные металлопротеиназы (ММР).
ММР в плаценте обладают протеолитической активностью, необходимой для эффективной инвазии трофобластов в стенку матки, и нарушение активности этих ферментов может вызывать преэклампсию. Также ММР участвуют в разрыве плодных оболочек, отслоении плаценты от материнской матки во время родов. На ранних стадиях беременности снижение MMP нарушает нормальное ремоделирование спиральных артерий, что приводит к начальным патофизиологическим изменениям, наблюдаемым при преэклампсии. На более поздних сроках беременности повышение MMP вызывает аномальное высвобождение вазоактивных факторов, провоцирующих гипертензию. В дополнение к их сосудистым эффектам, снижение активности ММР в матке может препятствовать росту и расширению органа и приводить к преждевременным родам [2].
Роль ММР достаточно хорошо изучена у коров при патологической задержке плодных оболочек [3], в то время как вопрос об участии данных ферментов в развитии преэклампсии остается дискутабельным.
Цель данной работы - изучить распределение металлопротеиназ -1 и -9 в плаценте коров при физиологической и осложненной преэклампсией беременности.
Материалы и методы
Для иммуногистохимического исследования образцы плацент коров с нормальным протеканием беременности и с диагностированной преэклампсией фиксировали в 10%
нейтральном формалине. Затем образцы обезвоживали в батарее спиртов восходящей крепости, просветляли в хлороформе с использованием гистопроцессора Cytadel 2000 (Shendon, Великобритания) и заключали в парафиновую среду Histomix (Биовитрум, Россия). С помощью ротационного микротома (MICROM, Германия), получали срезы толщиной 5 мкм и монтировали их на предметные стекла, обработанные поли-Ь-лизином (Menzel).
Для демаскировки антител производили высокотемпературную обработку срезов в цитратном буфере (рН=6,0) в течение 10 минут. Постановку иммуногистохимических реакций проводили с помощью полимерной пероксидаза-антипероксидазной (ПАП) системы визуализации согласно инструкции производителя (Lab Vision, США). Пероксидазу проявляли 3-3-диаминобензидином из набора протокола. На заключительном этапе реакции срезы докрашивали гематоксилином Майера.
Микропрепараты изучали и фотографировали с помощью микроскопа AxioScope.A1 (ZEISS, Германия), оборудованного цифровой камерой высокого разрешения AxioCam MRc5. Полученные фотографии обрабатывали с помощью программы ZENpro 2012 (ZEISS, Германия).
Результаты и обсуждение
Локализация ММР-1 и ММР-9 в плаценте коров с нормальным протеканием беременности
Проведенное иммуногистохимическое исследование показало специфический характер распределения MMP-1 и MMP-9 в плацентарных структурах коровы при нормальном протекании беременности. Иммунолокализация ММР-1 отмечалась преимущественно в строме материнских септ. Кроме того, иммунопозитивная реакция на ММР-1 регистрировалась в околомембранном пространстве синцитиотрофобластов, а также в цитоплазме щеточной каемки (Рисунок 1).
Рисунок 1 - Иммунолокализация ММР-1 в плаценте коровы при нормальной
беременности.
Антитела к ММР-1. ПАП-метод. Докраска гематоксилином Майера.
Общее увеличение: 200 (А); 400 (Б).
В плаценте коров с физиологической беременностью ММР-9 присутствовала в цитоплазме синцитиотрофобласта и трофобласта, за исключением гигантских двуядерных клеток. При этом фермент был равномерно распределен по всей площади клеток хориона без четкой привязки к каким-либо структурам. Кроме того, в эпителиальных клетках и стромальной части материнских септ также выявляли выраженную экспрессию ММР-9 (Рисунок 2).
Рисунок 2 - Иммунолокализация ММР-9 в плаценте коровы при нормальной
беременности.
Антитела к ММР-1. ПАП-метод. Докраска гематоксилином Майера.
Общее увеличение: 200 (А); 400 (Б).
При этом соотношение металлопротеиназ ММР-1:ММР-9, согласно результатам проведенного иммуногистохимического исследования, частично сдвигалось в сторону ММР-9.
Обращало на себя внимание то обстоятельство, что в плаценте коровы при нормальной беременности исследуемые металлопротеиназы имели практически идентичную локализацию в клетках хориона, что нехарактерно для ММР-1 и ММР-9, т.к. они обладают определенной клеточно-специфической экспрессией. Так, ММР-1 (коллагеназа-1, коллагеназа фибробластов) способна деградировать фибриллярные коллагены I и III типов - основной компонент мезенхимального слоя материнских септ. В свою очередь ММР-9 (желатиназа В или коллагеназа IV типа) является ключевым эффектором ремоделирования коллагенов IV, V и IX типов, которые локализуются преимущественно в базальной мембране [4]. Поэтому ММР-1, главным образом, распределяется в стромальной ткани и связанных с ней клетках, тогда как ММР-9 ассоциируется с эпителиальными клетками.
Секреция клетками хориона плода коров как ММР-1, так и ММР-9, скорее всего, является необходимым условием для эффективной инвазии трофобласта в материнские структуры. Это может быть обусловлено тем, что плацента коровы относится к десмохориальному (синдесмохориальному) типу и для установления более плотного контакта между плодной и материнской частью плаценты необходима частичная деградация не только базальных, но и фибриллярных коллагеновых волокон.
