CC BY
141
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, РАСТЕНИЕВОДСТВО
Известия ТСХА, выпуск 2, 2011 год
УДК 581.132
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ 13С В УГЛЕВОДАХ И МЕХАНИЗМ ФОТОСИНТЕЗА
А.А. ИВЛЕВ1, А.У ИГАМБЕРДИЕВ3, А.Ю. ДУБИНСКИЙ2
(1 Кафедра неорганической и аналитической химии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева;2 Отдел изучения растений, Университет Манитобы
(Канада); 3 Институт прикладной математики имени М. В. Келдыша РАН)
Согласно осцилляционной гипотезе углеродный метаболизм при фотосинтезе реализуется в виде колебательного процесса. Колебания являются незатухающими и состоят из двух фаз — ассимиляции СО2 и фотодыхания. Первая соответствует карбокси-лазной фазе функционирования Рубиско, вторая — оксигеназной. Распределение изотопа 13С в углеводах тесно связано с фотосинтетическими осцилляциями, возникающими при фотосинтезе. Углеводы образуются в каждой из фаз. Мы утверждаем, что углеводы, образующиеся в карбоксилазной фазе, состоят из гексоз с относительно равномерным распределением 13С вдоль углеродного скелета молекул, тогда как гексозы в углеводах, синтезированных в оксигеназной фазе, обладают специфическим неравномерным изотопным рисунком. Упомянутая гипотеза хорошо объясняет особенности распределения изотопов углерода и изотопный состав углеводов С3- и С4-растений, а также изотопные различия общего углерода углеводов, обусловленные разной степенью исчерпывания фонда субстрата, используемого при фотодыхании.
Ключевые слова: изотопное фракционирование углерода, фотодыхание, Рубиско, углеводы, моделирование метаболизма.
В последние годы распределение 13С в углеводах привлекает внимание все большего числа исследователей [11, 28, 29, 34, 36, 61, 64]. Это связано с пониманием того, что исследования изотопного состава углеводов, являющихся первичными ассимилятами при фотосинтезе, открывают путь к выяснению природы изотопной гетерогенности остальных метаболитов и их связи с механизмами клеточных процессов. К тому же непосредственное участие самих углеводов во многих процессах (ассимиляции СО2 и фотодыхании, темновом дыхании и гликолизе) дает возможность использовать изотопные данные по углеводам для изучения этих процессов.
При исследовании распределения изотопов углерода в углеводах возникает ряд трудностей, связанных с отсутствием устойчивых закономерностей в распределении 13С между компонентами. Например, в одних растениях растворимые сахара и крахмал обогащены изотопом 13С по сравнению с другими углеводными компонентами, в других — обеднены. Изотопное распределение может заметно различаться в зависимости от того, из какого органа (лист, стебель, корень, семена) выделены углеводные компоненты [39], от условий обитания и вида растения [23]. Чтобы понять причину вариабельности изотопного состава углерода углеводных компонентов, необходимо выяснить, где и как возникают изотопные эффекты при синтезе углеводов и какие факторы влияют на их изотопный состав.
Из приведенной на рисунке 1 схемы, показывающей связь между различными углеводными фондами, видно, что ключевым звеном в цепочке всего углеводного обмена является синтез глюкозо-6-фосфата (Г6Ф), который происходит в цикле Кальвина при фотосинтезе. Через Г6Ф происходит синтез других гексоз и пентоз. а также связанных с ними сахаридов. Поэтому чтобы понять, чем определяется изотопный состав различных углеводов, в первую очередь необходимо выяснить, от чего зависит изотопный состав углерода Г6Ф. При такой постановке задачи не обойтись без привлечения модели изотопного фракционирования углерода при фотосинтезе.
Стационарная и ос-цилляционная модели,
используемые для описания изотопного фракционирования углерода при фотосинтезе.
Из литературы известны два альтернативных подхода к описанию изотопного фракционирования углерода при фотосинтезе: стационарная
модель, основанная на предположении, что при неизменных условиях все процессы фотосинтеза в клетке протекают одновременно и непрерывно [24, 31, 32, 47, 65, 66], и осцилляционная модель, допускающая периодический, дискретный характер протекания процессов, их определенную временную последовательность [5, 7,
8, 12, 44]. Дискретность процессов, согласно последней модели, является следствием периодического исчерпания фондов метаболитов, сменяющегося их заполнением.
Стационарная модель. Основное уравнение стационарной модели в обозначениях Фаркуара и коллег [24, 32] имеет вид:
А = а + ( Ь - а) рг /ра (1)
где А — величина изотопной дискриминации 13С при фотосинтезе, а — изотопный эффект при диффузии, Ь — изотопный эффект при карбоксилировании РиБФ. Выражение (1) связывает величину изотопной дискриминации углерода с отношением
Рис. 1. Принципиальная схема углеводного обмена в клетке
парциальных давлений СО2 внутри листа pi и в атмосфере ра. Из него легко видеть, что если диффузия контролирует скорость процесса, т.е. pi ^ 0, изотопная дискриминация приближается к величине а. Если скорость ассимиляции СО2 контролируется реакцией карбоксилирования РиБФ, т.е. р1 ^ ра, изотопная дискриминация приближается к величине Ь. При этом влияние внешних факторов (температуры, влагодоступности, солености поливных вод, концентрации СО2 в атмосфере и др.) на изотопный состав углерода растений передается в модели через отношение pi / ра. С учетом найденных экспериментально величин а = - 4,4%о, а Ь = -29%о [32] модель описывает диапазон природных вариаций величин А и ее зависимость от факторов внешней среды.
По мере использования уравнения (1) выявилось значительное число нарушений линейной корреляции, постулируемой моделью. Потребовалась усложненная форма связи изотопной дискриминации с учетом вкладов всех процессов, где возможна изотопная дискриминация. Они и обусловливают отклонение от линейности. Одна из форм имеет вид:
А = аЬ ( ра- р,), /ра+ а ( р*- р,), / ра + ( е+ а0 (р,- ре), / ра + (2)
+ Ь ^ рсг / ра - 1/( ^ / к + / Г ), ( )
где ра, р*., ра ирс — парциальные давления СО2 в атмосфере, у поверхности листа, в межклетниках до растворения в цитоплазме, у мест карбоксилирования соответственно; аЬ — дискриминация 13С при диффузии через пограничный слой, а — диффузия СО2 в воздухе, е* — фракционирование при растворении СО2 в цитоплазме. а1 — фракционирование при диффузии в жидкости, Ь — изотопная дискриминация 13С при ферментативном карбоксилировании РиБФ в С3-растениях; е и/— возможное фракционирование изотопов при темновом дыхании и фотодыхании соответственно; к — эффективность карбоксилирования и Г* — точка компенсации, определяемая в отсутствие темнового дыхания. Все коэффициенты изотопного фракционирования в перечисленных процессах определены опытным путем в модельных процессах и т уИто. Получены следующие значения: аЬ= 2.9%о [26, 31], 4.4%о, е* = 1.1%о 25° [66] а=0.7%о [48].
Изотопная дискриминация Ь при карбоксилировании РиБФ оказалась слабо зависимой от рН и при рН 9.0 равнялась 29%о, а при рН 7.0 — 30%о [54]. Что касается изотопного фракционирования при темновом дыхании е и фотодыхании /, ими, как правило, пренебрегают и учитывают лишь тогда, когда отклонения от упрощенной модели (1) становятся ощутимыми. Предполагая, что эти отклонения связаны с обсуждаемыми эффектами, из них рассчитывают указанные коэффициенты изотопного фракционирования. У одних исследователей оценки е подтвердили их малую величину [46, 67], другие [29] пришли к выводу, что е значительно и равно 6%о. Еще более спорными из-за сложности определения оказались оценки коэффициентов изотопного фракционирования при фотодыхании. Их определяли, исследуя изотопный состав СО2 воздуха вблизи точки компенсации. Руни [55] оценил величину/ = 7%о. Авторы работы [67] утверждали, что, если принять/ = 5%о, изменения А составят 0.8%о. Из косвенных оценок получили, что / для пшеницы составила величину 3.3%о , для фасоли — 0.5%о [35]. В работе Игамбердиева и других [41] авторы сопоставили изотопную дискриминацию у диких растений и фотодыхательных мутантов, у которых интенсивность фотодыхания была редуцирована методом генной инженерии. Из сопоставления сделана оценка эффекта фотодыхания. Последний оказался в диапазоне 10-13%о для картофеля, ячменя и арабидопсиса.
Из уравнения (2) видно, что включение в уравнение (1) новых членов, учитывающих вклад в изотопную дискриминацию других процессов, хотя и позволяет объяснить выявленную экспериментально нелинейность, но сама зависимость А от большого числа параметров делает ее сложной и запутанной. Ее трудно использовать для каких-либо прогнозных оценок.
За счет введения новых параметров уравнение (2) дает возможность скорректировать наблюдаемые отклонения от линейности, но связь изотопной дискриминации с факторами внешней среды становится менее отчетливой и при этом ряд фактов остается за рамками модели. Например, остается неясным, почему в некоторых опытах по газообмену при фотосинтезе наблюдается преимущественная фиксация изотопа 13С, а не 12С [3, 20], почему некоторые первичные ассимиляты в опытах с использованием обогащенной тяжелым изотопом СО2 оказываются обогащенными 13С относительно питающей СО2 [2]. За рамками модели оказалось и большое число фактов, свидетельствующих об изотопной утяжеленности метаболитов фотодыхания [17, 18, 51, 52]. Ряд выводов, следующих из модели, оказался в противоречии с фактами [42].
