CC BY
34
УДК 575.24
RAPD-ФИНГЕРПРИНТИНГ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ РУССКОГО ОСЕТРА {ACIPENSER GUELDENSTAEDTII)
© 2004 г. Н.В. Войнова
RAPD-fingerprinting by specific primers A09, A07, B09, K20 was used for the analysis of nuclear DNA of different spawners of the Russian sturgeon Acipenser gueldenstaedtii. Individual specific RAPD patterns (amplicons) were obtained. The statistical analysis of an individual set of bands allows one to assess genetic similarity between spawners and conduct effective monitoring of genetic heterogeneity of populations conserved.
В 1990 г. Джон Г.К. Вильямс с соавторами [1] описали метод анализа полиморфизма ДНК, основанный на амплификации участков ДНК с помощью одного праймера произвольной нуклеотидной последовательности и получивший название RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA). Он достаточно широко распространен из-за сравнительной простоты в применении и высокой чувствительности. Анализ с помощью этого метода можно проводить без использования радиоактивных материалов. Его слабые стороны -фрагменты ДНК трудно связать с локусами генома; RAPD-полосы различной природы могут иметь одинаковые размеры и совпадать при проведении электрофореза; воспроизводимость результатов, полученных при проведении анализа одного и того же материала, но в разных лабораториях, оставляет пока желать лучшего [2]. Ряд авторов полагает, что RAPD-маркеры имеют доминантную природу и на электрофоретической картине гомозиготная полоса не отличается от гетерозиготной [3]. Тем не менее, общепризнано, что метод подходит для установления степени генетической близости отдельных особей, выявления внутри- и межпопуляционных сходств и различий, для доказательства фактов межвидовой гибридизации [3] и таких особых случаев формирования зиготы, как гиногенез и андрогенез [4]. Известны случаи применения RAPD-спектров для изучения эволюционных связей между отдельными группами осетровых рыб, а также их использования с целью видовой идентификации [5].
Цель работы - статистический анализ данных RAPD-фингерпринтов производителей азовской популяции русского осетра для оценки существующего генетического разнообразия, а также возможностей влияния на генетический состав популяции путем целенаправленного подбора производителей для скрещивания в условиях искусственного разведения.
Материал и методы
Материалом для исследования служили зафиксированные в 96%-м этаноле фрагменты плавников 10 самцов и 8 самок производителей русского осетра. Все изученные особи выловлены в Азовском море в районе Дол-
38
жанской косы осенью 2000 г., морфологически - типичные представители вида Асірешег іріеШешІаесШі. Отбор производили на Донском ОРЗ в 2001г. Характеристики исследованных особей приведены в табл. 1.
Таблица 1
Характеристика проб тканей русского осетра (Асірешег цисИсгЫас^и), использованных в работе
Номер образца в каталоге коллекции АзНИИРХ Пол особи Масса тела, кг Длина тела, см Дата отбора пробы
538 Самка - 124 10.05.01
539 » - 128 »
540 » - 141 »
541 » - 147 »
542 » - 138 11.05.01
543 » - 147 »
544 » - 147 »
545 » - 137 12.05.01
546 » - 147 »
548 Самец 8,5 101 10.05.01
549 » 13 123 »
550 » 18 127 »
551 » 16 119 »
552 » 8 108 »
553 » 11 113 »
554 » - - »
555 » 8,2 104 14.05.01
556 Самка - 119 »
Для выделения ДНК из консервированных образцов в стерильную 1,5 мл пробирку типа эппендорф помещали фрагмент ткани плавников массой 10 -50 мг. Добавляли 400 мкл лизирующего буфера (10 мМ Трис-НС1 pH = 7,5; 10 мМ ЭДТА; 100 мМ №С1; 2 % 8Б8), 20 мкл 1 М дитиотрейтола (ДТТ) и 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Инкубировали 2 - 3 ч при 56 °С в термо-шейкере. Депротеинизировали равным объемом фенола [4], затем смесью фенол / хлороформ / изоамиловый спирт 25 /24/ 1, затем смесью хлороформ / изоамиловый спирт 24 / 1 до тех пор, пока интерфаза не становилась чистой. Водную фазу переносили в чистую 1,5 мл пробирку, добавляли двойной объем холодного 96 % этанола и раствора №С1 до конечной концентрации
0,2 М, встряхивали на вортексе. Инкубировали при -20 °С 1 ч. Далее проводилось центрифугирование при 15000 об/мин 10 мин. Супернатант сливали,
осадок промывали 80 % холодным этанолом, высушивали, растворяли в 50 -100 мкл ЮмМ ТЕ-буфера в течение часа при 56 °С. Качественную и количественную оценку выделенной ДНК проводили при помощи электрофореза в
1.0 % агарозном геле в присутствии бромида этидия.