Локализация ММР-1 и ММР-9 в плаценте коров с осложненной эклампсией беременности
В плаценте коров с осложненной эклампсией беременности фоновый уровень ММР-1 не изменялся, но подвергался перераспределению. Так, в строме дефрагментированных материнских септ иммунопозитивные клетки определяли только вокруг сосудов, в то время как гиперплазированные эпителиальные клетки крипт активно продуцировали ММР-1. При этом происходила транслокация фермента в полость лакун, свободное пространство которых было критически снижено, а ворсины в таких лакунах оказались практически полностью редуцированы (рисунок 3).
Рисунок 3 - Иммунолокализация ММР-1 в плаценте коровы при преэклампсии. Антитела к ММР-1. ПАП-метод. Докраска гематоксилином Майера. Общее увеличение: 200 (А); 400 (Б).
Результаты иммуногистохимическое изучение ММР-9 продемонстрировали резкое снижение фермента в плацентарных структурах коров с патологическим протеканием беременности. Остаточное присутствие ММР-9 наблюдали только в деградируемых септах материнской части плаценты, а также вокруг сосудов (рисунок 4).
Рисунок 4 - Иммунолокализация ММР-9 в плаценте коровы при преэклампсии. Антитела к ММР-1. ПАП-метод. Докраска гематоксилином Майера. Общее увеличение: 200 (А); 400 (Б).
Соотношение двух типов металлопротеиназ ММР-1 и ММР-9 в плацентарных структурах коровы при преэклампсии смещалось в сторону ММР-1.
В научной литературе приведены многочисленные доказательства того, что целостность внеклеточного матрикса плаценты млекопитающих имеет большое значение для поддержания ее функций. При этом для физиологического протекания беременности необходим соответствующий баланс различных видов ММР, а также их ингибиторов. Так, чрезмерная активность ММР может способствовать деградации ВКМ, тем самым вызывая отслоение плаценты и провоцируя преждевременные роды. С другой стороны, отсутствие или снижение экспрессии ММР может быть связано с недостаточной инвазией трофобласта, что в результате приводит к нарушению обменных процессов между матерью и плодом и развитию преэклампсического состояния. Также установлено, что снижение ММР-9 в сосудистом русле плаценты может привести к снижению
вазодилатации, спазму сосудов, гипертонической беременности и преэклампсии. [5]. А в плаценте детей, родившихся раньше срока, отмечали повышенный, по сравнению с контролем, уровень ММР-1, что указывало на определяющую роль этой протеиназы в преждевременных родах.
Учитывая данную информацию, новым направлением для неинвазивной диагностики состояния преэклампсии у крупного рогатого скота может стать иммуноферментное тестирование ММР в биосредах (моче, крови, околоплодных водах), что окажет положительное влияние на продуктивность и последующую фертильность коров и которое можно учитывать в оптимизации вариантов ремонта молочного стада [6].
Заключение
Таким образом, наше исследование показало, что в плаценте коров с преэклампсией происходит снижение уровня ММР-9 на фоне неизмененного содержания ММР-1, что может быть основополагающим фактором, препятствующим эффективной инвазии трофобластов, тем самым нарушая процесс плацентации. По этим причинам определение ММР-1 и ММР-9 в биосредах с помощью иммуноферментных методов может использоваться в качестве диагностических маркеров для выявления коров с риском развития преэклампсии и проведения лечебных или профилактических мероприятий, направленных на нивелирование патологического процесса.
Список литературы:
1. Приходько С.А., Кочарян В.Д., Авдеенко В.С., Родин П.В., Ушаков М.А. Морфологические взаимоотношения в плацентомах крупного рогатого скота при осложненной беременности эклампсией. ИЗВЕТИЯ Нижневолжского агропромышленного комплекса: наука и высшее профессиональное образование. Выпуск 2 (54), 2019. - 238-245 с.
2. Chen J., Khalil R.A. Matrix metalloproteinases in normal pregnancy and preeclampsia. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. - 2017. - Vol. 148. - Р. 87-165.
3. Attupuram N.M., Kumaresan A., Narayanan K., Kumar H. Cellular and molecular mechanisms involved in placental separation in the bovine: A review. Mol. Reprod. Dev. - 2016. - Vol. 83, No. 4. - P. 287-97.
4. Ярмолинская М.И., Молотков А.С., Денисова В.М. Матриксные металлопротеиназы и ингибиторы: классификация, механизм действия. Журнал акушерства и женских болезней. - 2012. - Т. 61, No. 1. - C. 113-125.
5. Стрижаков А.Н., Тимохина Е.В., Ибрагимова С.М., Белоусова В.С., Мартиросян Я.О. Новые возможности дифференциального прогнозирования ранней и поздней преэклампсии. Акушерство, гинекология и репродукция. - 2018. - Т. 12, No. 2. - С.55-61.
6. Алексеева Е.А., Четвертакова Е.В. Алгоритм моделирования оптимальных вариантов ремонта стада молочных пород крупного рогатого скота. Вестник КрасГАУ. -2019. - Т. 144, No. 3. - С. 71-78.