Кроме того, стационарная модель, удовлетворительно описывающая зависимость изотопного состава общего углерода биомассы растений и ее основных фракций от внешних факторов, в то же время не может объяснить внутримолекулярные изотопные различия в метаболитах. Единственная попытка [64] объяснить изотопную гетерогенность глюкозы (Г6Ф) на основе стационарной модели путем введения в нее дополнительных и в большинстве случаев мало обоснованных параметров представляется противоречивой и малообоснованной.
Стационарная модель оперирует усредненными потоками углеродных субстратов и балансовыми оценками, а описание изотопных распределений молекул требует учета кинетических изотопных эффектов конкретных ферментативных реакций, определяющих изотопный состав индивидуальных атомов. Поэтому попытки описать изотопные рисунки молекул на основе усредненных потоков заведомо обречены на неудачу.
Осцилляционная модель. Альтернативная осцилляционная модель [7, 44] утверждает, что фракционирование изотопов углерода при фотосинтезе происходит в двух сопряженных процессах — ассимиляции СО2 и фотодыхания, в которых эф-фектзадающими реакциями являются соответственно карбоксилирование РиБФ и глициндекарбоксилазная реакция. При ассимиляции СО2 происходит обогащение биомассы изотопом 12С относительно ассимилируемого СО2, при фотодыхании, напротив, — обеднение, т.е. эти процессы сопровождаются изотопными эффектами с противоположными знаками. Анализ изотопных эффектов при сопряжении ассимиляции и фотодыхания привел к заключению о существовании незатухающих фото-синтетических осцилляций [44], у которых одна из фаз ассимиляция СО2, другая — фотодыхание. Это означает, что оба процесса разделены во времени, последовательно переключаясь с одного на другой. Осцилляции возникают благодаря способности ключевого фермента фотосинтеза работать в двух ипостасях, как карбоксилаза и как оксигеназа, под воздействием периодически меняющегося в клетке отношения концентраций СО2/О2. В результате при ассимиляции СО2 поступает в клетки листа дискретными порциями [5].
В отличие от стационарной модели, осцилляционная модель, предполагая периодическое исчерпывание / заполнение фондов субстратов, утверждает, что при исчерпывании фондов субстрата в эффектзадающих реакциях клетки возникает изотопный эффект Релея. Последний в условиях специфичности ферментативных
взаимодействий определяет характерное внутри- и межмолекулярное распределение изотопов углерода в метаболитах, зависящее от временной организации (последовательности клеточных процессов). Ниже будет показано, что осцилляционная модель способна объяснить наблюдаемые внутримолекулярные изотопные распределения метаболитов, в т.ч. распределения в глюкозе и других углеводных молекулах.
Предполагаемые осцилляции недавно были экспериментально подтверждены измерением вариаций концентрации внутриклеточного СО2 в подустьичном пространстве листа в условиях низкой концентрации СО2 (вблизи точки компенсации [58]. Среди хаотических флуктуаций удалось выделить периодическую составляющую и построить аттрактор, указывающий на наличие колебаний, которые авторы связали с механизмом сопряжения фотоассимиляции и фотодыхания.
Другим подтверждением фотосинтетических осцилляций могут считаться данные Сатока и Катока [60]. Авторы наблюдали пик замедленной люминесценции на 5-й секунде после возбуждающего импульса в экспериментах с зелеными водорослями Вгуоръ,* тах1та, что свидетельствует об обратной связи фотодыхания и световых реакций фотосинтеза, разделенных во времени. Хотя авторы работали с изолированными хлоропластами, синтез фотодыхательных интермедиатов (фосфогликолата и гликолата) может приводить к появлению обратной связи через изменения рН и окисление гликолата, которое частично связано с хлоропластами и может непосредственно передавать электроны в их электрон-транспортную цепь, приводя к эффекту обратной связи [38]. Пик обратной связи заторможенной люминесценции тот же по длительности, что и пост-иллюминационный всплеск, явление, обусловленное окислением фотодыхательного глицина после выключения света.
Обоснованность такого объяснения подтверждается теоретическим моделированием эффекта обратной связи ассимиляции СО2 и фотодыхания на электронный транспорт фотосинтеза, возникающий после импульса возбуждения в виде двух пиков заторможенной люминесценции хлорофилла, разнесенных по времени на 1.6 с [19]. Авторы показали, что когда они убирали влияние фотодыхания, один из двух пиков люминесцентного спектра исчезал.
Дискретный характер ассимиляции СО2 приводит к дискретной динамике всех метаболических процессов. Это объясняет тот факт, почему изотопное фракционирование в ферментативных реакциях часто сопровождается изотопным эффектом Релея, связанного с исчерпыванием фондов. Комбинация обоих эффектов, отражающая временную организацию клеточных процессов, была показана ранее на примере гликолиза [6].
Обогащенность изотопом 12С ассимилированного углерода относительно питающего СО2, появляющаяся при карбоксилировании РиБФ, может быть описана как:
(^Сб„ 10-3 + 1) = (^СГО2 ■ 10-3 + 1) [1 - (1 - ], (3)
где ^3Сбиомассы и 313ССОг - изотопный состав ассимилированного углерода (биомассы) и исходного СО2 среды. ^ — степень исчерпывания поступившей порции, а = к12/ к13 — эффективный коэффициент изотопного фракционирования при карбо-ксилировнии РиБФ.
Для фотодыхания соответствующее выражение имеет аналогичный вид:
(^13Ссо2■ 10-3 + 1) = (^13СГ6ф ■ 10-3 + 1) [1 - (1 - *)1/а'], (4)
где 813СГ6Ф и 313ССО — изотопный состав ассимилированного углерода (Г6Ф) и СО2 фотодыхания. ^ — степень исчерпывания субстрата (Г6Ф), поступившего в фотоды-
хательную цепь, а’ = к’12/к’13 — эффективный коэффициент изотопного фракционирования при ферментативном декарбоксилировнии глицина.
Как упомянутые утверждения применить к описанию распределения в Г6Ф?
Внутримолекулярное изотопное распределение в Г6Ф в рамках осцилляционной модели
Прежде всего, в соответствии с осцилляционной моделью, проанализируем последовательность метаболических событий в углеродном метаболизме фотосинтеза и место в ней цикла Кальвина, где происходит синтез Г6Ф.
В карбоксилазную фазу функционирования Рубиско порция СО2 входит в клетку, и часть этой порции через цикл Кальвина превращается в углеводы. На входе в цикл весь ассимилированный углерод, в т.ч. углерод Г6Ф, при карбоксилировании РиБФ обогащается 12С относительно ассимилируемого СО2. Через Г6Ф углеводы, образующиеся в карбоксилазной фазе, также обогащаются 12С. Степень обогащения определяется величиной исчерпывания вошедшей в клетку порции СО2. Часть углеводов, предположительно в форме крахмала, запасается для обеспечения субстратами гликолитической цепи в темноте. Остальная часть Г6Ф остается в лабильном растворенном виде, и при переключении Рубиско на оксигеназную функцию углеводный поток через цикл Кальвина устремляется в фотодыхательную петлю, которая состоит из гликолатного цикла, сопряженного с циклом Кальвина. После прохождения гликолатного цикла поток углерода ресинтезирует в цикле Кальвина Г6Ф и образует углеводные фонды преимущественно лабильных сахаров.
В оксигеназную фазу функционирования фермента фракционирование изотопов происходит в глициндегидрогеназной реакции. Выделяющийся в ней СО2 обогащен 12С относительно углерода углеводов, образовавшихся в карбоксилазной фазе. В то же время оставшийся углеводный фонд накапливает 13С. Фотодыхательные метаболиты, которые образуются параллельно при вращении потока в фотодыхатель-ной петле, также накапливают «тяжелый» изотоп. И снова благодаря эффекту Релея степень обогащения метаболитов фотодыхания изотопом 13С от степени исчерпывания углеводного фонда.
Анализ изотопного распределения изотопов углерода в Г6Ф в карбоксилазную фазу Работа цикла Кальвина в карбоксилазную фазу функционирования Рубиско хорошо известна и описана во многих учебниках по фотосинтезу [30]. Пользуясь общепринятой схемой цикла (рис. 2), можно оценить изотопное распределение, возникающее в продукте цикла — Г6Ф. Обозначив атомы СО2 и РиБФ акцептора, входящих в цикл, как показано на рисунке 2, можно получить уравнения материального и изотопного баланса для каждого из атомов, входящих в цикл субстратов (см. приложение). Это позволяет рассчитать изотопное распределение углерода Г6Ф на каждом обороте цикла Кальвина в карбоксилазной фазе. Зависимость изотопного распределения от числа оборотов цикла дается простыми рекуррентными уравнениями, учитывающими смешение атомов в транскетолазных и трансальдолазных реакциях цикла и специфичность ферментативных взаимодействий [11]. В отличие от Черкеза и др. [64] , мы полагаем, что в цикле Кальвина нет изотопного фракционирования углерода, так как на это ничто не указывает. Что касается косвенных фактов, например, изотопных эффектов в ферментативных реакциях in vitro, на которые опираются упомянутые авторы, то они не могут быть аргументами ни «за», ни «против», поскольку реакции in vitro не могут воспроизвести условия сопряженности реакций, существующие в клетке, от которых зависит изотопный эффект. Различия могут возникать не только по величине, но и по знаку [40, 43, 44].
Результаты расчета изотопного распределения Г6Ф с использованием алгоритма, данного в Приложении, представлены в таблице 1.
Поскольку при кар-боксилировании РиБФ изотопный эффект возникает на входе в цикл Кальвина, изотопный состав каждого фиксированного атома углерода претерпевает изотопные смещения, равные величине изотопной дискриминации. Имея ввиду отсутствие изотопного фракционирования в цикле и эффективное перемешивание атомов в транскетолазных и транс-альдолазных реакциях цикла (своеобразном изотопном миксире), следует предположить, что все метаболиты цикла, включая Г6Ф, имеют равномерное изотопное распределение, несмотря на исходную изотопную неравномерность
Рис. 2. Схема функционирования цикла Кальвина в карбо-ксилазной фазе фотосинтетических колебаний. Цифры перед изображением молекул показывают количество молекул, участвующих или образующихся в превращениях цикла. Цифры над изображением атомов показывают номера углеродных атомов в ФГК. По атомам ФГК прослеживаются их перемещения при каждом обороте
Т а б л и ц а 1
Изотопный состав углеродных атомов Г6Ф и РиБФ, образующихся в цикле Кальвина на п-м обороте в карбоксилазную фазу функционирования РБФК/О
Число оборотов п 1 5 10 15 20
N атома Исх. РиБР С6Р РиБР С6Р РиБР С6Р РиБР С6Р РиБР С6Р РиБР
1 -25.0 -25.0 -25.0 -24.0 -22.9 -22.9 -21.2 -22.1 -20.5 -21.7 -20.2
2 -25.0 -25.0 -25.0 -24.0 -22.9 -22.9 -21.2 -22.1 -20.5 -21.7 -20.2
3 -25.0 -22.5 -22.5 -21.0 -20.1 -20.3 -20.0 -20.3 -20.0 -20.3 -20.0
4 -25.0 -22.5 -24.2 -21.0 -22.0 -20.3 -20.8 -20.3 -20.3 -20.3 -20.1
5 -25.0 -25.0 -24.2 -24.0 -22.0 -22.9 -20.8 -22.1 -20.3 -21.7 -20.1
6 -25.0 -24.0 -22.9 -22.1 -21.7
П р и м е ч а н и е. Принято, что изотопная дискриминация Д|3С относительно СО2 среды (5|3С = 0%о) равна -20%. Изотопный состав углеродных атомов выражен в промилле относительно изотопного состава углерода ассимилируемого СО2 .
РиБФ [4] и на различия исходного углерода СО2 и его акцептора РиБФ. Из таблицы 1 видно, что уже после 20-го оборота цикла достигается практически равномерное распределение изотопов, даже если принять встречаемые в растениях максимально возможные различия в изотопном составе первичных ассимилятов и продуктов вторичного метаболизма (в примере, приведенном в таблице, изотопный состав фиксированного углерода принята за 20%о, изотопный состав РиБФ — за 25%о соответственно), определяющих различия исходных субстратов. С ростом числа оборотов цикла (что эквивалентно количеству молекул СО2, приходящихся на одну молекулу РиБФ, поступающих в цикл) изотопный состав каждого атома углерода Г6Ф стремится к изотопному составу питающего СО2 (в данном примере к 20 %о). Следует заметить, что окончательное распределение Г6Ф практически не зависит от исходного распределения в РиБФ. Именно поэтому в расчетах мы считали его равномерным,
что упрощало анализ изменений изотопного состава атомов при оборотах цикла.
Анализ изотопного распределения углерода Г6Ф оксигеназной фазы. Работа цикла Кальвина в оксигеназ-ную фазу обеспечивается углеродом, источником которого является Г6Ф, синтезированный в предшествующую карбоксилазную фазу (рис. 3). Изотопное распределение глюкозы (Г6Ф), синтезированной в оксигеназную фазу, оценивалось аналогично тому, как это делалось в предыдущем случае. С учетом специфичности взаимодействий и перемешивания углеродных атомов в цикле, а также изотопного фракционирования
Рис. 3. Схема функционирования цикла Кальвина в оксигеназной фазе в глициндегидро-фотосинтетических колебаний. Обозначения имеют тот же смысл, что „ р
на рисунке 1. Пунктирной линией показан узел изотопного фракциони- геназной реакции рования в глициндекарбоксилазной реакции составлялся мате-
риальный и изотопный баланс по каждому атому участвующих в цикле субстратов. Зависимость изотопного состава атомов от числа оборотов цикла определялась с помощью соответствующих реккурентных формул (см. приложение). Результаты расчета изотопного распределения Г6Ф приведены в таблице 2.
Т а б л и ц а 2
Результаты расчёта распределения изотопов углерода Г6Ф, остающегося в фотодыхательном фонде по мере его исчерпания за п оборотов цикла Кальвина
N атома И Г о 61 I Число оборотов п
10 20 30 40 50 60 70 80 90
1 -20.0 -20.3 -20.7 -21.1 -21.4 -21.9 -22.4 -23.0 -23.7 -24.6
2 -20.0 -19.7 -19.4 -19.1 -18.7 -18.3 -17.8 -17.2 -16.4 -15.2
3 -20.0 -19.5 -18.8 -18.1 -17.3 -16.4 -15.2 -13.8 -11.9 -8.8
4 -20.0 -19.5 -18.8 -18.1 -17.3 -16.4 -15.2 -13.8 -11.9 -8.8
5 -20.0 -19.7 -19.4 -19.1 -18.7 -18.3 -17.8 -17.2 -16.4 -15.2
6 -20.0 -20.0 -20.7 -21.1 -21.4 -21.9 -22.4 -23.0 -23.0 -24.6
П р и м е ч а н и е. Расчёт проводили с учётом величины кинетического изотопного эффекта декар-боксилирования глицина, равной Y = 12к/'ък = 1,020. Принято, что в фонд фотодыхательной глюкозы после карбоксилазной фазы поступает 100 молекул. Изотопной состав углеродных атомов Г6Ф, поступающего в цикл после карбоксилазной фазы, принят равным -20%. При каждых 10 оборотах цикла степень исчерпывания фонда составляет 10%.
Главное отличие глюкозы, синтезированной в оксигеназную фазу, от глюкозы, синтезированной в карбоксилазную фазу, в том, что распределение последней неравномерно и характеризуется сильным обогащением тяжелым изотопом по положениям С-3 и С-4 и соответствующим облегчением (обогащением 12С) от середины к концам молекулы. Легкий изотоп как бы «вымывается» из центра к периферии молекулы. Причем с ростом числа оборотов цикла внутримолекулярная изотопная неоднородность увеличивается при обогащении общего углерода молекулы изотопом 13С.
Различия изотопных распределений в глюкозе, синтезируемой в разных фазах, легко объясняются тем, что в карбоксилазную фазу исходные изотопные различия субстратов цикла на каждом новом обороте размываются вновь поступающим СО2, а в оксигеназную фазу изотопный эффект, порождающий изотопные различия, на каждом обороте воспроизводится.
Распределение 13С в глюкозе крахмала запасающих органов растений
Экспериментально исследовалось изотопное распределение глюкозы крахмала запасающих органов ряда растений. Для интерпретации изотопного распределения в глюкозе достаточно знать изотопное распределение Г6Ф, которое ею полностью наследуется (см. рис.1). Данные Эйблсона и Хоуринга [21] позволяют предполагать, что процессы полимеризации при образовании крахмала и при его деполимеризации до глюкозы не сопровождаются заметными изотопными эффектами. Поскольку атомы углерода глюкозы не обменоспособны, считается, что распределение 13С в глюкозе крахмала отражает изотопное распределение Г6Ф, использованного на его синтез.
Экспериментально изученное независимыми исследователями изотопное распределение глюкозы крахмала запасающих органов у ряда растений представлено в таблице 3, из которой видно, что у всех изученных растений внутримолекулярное
Распределение изотопов углерода в глюкозе крахмала запасающих органов ряда растений [14, 33, 57]
Объект 513С глюкозы Д13С = 513С; - 513СГлюкозы, i — номер атома
OCH0) - HC(2)OH - OHC(3)H - HC(4)OH - HC(5)OH - C(6)H2OH
C1 C2 C3 С4 C5 C6
Beta vulgaris, клубень -25.2 -1.6 -0.4 +2.1 +6.3 -1.7 -5.1
Zea mays, семена -10.8 -1.7 -0.1 + 1.1 +3.6 -0.2 -3.6
Zea mays, семена -12.5 -3.1 + 1.9 -1.9
Triticum aestivum, семена -23.1 -7.1 +3.5* -7.1
Solanum tuberosum, клубень -24.9 -9.1 +4.5* -9.1
Oryza sativa, семена -26.1 -6.9 +3.5* -6.9
Pisum sativum, семена -24.9 -4.1 +2.1* -4.1
П р и м е ч а н и е. Изотопные сдвиги углеродных атомов Д13С (%о) приведены относительно общего углерода глюкозы. Величины 513С глюкозы даны относительно стандарта PDB. * Bеличины 513С атомов С-3 и С-4 рассчитывались по данным [33] из предположения, что изотопный состав углерода остальных атомов равен изотопному составу атомов С-1.
распределение изотопов углерода в глюкозе (Г6Ф) одинаково. Главная его особенность состоит в том, что углеродные атомы глюкозы в положении С-3 и С-4 обогащены изотопом 13С относительно общего углерода молекулы и концевых атомов.
Практически такие же результаты были получены в экспериментах по ферментации глюкозы и сахарозы, конечными продуктами которой являются спирт и СО2. Из рисунка 4 можно видеть, что спирт наследует атомы глюкозы из позиций С-1, С-6, С-2 и С-5, а СО2 наследует атомы глюкозы С-3 и С-4. Поэтому можно проанализировать изотопные различия атомов в соответствующих положениях глюкозы (табл. 4). Во всех случаях СО2, выделяемый при ферментации, оказался обогащенным 13С по сравнению с углеродом этанола, т.е. опыт подтвердил полученный ранее результат.
Установленное распределение в глюкозе крахмала очень напоминает рисунок распределения, полученный для Г6Ф оксигеназной фазы (см. табл. 3), за исключением некоторых деталей. Обогащенность атомов углерода в положениях С-3 и С-4 асимметрична. В положении С-4 углерод обогащен тяжелым изотопом в большей степени, чем в положении С-3. Небольшая асимметричность прослеживается и для пары С-2 и С-5. Атом С-2 в большей степени обогащен 13С.
Мы полагаем, что причиной этих различий является межмолекулярный изотопный обмен, который происходит в обратимых реакциях кето-енольной изомеризации триоз (рис. 5). Причем это не обмен между атомами Г6Ф и триозами, как
Рис. 4. Схема, иллюстрирующая наследование атомов в процессе ферментации глюкозы
Изотопные различия углерода сахаридов и продуктов ферментации по данным разных авторов
Объект Определяемые изотопные различия Значения Л Ссылка
Сахарная свекла Л (глюкоза - этанол) Л (глюкоза - С02) 2.0 -4.6 Weber et al., 1997 [69]
Виноградная плесень Л (глюкоза - этанол) Л (сахароза - С02) 1.6 -7.4 Scrimgeour et al.,1988 [ 63] Rossmann et al., 1996 [56]
Картофель Л (глюкоза - этанол) 1.6 Zhang et al., 1996 [70]
Картофель Л (крахмал - С02) 1.7 Rauschenbach et al.,1979
Кукуруза Л (крахмал - С02) 0.3 [50]
предполагалось в работах [36, 64], а меж-молекулярный изотопный обмен между углеродными атомами молекул триоз соответственно по положениям С-1, С-2 и С-3 при взаимопревращении молекул ФГА и ДОАФ. При этом углеродный скелет молекул триоз сохраняется (см. рис. 5). Изотопный обмен подтверждается сопоставлением наблюдаемых изотопных различий с теоретическими равновесными изотопными эффектами, оцененными через Р-факторы [11]. Так как изотопный обмен далек от равновесия, теоретические оценки позволяют лишь обнаружить тренд в изменении изотопного состава атомов и он соответствует наблюдаемым изотопным смещениям рассматриваемых атомов от одинаковых исходных значений, унаследованных от ФГК.
Что касается изотопных различий пары атомов С-1 и С-6, теоретически они должны быть одинаковыми, поскольку, как и рассмотренные выше пары, наследуются от ФГК, и не видно причин, которые могли бы привести к изотопным различиям.
В эксперименте же были получены противоречивые результаты. В этих условиях прежде чем делать окончательный вывод, разумнее дождаться новой информации. К сказанному можно добавить, что анализ распределения радиоактивной метки в глюкозе, сделанный для различных растений (табака, подсолнуха) и водоросли (хлорел-
Рис. 5. Межмолекулярный изотопный обмен между триозами в цикле Кальвина. Светлые и темные точки и звездочки над атомами показывают пары атомов ФГК и ДОАФ, обменивающихся между собой. При этом молекулы не разрушаются. Показаны также позиции Г6Ф, куда попадают эти атомы при последующем синтезе. Колонка справа от Г6Ф показывает экспериментальные значения изотопных сдвигов атмов относительно общего углерода молекулы
лы), в опытах по газообмену обнаружил идентичное распределение 14С между положениями С-1 и С-6 и очень тесную корреляцию между распределением 14С и природным распределением 13С по остальным положениям (г2 = 0,81 - 0,87) [39].
Косвенные доказательства, подтверждающие, что изотопная гетерогенность Г6Ф связана с фотодыханием, позволяют сопоставить изотопный состав углеродных атомов в глюкозе крахмала С3- и С4-растений (табл. 5). Известно, что в С4, в отличие от С3-растений, в силу анатомических особенностей фотодыхание редуцировано [30]. Следовательно, углеводный фонд у них должен быть образован преимущественно из Г6Ф карбоксилазной фазы, и внутримолекулярное изотопная неоднородность в глюкозе должна быть значительно менее выражена.
Т а б л и ц а 5
Сравнение внутримолекулярных изотопных распределений углерода в глюкозе С3- и С4-растений. Данные получены на основе анализа изотопного состава продуктов деструкции глюкозы при ферментации [39]
Позиция Л(Сз) Л(С4) Л(Сз - С4)
С-1 -1.3 +0.9 -2.2
С-2 -0.9 -0.1 -0.8
С-3 + 1.9 -0.7 +2.6
С-4 +6.3 +5.2 + 1.1
С-5 -1.1 -0.1 -1.0
С-6 -4.9 -4.8 -0.1
П р и м е ч а н и е. Величины, характеризующие изотопный состав по каждому из положений углеродных атомов, рассчитывались как разница между изотопным составом углерода в данном положении и углеродом всей глюкозы Л; = 513С; - Собщ.
Действительно, можно видеть (3-я колонка таблицы 5), что различия в изотопном составе каждого из 6 атомов углерода глюкозы у С3 и С4-растений свидетельствуют о том, что у первых внутримолекулярная изотопная неоднородность больше, что соответствует более интенсивному фотодыханию.
Много фактов указывают на то, что запасающие органы растений формируются на поздних стадиях онтогенеза. На этой стадии биохимические сдвиги метаболизма указывают на усиление фотодыхания. Это проявляется в усилении вклада гликолатного пути, накоплении окисленных продуктов [1], существенном усилении оксидазной активности в старых листьях по сравнению с молодыми и в других признаках [16]. Было также обнаружено, что ингибиторы фотодыхания тормозят старение [53].
Указанные метаболические сдвиги соответствуют наблюдаемому накоплению 13С в биомассе растения по мере его старения. В старых листьях отмечается обогащение биомассы изотопом 13С по сравнению с молодыми [15, 45]. Сильное снижение изотопной дискриминации 13С было обнаружено у пшеницы на стадии созревания [15]. Аналогичные изменения были обнаружены в листьях фасоли [68] и хлопка [59]. Все эти факты позволяют утверждать, что наблюдаемая изотопная гетерогенность углеводных единиц, гексоз, в крахмале запасающих органов, равно как их «тяжелый» изотопный состав, связана с Г6Ф, производимым в оксигеназной фазе функционирования Рубиско.
Другие факты по изучению изотопного состава углерода сахаридов и их интерпретация в рамках осцилляционной модели
Приведенные данные демонстрируют существование в клетке двух изотопно-различающихся потоков углеродных субстратов, образующихся в карбоксилазную и оксигеназную фазу работы Рубиско и являющихся результатом фотосинтетиче-ских осцилляций. Логическим выводом из сказанного является утверждение о существовании в клетке двух изотпноразличающихся фондов углеводов, питающих упомянутые потоки [44]. Вопрос заключается в том, как эти два потока, проходя через цикл Кальвина, через общие участки метаболического пути не перемешиваются? Ответ может быть только один. Фонды работают разновременно. В карбо-ксилазную фазу Г6Ф, образующийся в цикле Кальвина, сразу же утилизируется (в пределах исчерпывания поступившей порции СО2) на синтез резервного углеводного фонда для питания гликолитической цепи в темновой период и на синтез лигнинов. Они хранятся в полимеризованном виде и не могут участвовать в реакциях оксигеназной фазы.
В темновой период «легкий» фонд, образованный в карбоксилазную фазу, питает гликолитическую цепь и сопряженный синтез жирных кислот и аминокислот, а также синтез лигнинов. В этом причина их относительно «легкого» изотопного состава. Он также обеспечивает субстратами темновое дыхание через декарбоксилиро-вание пирувата и функционирование цикла Кребса [4].
В оксигеназную фазу лабильный фонд Г6Ф питает фотодыхательную петлю и «утяжеляется» с каждым оборотом цикла. Фонд используется для образования фондов преимущественно лабильных углеводов (сахарозы, фруктанов), а также фотодыхательных субстратов, таких как пролин, глицин, серин, оксала-ты и т.д. Синтез органических кислот, который происходит в темновой период, также использует углеводный фонд, образованный в оксигеназную фазу. Изотопный состав образующихся метаболитов определяется степенью исчерпывания фонда, связанного с фотодыхательной петлей. Причем метаболиты, образующиеся при разных степенях исчерпывания, будут различными по изотопному составу. Следует заметить, что у некоторых видов растений могут существовать альтернативные пути биосинтеза перечисленных метаболитов, использующих углерод, проходящий через гликолитическую цепь, и тогда их изотопный состав будет иным.
На рисунке 6 представлены примеры сложных метаболитов, у которых синтез одной из частей молекулы связан с «легким» потоком субстратов, другой — с «тяжелым». Это растительные гликозинолаты, изученные Шмидтом и др. [62], а именно амигдалин из семян горького миндаля, глюкосинальбин и холиновый эфир синапо-вой кислоты из листьев белой горчицы.
Две первые молекулы имеют две различные по изотопному составу части. Одна из них агликоновая (неуглеводная) синтезирована через гликолитическую цепь и связана с «легким» углеводным фондом, образованным в карбоксилазной фазе. Другая часть углеводного происхождения, предположительно связанная с фондом, образованным в оксигеназную фазу, и потому обогащена изотопом 13С относительно первой части. Третий глюкозинолат (см. рис. 6) не имеет углеводной части, но имеет фрагмент, наследующий скелет серина, который тоже образуется в оксигеназной фазе и тоже обогащен 13С.
Рис. 6. Изотопное распределение углерода в некоторых растительных глюкозилонатах. Цифры рядом с молекулами показывают величины 5 13С соответствующих фрагментов молекул
Далее показано, как изотопные данные по общему углероду молекул соответствуют осцилляционной гипотезе. Экспериментальные данные, представленные в таблицах 6-9, приводят к следующим выводам:
1. Среди биохимических фракций биомассы углеводная фракция самая «тяжелая»;
2. Индивидуальные углеводы различаются по изотопному составу углерода;
3. Углеводные фонды из разных органов растений имеют разный изотопный состав углерода;
4. В зависимости от времени отбора проб изотопный состав одних и тех же фракций углеводов различается.
Т а б л и ц а 6
Вариации изотопного состава углерода углеводных и структурных компонентов тропического растения С3-САМ типа Clusia minor в зависимости от факторов внешней среды [23]
Фракции и компоненты биомассы Влажный сезон Сухой сезон
экспонированный лист затененный лист экспонированный лист затененный лист
Структурные компоненты Липиды, пигменты Аминокислоты Растворимые сахара Глюканы Крахмал Органические кислоты -27.2 - -26.6 -28.2 - -28.7 -30.2 - -31.7 -21.2 - -23.6 -22.3 - -22.6 -22.3 - -22.1 -20.6 - -22.3 -31.2 - -31.4 -32.2 - -33.3 -32.0 - -32.6 -29.2 - -30.5 -27.6 - -27.5 -27.2 - -27.8 -27.6 - -27.7 -27.1 - -27.5 -27.1 - -27.7 -31.2 - -32.3 -17.9 - -20.4 -23.6 - -26.8 -23.1 - -23.6 -17.6 - -21.1 -31.0 - -31.8 -30.8 -32.4 - -32.7 -21.4 - -24.3 -23.6 - -26.8 -26.6 - -27.9 -21.8 - -24.5
П р и м е ч а н и е. Величины б13С приведены в промилле относительно стандарта PDB.
Вариации изотопного состава углерода некоторых углеводных компонентов из листа и корня сахарной свеклы (С3-растение) в течение светового периода [37]
Орган Время отбора пробы 10.00 14.00 17.00
Лист Крахмал - 28.9 - 28.2 - 27.5
Сахара - 24.8 - 24.3 - 23.9
Целлюлоза - 26.8 - 27.4 - 26.8
Корень Сахара - 26.1 - 26.4 - 25.7
Целлюлоза - 28.4 - 27.5 - 27.1
П р и м е ч а н и е. Величины б13С даны в % относительно стандарта PDB.
Т а б л и ц а 8
Сопоставление изотопного состава углерода некоторых компонентов углеводной фракции с изотопным составом общего углерода белковой и липидной фракций для листа САМ растения Bryophyllum daigramontiana Berger [27]
Фракции Утро Вечер
Углеводы Целлюлоза Крахмал -16.8- -17.7 -16.2- -16.8
-13.3- -13.8 -12.5- -13.4
Белки, общий углерод Липиды, общий углерод -22.1- -22.6 -25.8 - -27.3 -22.6- -22.7 -24.6 --27.3
Т а б л и ц а 9
Изотопный состав биохимических фракций биомассы морской водоросли СМ/огвНа stigmatophora при различной солености воды [13]
Index Концентрация NaCI в среде, mM
0 425 595
б13С липидов, %о - 66.0 - 65.0 - 63.8
б13С белков, % - 42.1 - 49.0 - 47.3
б13С пролина, % - 29.0 — - 30.5
б13С растворимых сахаров, % - 30.0 — - 31.5
б13С питающей CO2 = -21%.
Согласно рассмотренной гипотезе обогащенность углеводов изотопом 13С относительно других фракций объясняется тем, что значительная ее часть образуется за счет оксигеназной функции Рубиско.
Различия в изотопном составе индивидуальных углеводных фондов объясняются тем, что они накапливаются в оксигеназной фазе при разных степенях исчерпывания фотодыхательного фонда. Ранее такой же механизм появления изотопных различий был доказан для метаболитов, синтезируемых при гликолизе [10].
Рассмотренный выше механизм ответственен за изотопные различия одноименных метаболитов, синтезируемых разными органами растений. Мы полагаем, что это связано с тем, что их синтез использует Г6Ф при других степенях исчерпывания фотодыхательного фонда, т.е. синтез одного и того же метаболита происходит в различных органах при разных условиях, что и приводит к сдвигу в последователь-
ности синтеза метаболитов и к соотвествующим изменениям в изотопном составе углерода.
Значительная зависимость изотопного состава углерода углеводов от времени отбора пробы — результат разного вклада в метаболизм (биомассу) Г6Ф, синтезируемого в карбоксилазную фазу и в оксигеназную фазу, и в синтез соответствующих углеводных фондов, т.е. это результат биохимической адаптации растения к суточным изменениям, в т.ч. к изменению освещенности [22, 28].
Аналогичным образом реагирует изотопный состав углеводов и биомассы на влияние других факторов среды [9].
Несмотря на вариабельность изотопного состава углерода углеводов, определяемую внешними факторами, определенные закономерности в изотопном распределении углеводов можно проследить. Например, структурные компоненты (целлюло-
за, гемицеллюлоза), как правило, обогащены 12С и близки по изотопному составу. Это означает, что они образуются практически одновременно (при одинаковых степенях исчерпывания фотодыхательного фонда). В то же время лабильные сахара обычно обогащены 13С, а крахмал и глюканы имеют промежуточный изотопный состав. Иногда этот порядок нарушается в результате действия каких-либо факторов среды. Во влажный сезон в затененных листьях растворимые сахара резко обогащаются 12С, такие же значения изотопного состава характерны для крахмала в сухой сезон в затененных листьях [23]. Это означает, что в ходе эволюции и в результате адаптации к текущим условиям среды изменения в изотопном составе углеводов в распределении 13С между ними отражают изменения во временной последовательности синтеза метаболитов, вплоть до включения в синтез альтернативных путей.
Изотопный состав углерода углеводов часто сравнивают с изотопным составом лигнинов, так как в их синтезе много общего (рис. 7). Синтез лигнинов сопряжен с работой цикла Кальвина, в котором образуются нужные для синтеза эритрозы. Эри-трозы взаимодействуют с двумя молекулами пирувата и образуют фенилпропаноид-ные структуры (С6 - С3). Эти структуры претерпевают полимеризацию и в конечном счете превращаются в лигнин. Было обнаружено, что лигнины, независимо от типа растения (С3 или С4), всегда обогащены 12С относительно целлюлозы (табл. 10).
Причину разного изотопного состава углерода углеводов (целлюлозы) и лигни-нов следует искать в различии механизмов изотопного фракционирования на путях их синтеза. «Легкий» изотопный состав углерода лигнинов, который близок к изотопному составу липидов, позволяет предположить, что эритрозы образуются в кар-боксилазной фазе работы цикла Кальвина. Это подтверждается тем фактом, что обе молекулы фосфоенолпирувата (ФЕП), которые далее взаимодействуют с эритрозой, также принадлежат потоку, поднимающемуся по гликолитической цепи при глюко-неогенезе [4]. Источником для последнего являются углеводы, образующиеся в кар-боксилазной фазе. Таким образом, стабильную разницу в изотопном составе между целлюлозой и лигнинами (см. табл. 10) можно объяснить тем, что первые связаны с
Т а б л и ц а 10
Сопоставление изотопного состава углерода целлюлозы и лигнина (Д = 513Сцеллюл0за - 513СЛИГНИН) для различных тканей С3 и С4 растений [39]
Сопоставляемые объекты С3 % С4 % Тип ткани
Целлюлоза - лигнин 3.5 - Древесина
Целлюлоза - лигнин 4.1 6.2 Различные ткани
Целлюлоза - лигнин 4.6 5.1 Листья
Целлюлоза - лигнин 2.5 4.6 Корень
углеродом субстратов, образуемых в карбоксилаз-ной фазе, а вторые тем, что их синтез происходит из субстратов оксигеназ-ной фазы.
Из таблицы 10 можно также заметить, что различия в изотопном составе целлюлозы и лигнинов у С3-растений больше, чем у С4-растений. На наш взгляд, причина этих различий кроется вне изотопного фракционирования в углеводном метаболизме и связана с изотопным фракционированием углерода, происходящим в гликоли-тической цепи в темноте.
Ключевой эффектзадаю-щей реакцией при этом является ферментативное декарбоксилирование пи-рувата. Изотопный состав
углерода ФЕП, используемого на синтез лигнина, определяется изотопным составом пирувата. Последний, как и изотопный состав глицина при фотодыхании в гли-колатной цепи, связан с величиной исчерпывания фонда субстрата, другими словами, определяется эффектом Релея. В случаях, когда ФЕП используется на синтез лигнина, происходит исчерпывание пируватного фонда. Более «тяжелый» изотопный состав лигни-нов у С3-растений можно трактовать как результат более интенсивного синтеза лигнинов С3-растениями (или большей концентрацией в них лигнинов), вследствие чего отмечается большее исчерпывание фонда и более «тяжелый» изотопный состав лигнинов у С3-растений.
Сказанное косвенно подтверждается корреляцией (Д=
= 513СсеШо8е - 513С116П1П) с содержанием лигнинов на рисунке 8. Корреляция изучалась для древесных растений и травянистых
Рис. 7. Шикиматный путь синтеза пировиноградной кислоты, углеродный скелет которой используется для биосинтеза лигнина в растениях. Цифры над атомами показывают величину изотопных сдвигов атомов относительно среднего изотопного состава. Звездочки и кружочки показывают места, куда попадают атомы, унаследованные от исходных субстратов
растений С3- и
С4-типа
[39]. Чем
10 20 30
Концентрация лигнинов, %
Рис. 8. Корреляция между концентрацией лигнина и изотопным сдвигом лигнина относительно целлюлозы [39]. Пустые кружочки — деревья; залитые кружочки — С4-травы; пустые квадратики — С3-травы. Подробности в тексте
больше концентрация лигнинов в указанном ряду (больше степень исчерпывания пируватного фонда), тем «тяжелее» лигнины и меньше разница между изотопным составом целлюлозы и лигнинов.
В качестве другого косвенного аргумента можно привести аналогичную корреляцию между разницей в изотопном составом липидов углерода и общего углерода растения и содержанием в нем липидов, обнаруженную Парком и Эпстайном еще в 1961 г. [49] и позднее подтвержденную в работе [25]. Синтез липидов также связан с потоком, проходящим через гликолитическую цепь в темновой период, а их изотопный состав определяется изотопным эффектом декарбоксилирования пирувата и зависит от степени исчерпывания пи-руватного фонда [4]. На рисунке 9 можно видеть практически аналогичный характер корреляции: одна для деревьев, другая — для недревесной растительности. Причина подобия очевидна. Одинаковая причина объясняет одинаковый характер корреляции.
Тем не менее, приведенное объяснение мы рассматриваем как предварительное, пока еще экспериментальных данных недостаточно.
20 АО Концентрация липидов, %
Рис. 9. Корреляция между концентрацией липидов и изотопным сдвигом липидов относительно углерода общей биомассы листвы для древесной и недревесной растительности [39]. Пустые кружочки — деревья; залитые кружочки — С4-травы; залитые квадратики — С3-травы; треугольники кверху — папоротники; треугольники книзу — кустарники
Заключение
Распределение 13С в углеводах тесно связано с механизмом фотосинтеза. В соответствии с осцилляционной моделью углеродный метаболизм фотосинтеза предствляет собой незатухающие колебания, состоящие из двух фаз - ассимляции СО2 и фотодыхания. Руби-ско регулирует эти осцилляции, переключая их с ассимиляции на фотодыхание и обратно в зависимости от периодически меняющегося в клетке отношения концентраций СО2/О2. В разные фазы колебаний в клетке возникают два различающихся по изотопному составу углеводных фонда. Изотопный состав и распределение изотопов углерода в Г6Ф этих фондов определяются двумя разными по знаку изотопными эффектами. Один из них, изотопный эффект карбоксилирования РиБФ, появляется в фазе ассимиляции СО2 (в карбок-силазной фазе функционирования Рубиско), другой изотопный эффект в глициндекарбок-силазной реакции появляется в фазе фотодыхания (в оксигеназной фазе функционирования Рубиско). Оба эффекта имеют кинетическую природу и сопряжены с исчерпыванием фондов субстратов.
Глюкозо-6-фосфат (Г6Ф) - главная единица углеводного метаболизма в обеих фазах — играет определяющую роль в формировании изотопного состава углерода индивидуальных углеводов и их изотопных распределений. В карбоксилазной фазе главный продукт функционирования цикла Кальвина Г6Ф благодаря изотопному эффекту РиБФ карбоксилирования и рандомизации атомов в транскетолазных и трансальдолазных реакциях приобретает «легкий» изотопный состав (обогащенность изотопом 12С) и близкое к равномерному распределение изотопов углерода. Степень обогащенности 12С зависит от степени использования порции
СО2, поступившей при ассимиляции в клетку. Ассимилированный углерод утилизируется для создания углеводного фонда, чтобы в темновой период питать гликолитическую цепь и сопряженный синтез большинства липидов, протеинов, лигнинов и некоторых других метаболитов. Все продукты обогащены 12С относительно питающей СО2. Параллельно с вышеназванным создается лабильный фонд Г6Ф для питания фотодыхательной петли, состоящей из гликолатного цикла, сопряженного с циклом Кальвина.
В оксигеназной фазе углеродный поток в цикле Кальвина меняет свое направление на противоположное. Субстраты лабильного фонда, проходя через фотодыхательную петлю, подвергаются воздействию изотопного эффекта глициндекарбоксилазной реакции и возвращаются в фонд с другим изотопным составом. Г6Ф, ресинтезированный в фотоды-хательной петле, имеет «тяжелый» изотопный состав (обогащенный 13С) и неравномерное распределение изотопов углерода. Степень обогащенности углеводов 13С и их изотопной гетерогенности определяется числом оборотов потока субстратов в фотодыхательной петле. В ходе фотодыхания фонд Г6Ф используется для синтеза различных углеводных фондов, органических кислот, разнообразных фотодыхательных продуктов (гликолата, оксалатов, пролина, серина, глицина). Таким образом, мы утверждаем важную биосинтетическую роль оксигеназной фазы.
Осцилляционная модель объясняет существование в клетке двух изотопноразличаю-щихся потоков углеродных субстратов, создаваемых двумя различными по изотопному составу фондами углеводов, образованных в карбоксилазной и оксигеназной фазах. Это может быть полезно при поиске метаболических связей между фондами разных метаболитов. Модель объясняет внутримолекулярный изотопный рисунок глюкозы крахмала запасающих органов и различия в изотопных распределениях глюкозы С3- и С4-растений. Изотопная гетерогенность ряда сложных растительных глюкозилонатов объясняется участием в синтезе их фрагментов субстратов из двух разных по изотопному составу потоков, связанных с соответствующими углеводными фондами, образованными в разных фазах осцилляций.
Показано, что субстраты для синтеза лигнинов появляются в карбоксилазной фазе фотосинтетических осцилляций, но их изотопный состав определяется еще и изотопным эффектом декарбоксилирования пирувата. Модель объясняет одинаковую природу корреляций, одна из которых связывает разницу между изотопным составом углерода целлюлозы и лигнинов (Д= 513Ссе1Шо(.е - 513Сивпп) с содержанием лигнинов в биомассе, другая - изотопный сдвиг между изотопным составом липидов и биомассы (Д= 513С6иомасса - 513Слипиды) с содержанием липидов в биомассе. Обе корреляции обусловлены зависимостью изотопного состава и лигнинов, и липидов от одних и тех же факторов, изотопного эффекта в реакции декарбокси-лирования пирувата, степени исчерпывания пируватного фонда, а также от балансовых соотношений фракций в биомассе.
Библиографический список
1. Абдурахманова З.Н., Алиев А.К., Абдуллаев А. 1990. Фотосинтетический метаболизм углерода и превращение [1-14С] гликолевой кислоты в онтогенезе в листе хлопка. Физиология растений 37: 513-518.
2. Вознесенский В.Л., Глаголева Т.А., ЗубковаЕ.А., Мамушина Н.С., ФилиповаЛ.А., Чу-лановская М.В. 1982. Метаболизм 14С при длительном выращивании хлореллы в присутствии 14СО2. Физиология растений 29: 564-571.
3. Иванов М.В., Зякун А.М., Гоготова Г.И., Бондарь В.А. 1978. Разделение изотопов углерода фотосинтезирующими бактериями, растущими на бикарбонате, обогащенном изотопом 13С. Докл. АН СССР 242: 1417-1420.
4. Ивлев А.А. 1985. О природе изотопных эффектов углерода в живой клетке. Биофизика 30: 506-516
5. ИвлевА.А. 1989. О дискретности процесса ассимиляции СО2 на свету С3-растениями. Биофизика 34: 887-891.
6. Ивлев A.A. 1992. Изотопные эффекты углерода и сопряженный механизм фотосинтеза и фотодыхания. Физиология растений 39: 545-552.
7. ИвлевA.A. 1993. О потоках «лёгкого» и «тяжёлого» углерода при сопряжении фотосинтеза и фотодыхания. Физиология растений 40: 872-880.
8. Ивлев A.A. 2002. Изотопноуглеродный (13С/12С) эффект фотодыхания у фотосинтезирующих организмов. Доказательства существования. Вероятный механизм. Биофизика 47: 55-70.
9. Ивлев A.A. 2004a. Вклад фотодыхания в изменения изотопноуглеродных характеристик растений при воздействии стрессовых факторов. Физиология растений 51: 303-313.
10. Ивлев А.А. 2004b. Внутримолекулярные изотопные распределения метаболитов в гликолитической цепи. Биофизика 49: 436-452.
11. ИвлевA.A. 2005. Изотопный эффект в глициндегидрогеназной реакции — причина внутримолекулярной изотопной неоднородности углерода глюкозы крахмала, синтезируемого при фотодыхании. Биофизика 50: 1079-1087.
12. Ивлев A.A. 2008. Изотопные эффекты углерода и клеточные механизмы углеродного метаболизма в фотосинтезирующей клетке. М.: РГАУ - МСХА. 74с.
13. ИвлевA.A, КалинкинаЛГ. 2001. Экспериментальные свидетельства существования изотопного эффекта фотодыхания. Физиология растений 48: 467-480.
14. Ивлев А.А., Лапин А.В., Бризанова Л.Я. 1987. Распределение изотопов углерода (13С/12С) в глюкозе крахмала кукурузы. Физиология растений 34: 493-498.
15. Ивлев A.A, Пичужкин ВИ, Князев ДА. 2001. Изменения изотопного состава углерода органов пшеницы в онтогенезе и их возможная связь с фотодыханием растений. Физиология растений 46: 443-451.
16. Игамбердиев A. У. 1991. Пероксисомальное окисление в растениях. Физиология растений 38: 774-786.
17. Калинкина Л.Г., Удельнова T.M. 1990. Влияние фотодыхания на фракционирование стабильных изотопов углерода у морской хлореллы. Физиология растений 37: 72-78.
18. Калинкина Л.Г., Удельнова T.M. 1991. Механизм вовлечения гликолатного пути в накопление свободного пролина у морской водоросли в условиях засоления. Физиология растений 1991. Физиология растений 38: 948-958.
19. Кукушкин A.K., Солдатова E.A. 1996. Влияние фотодыхания на индукцию замедленной миллисекундной люминесценции хлорофилла фотосистемы II высших растений: теоретической исследование. Биофизика 41: 440-444.
20. Санадзе Г.А., Блэк Л.Л., Тевзадзе И. Т., Тархнишвили Г.М. 1978. Изменение отношения 13СО2/12СО2 при фотосинтезе растениями С3 и С4 // Физиология растений. 25: 171-172.
21. Abelson P.H., Hoering T.C. 1961. Carbon isotope fractionation in formation of amino acids by photosynthetic organisms. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 47: 623- 631.
22. Borland A.M., Griffiths H., Broadmeadow M.S.J., Fordham M.C., Maxwell C. 1993. Short-term changes carbon isotope discrimination in the C3-CAM intermediate Clusia minor L. growing in Trinidad. Oecologia 95: 444-453.
23. Borland A.M., Griffiths H., Broadmeadow M.S.J., Fordham M.C., Maxwell C. 1994. Carbon isotope composition of biochemical fractions and the regulation of carbon balance in leaves of the C3-Crassulacean acid metabolism intermediate Clusia minor L. growing in Trinidad. Plant Physiology 105: 493-501.
24. Brugnoli E., Farquhar G.D. 2000. Photosynthetic fractionation of carbon isotopes In: Leegood RC, Sharkey TD and von Caemmerer eds., Photosynthesis: Physiology and Metabolism, Kluwer, the Netherlands, 399-434.
25. Chikaraishi Y., Naraoka H. 2001. Organic hydrogen — carbon isotope signature of terrestrial higher plants during biosynthesis for distinctive photosynthetic pathways. Geochemical Journal 35: 451-458.
26. Сгaig H. 1954. Carbon-13 in plants and relation ships between carbon-13 and carbon-14 variations in nature. Journal of Geology 62: 53-92.
27. Deleens E., Garnier-Dardart J. 1977. Carbon isotope composition of biochemical fractions isolated from leaves of Bryophyllum daigremontianum Berger, a plant with CAM some physiological aspects related to CO2 dark fixation. Planta 135: 241-248.
28. Duranceau M., Ghashghaie J., Badeck F., Deleens E., Cornic G. 1999. 513C of CO2 respired in the dark in relation 513C of leaf carbohydrates in Phaseolus vulgaris L. under progressive drought. Plant Cell & Environment 22: 515-523.
29. Duranceau M., Ghashghaie J., Brugnoli E. 2001. Carbon isotope discrimination during photosynthesis and dark respiration in intact leaves of Nicotiana sylvestris comparisons between wild type and mitochondrial mutant plants. Australian Journal of Plant Physiology 28: 65-71.
30. Edwards G., Walker D. 1983. C3, C4: Mechanisms, Cellular, and Environmental Regulation of Photosynthesis. Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, Boston, Melbourne.
31. Farquhar G.D. 1980. Carbon isotope discrimination by plants: Effect of carbon dioxide concentration and temperature via the ratio of intercellular and atmospheric CO2 concentration. In: Pearman GI (ed.) Carbon Dioxide and Climate: Australian Research,. Australian Academy of Science, Canberra, 105-111.
32. Farquhar G.D., O’Leary M.H., Berry J.A. 1982. On the relationship between carbon isotope discrimination and intercellular carbon dioxide concentration in leaves. Australian Journal of Plant Physiology 9: 121-137.
33. Galimov E^., Kodina L.А., Generalova V.N., Bogachova М.V. 1977. A study of carbon isotope distribution in biogenic compounds. In: A.V.Sidorenko, ed. The 8th International Congress on Organic Geochemistry. Abstracts, Vol. 2, Moscow, 156.
34. Ghashghaie J., Badeck F.-W., Lanigan G., Nogues S., Tcherkez G., Deleens E., Cornic G., Griffiths H. 2003. Carbon isotope fractionation during dark respiration and photorespiration in C3-plants. Phytochemistry Reviews 2: 145-161.
35. Gillon J.S., Griffiths H. 1997. The influence of (photo)respiration on carbon isotope discrimination in plants. Plant, Cell & Environment 20: 1217-1230.
36. Gleixner G., Schmidt H.-L. 1997. Carbon isotope effects on fructose-1,6-bisphosphate aldolase reaction, origin for non-statistical 13C distribution in carbohydrates. Journal of Biological Chemistry 272: 5382-5387.
37. Gleixner G., Danier H.G., Werner R.A., Schmidt H.-L. Correlation between the 13C content of primary and secondary products in different cell compartmentsand that in decomposing ba-sidiomycetes. Plant Physiology 1993. 102: 1287-1290.
38. Goyal A., Tolbert N.E. 1996. Association of glycolate oxidation with photosynthetic electron transport in plant and algal chloroplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 93: 3319-3324
39. Hobbie E.A., Werner R.A. 2004. Intramolecular, compound-specific, and bulk carbon isotope patterns in C3 and C4 plants: a review and synthesis. New Phytologist 161: 371-385.
40. IgamberdievA.U., IvlevA.A., BykovaN.V, ThrelkeldC.N., LeaP.J., GardestromP. 2001. Decarboxylation of glycine contributes to carbon isotope fractionation in photosynthetic organisms. Photosynthesis Research 67: 177-184.
41. Igamberdiev A.U., Mikkelsen T.N., Ambus P., Bauwe H., Lea P.J., Gardestrom P. 2004. Photorespiration contributes to stomatal regulation and carbon isotope fractionation: a study with barley, potato and Arabidopsis plants deficient in glycine decarboxylase. Photosynthesis Research 81: 139-152.
42. Ivlev A.A. 2003. Carbon isotope effect as a tool to study photosynthesis. Chemical Probes in Biology, ed. Schneider MP. Kluwer Academic Publishers, Netherlands, p.269-285.
43. Ivlev A.A., Bykova N.V, Igamberdiev A.U. 1996. Fractionation of carbon (13C/12C) isotopes in glycine decarboxylase reaction. FEBS Letters 386: 174-176.
44. IvlevA.A., IgamberdievA.U., DubinskyA.Yu. 2004. Isotopic composition of carbon metabolites and metabolic oscillations in the course of photosynthesis. Biofizika 49 (Suppl. 1): 3-16.
45. Lerman J.C., DeleensE., Nato A., MoyseA. 1974. Variations in the carbon isotope composition of a plant with Crassulacean Acid Metabolism. Plant Physiology 53: 581-584.
46. Lin G.H., Ehleringer J.R. 1997. Carbon isotope fractionation does not occur during dark respiration in C3 and C4. Plant Physiology 114: 391-394.
47. O’LearyM.H. 1981. Carbon isotope fractionation in plants. Phytochemistry20: 553-567.
48. O’Leary M.H. 1984. Measurement of the isotope fractionation associated with diffusion of carbon dioxide in aqueous solution. Journal of Physical Chemistry 88: 823-825.
49. Park R., Epstein S. 1961. Metabolic fractionation of 13C/12C in plants. Plant Physiology 36: 133-139.
50. Rauschenbach P., Simon H., Stichler W., Moser H. 1979. Comparison of the deuterium and carbon-13 contents of ethanol obtained by fermentation and chemical synthesis. Zeitschrift fur Naturforschung 34c: 1-4.
51. Raven J.A., Griffiths H., Glidewell S.M., Preston T. 1982. The mechanism oxalate biosynthesis in higher plants: investigations with the stable isotopes oxygen-18 and carbon-13. Proceedings of the Royal Society (London), Series B. 216: 87-101.
52. Rivera E.R., Smith B.N. 1979. Crystal morphology and 13Carbon/12Carbon composition of solid oxalate in Cacti. Plant Physiology 64: 966-970.
53. RhodesM.J.C. 1980. In: Biochemistry of Plants. A Comprehensive Treatise. V.2. Stumpf PK, Conn EE, eds., N.Y., Academic Press, 419-434.
54. Roeske C.A., O’Leary M.H. 1984. Carbon isotope effect on enzyme catalysed carboxyla-tion of ribulose bisphosphate. Biochemistry 23: 6275-6284.
55. Rooney M.A. 1988. Short-term Carbon Isotope Fractionation in Plants. Ph.D. Thesis, University of Wisconsin, Madison, USA.
56. Rossmann A., Schmidt H.-L., Reniero F., Verzini G., Moussa I., Merle M.H. 1996. Stable carbon isotope contents in ethanol of EC data bank wines from Italy, France and Germany. Zeitschrift fur Lebensmitteluntersuchung undForschung A 203: 293-301.
57. Rossmann A., Butzenlechner M., Schmidt H.-L. 1991. Evidence for non-statistical carbon isotope distribution in natural glucose. Plant Physiology 96: 609-614.
58. RousselM.R., IvlevA.A., IgamberdievA.U. 2007. Oscillations of the internal CO2 concentration in tobacco leaves transferred to low CO2. Journal of Plant Physiology 164: 1188-1196.
59. Saranga Y., Flash I., Yakir D. 1998. Carbon isotope ratio in cotton varies with growth stage and plant organ. Crop Science 38: 782-787.
60. Satoh K., Katoh S. 1983. Induction kinetics of millisecond-delayed luminescence in intact Bryopsis chloroplasts. Plant and Cell Physiology 24: 953-962
61. Schmidt H.-L. 2003. Fundamentals and systematics of the non-statistical distributions of isotopes in natural compounds. Naturwissenschaften 90: 537-552.
62. Schmidt H.-L, Kexel H., Butzenlechner M., Schwarz S., Gleixner G., Thimet S., Werner R.A., Gensler M. 1995. Non-statistical isotope distribution in natural compounds: mirror of their biosynthesis and key for their origin assignment. In Stable Isotopes in the Biosphere Wada E, Yoneyama T, Minagawa M, Ando T & Fry BD, eds., Kyoto University Press, Kyoto, 17-35.
63. Scrimgeour C.M., Bennet W.M., Connacher A.A. 1988. A convenient method of screening glucose for 13C: 12C ratio for use in stable isotope tracer studies. Biomedical and Environmental Mass Spectrometry 17: 265-266.
64. Tcherkez G., Farquhar G.D., Badeck F.-W., Ghashghaie J. 2004. Theoretical consideration about carbon isotope distribution in glucose of C3 plants. Functional Plant Biology 131: 857-877.
65. Vogel J.C. 1980. Fractionation of carbon isotopes during photosynthesis. In: Sitzungs-berichte der Heidelberger Akademie der Wissenschaften, Mathematisch-naturwissenschaftliche Klasse Jahrgang. 3 Abhandlung. Springer-Verlag, Berlin, 111-135.
66. Vogel J.C. 1993. Variability of carbon isotope fractionation. In: Stable Isotopes and Plant Carbon - Water Relations. Ehleringer JR, Hall AE, Farquhar GD (Eds), Academic Press, San Diego, 29-45.
67. Von Caemmerer S., Evans J.R. 1991. Determination of the average partial pressure of CO2 in chloroplasts from leaves of several C3 species. Australian Journal of Plant Physiology 18: 287-305.
68. White JW. 1993. Implications of carbon isotope discrimination studies for breeding common bean under water deficits. In: Stable Isotopes and Plant Carbon — Water Relations. Ehleringer JR, Hall AE, Farquhar GD (editors), Academic Press, San Diego, 387-398.
69. Weber D, KexelH, SchmidtL-H. 1997. 13C-pattern of natural glycerol: origin and practical importance. Journal of Agricultural and Food Chemistry 45: 2042-2046.
70. Zhang BI, Emeriau L, Martin GJ. 1991. Comparison of the isotopic behaviour of Legu-minosae constituents. Characterization of lentils. Sciences des Aliments 11: 291-304.
ПРИЛОЖЕНИЕ
При разработке алгоритмов для удобства обозначения метаболитов использовали в английской транскрипции.
Алгоритм расчета распределения изотопов углерода в G6P (глюкозе), образующейся в карбоксилазную фазу работы цикла
Распределение изотопного состава рассчитывается по реккурентным формулам, когда последующие значения вычисляются по результатам предыдущих величин.
Пусть вначале имеется молекула рибулозо-1,5-бисфосфата (RuBP) с распределением
RuBP(1), RuBP(2), RuBP(3), RuBp(4), RuBP(5). Из нее получается 2 молекулы PGA со следующим распределением pGA(1) = 1/2x(RuBP(1) + RuBP(5)); PGA(2) = 1/2x(RuBP(2) + + RuBP(4)); PGA(3) = 1/2x(RuBP(3) + 5CO2), где 5CO2 — изотопное содержание ассимилируемого углекислого газа.
Далее образуются 6 молекул FBP со следующими характеристиками:
FBP(1)= FBP(6)=PGA(1); FBP(2)= FBP(5)=PGA(2); FBP(3)= FBP(4)=PGA(3).
Эти молекулы F6P превращаются в молекулы G6P и перемешиваются с остальными молекулами фонда глюкозы, так что в среднем: G6P(i)=(FBP(i)+G6P(i)*NG)/( NG + 1), где Ng — количество молекул глюкозы в фонде. Теперь «усредненная» глюкоза движется по пути преобразования в RuBP: RuBP(1) = PGA(1); RuBP(2) = PGA(2); RuBP(3) = PGA(3); RuBP(4) = (PGA(3)+2*PGA(2))/3; RuBP(5) = (PGA(3)+2*PGA(1))/3, после чего цикл повторяется.
Алгоритм расчета распределения изотопов углерода в глюкозе (G6P), образующейся в оксигеназную фазу работы цикла
RuBP разбивается на pGa и гликолат, причем PGAa(1) = RuBP(1), PGAa (2) = RuBP(2), PGAa (3) = RuBP(3).
Если обозначить qt = RuBP(5), а q2= RuBP(4), q0= 1 - qt - q2, и y=k/kl (где у - кинетический изотопный эффект, k - константа скорости глициндегидрогеназной реакции, в которой рвется связь 12С-12С, kl - константа скорости глициндегидрогеназной реакции, в которой рвется связь 12С-13С), то после высвобождения углекислого газа (где и проявляется изотопный эффект), доли тяжелых атомов в PGA будут следующими: PGAb(1)= q2/( yq0+ qt + q2),
PGAb(2) = q1 (2(Yqc+ q1 + q2)-1)/( Yq<)+ q1 + q2); PGAb(3) = q2 (2(Yq<)+ q1 + q2)-1)/( Yq<)+ q1 +
+ q2). Затем PGAa и PGAb смешиваются: PGA(i) = (2*PGAa(i) + PGAb(i))/3. Далее образуется FBP подобно тому, как в цикле Кальвина: FBP(1)= FbP(6)=PgA(1); fBP(2)= FbP(5)=PGA(2); FBP(3)= FBP(4)=PGA(3). После этого FBP смешивается с двумя молекулами G6P: FBP(i)= =(FBP(i)+2G6P(i))/3.
Из трех получившихся молекул FBP одна возвращается в пул G6P, усредняясь с находящимися там молекулами G6P: G6P(i)=( FBP(i) + G6P(i) (NG -2))/( NG -1). Одна молекула триозофосфата и часть молекулы FBP (атомы с третьего по четвертый) через образование эритрозофосфата идут на образование седогептулозофосфата (S7P), причем S7P(1)= PGA(1); S7P(2)= PGA(2); S7P(3)= PGA(3); S7P(4)= FBP(4); S7P(5)= FBP(3); S7P(6)= FBP(2); S7P(7)= =FBP(1).
Оставшаяся часть молекулы FBP (атомы первый и второй) и молекула триозофосфата образуют молекулу ксилулозофосфата (XP) (а) с распределением XPa(1)= PGA(1); XPa (2)= =PGA(2); XPa (3)= PGA(3); XPa (4)= PGA(2);XSPa (5)= PGA(1). Первые два атома молекулы седогептулозофосфата и молекула триозофосфата образуют еще одну молекулу ксилулозо-
фосфата (в) с распределением атомов, аналогичным первой. Остальные пять атомов идут на образование ЯиБР ЯиБР(1) = РвЛ(3); ЯиБР(2) = РвЛ(3); ЯиБР(3) = РвЛ(3); ЯиБР(4) = =РвЛ(2); ЯиБР(5) = РвЛ(1).
Наконец, смешиваются все три молекулы ЯиБР(1)=( ЯиБР(1) + ХРа(1) + ХРь(1))/3, после чего цикл повторяется.
SUMMARY
According to oscillation hypothesis, carbonaceous metabolism by photosynthesis is implemented in the form of oscillation process. Fluctuations are sustained and consist of two phases -assimilation of CO2 and photo-respiration. The former corresponds to carboxylase phase of functioning Rubisko, the latter to oxygenase phase. Distribution of C13 isotope in carbohydrates is closely connected with photosynthetic oscillations occurring in the process of photosynthesis. Carbohydrates are produced in each stage. We assert that carbohydrates forming in carboxylase phase consist of hexoses with relatively uniform C13 distribution along carbonic backbone of molecules, whereas hexoses in carbohydrates, synthesized in oxygenase phase, are characterized by specific non-uniform isotopic pattern. Above mentioned hypothesis accounts for both carbon isotope distribution peculiarities and isotopic composition of carbohydrates C3 and C4 - plants well and also isotopic differences in general carbon of carbohydrates, due to a different degree of substrate pool (fund) depletion, used in photo-respiration.
Key words: isotopic fractioning of carbon, photorespiration, Rubisko, carbohydrates, metabolism modeling.
Ивлев Александр Андреевич — д. с.-х. н. Эл. почта: аа[email protected]