Для проведения анализа использованы праймеры А09, А07, В09, К20.
RAPD-PCR проводили следующим образом: на основании спектрофотометрических измерений и вычисления концентрации ДНК (SectraMax 284 Plus, Molecular Devices, USA) от общего объёма образца отбирали аликвоту раствора ДНК и разводили её деионизованной водой до концентрации 20 мкг/мл.
Собирали реакционную смесь для RAPD-PCR исходя из того, что в одной пробирке (0,5 мл) должно содержаться 25 мкл смеси следующего состава: 10-кратный буфер - 2,8 мкл, dNTP (2,5 мМ) - 2,0 мкл, хлорид магния (50 мМ) -
1.0 мкл, праймер (5 о.е. в мл) - 0,5 мкл, Taq-полимераза (5 ед. в мкл) - 0,0625 мкл, исследуемая ДНК (20 мкг/мл) - 1,0 мкл.
Использовали стандартные амплификационные наборы «Biomaster» («Диалат ЛТД», РФ).
ПЦР выполняли на «Tetrad РТС-225» («MJ Research», USA) по следующей программе: первичная денатурация: 1 цикл, 94 °С - 3 мин. Далее 36 циклов: 94 °С - 1 мин, 36 °С - 30 с, 72 °С - 1 мин. Досинтез: 1 цикл: 72° С - 10 мин.
Затем проводили вертикальный гель-электрофорез (камераУЕ-З, «Хели-кон», РФ) продуктов амплификации в 6%-м полиакриламидном геле, 1-кратном ТВЕ-буфере, при 80 - 150 мА в течение 2 - 3 ч. RAPD-спектры считывали непосредственно с дефинитивных гелей на приборе «Typhoon 8600» (Variable Mode Imager, «Molecular Dynamics», USA).
Данные электрофореграмм были переведены в бинарные матрицы, для каждого образца и каждого праймера анализировали не менее 15 полос в индивидуальном RAPD-спектре. Затем на основе этих данных были вычислены коэффициенты попарного сходства^) между фингерпринтами самцов и самок отдельно по каждому праймеру по формуле [5,6] S = 2Fab(Fa + Fb), где Fab - число полос, общих для двух особей, Fa и Fb - общее число полос для каждой особи.
Статистические расчеты проводили при помощи программы «Statistica 6.0».
Результаты и их обсуждение
Полученные RAPD-фингерпринты представлены на рис. 1 - 4, из которых видно, что в каждом конкретном спектре могут быть выделены мономорфные и полиморфные сигналы, имеющие характер индивидуального ДНК-фингерпринта.
, 9 9 9 9 9 9 999 с*сТс^сГсТс?с?9
53* 539 МО 541 542 543 544 545 546 548 549 550 551 552 553 554 555 556
2000 -
И6<)" 805 -
в—и
— тт д г г
200-
Рис. 1. КАР О-РСК спектры русского осетра с праймером ВОЯ
Полоса 1 - маркеры молекулярной массы (УРвИ), слева указан размер фрагментов в п.н. Особи обозначены номерами каталога генетической коллекции АзНИИРХ Примечание. Справедливо для всех рисунков
99 99 9 9 99 9сГсГсГ</сГсГ</сГ9
531 539 540 541 542 543 544 545 546 548 549 550 551 552 553 554 555 556
1160
805
Рис. 2. КАРП-РСК спектры русского осетра с праймером А07
9 9 99 9 9 99 9сГсГсГсГсГсГсГсГ9
53* 539 540 541 542 543 544 545 546 54* 549 550 551 552 553 554 555 556
1
1160
805
И!
№~ВНННЯН|»
Рис. 3. КАРП-РСК спектры русского осетра с праймером А09
99 99 9 9 99 9о'о'о'о'сГо'о'о'9
538 539 540 541 542 543 544 545 546 548 549 550 551 552 553 554 555 556
150 --- •
Рис. 4. КАРП-РСК спектры русского осетра с праймером К20 42
В табл. 2 представлены некоторые параметры распределения коэффициентов попарного сходства между самцами и самками, участвовавшими в скрещивании. Из нее видно, что средние величины 8 (АР8) для всех праймеров близки и составляют 0,543 - 0,717. Согласно современным представлениям, коэффициент попарного сходства - показатель родства изучаемых генотипов. Его средняя величина связана с уровнем генетического разнообразия популяции обратной зависимостью [6, 7]. Отсутствие данных по АР8 популяций осетровых рыб, размножающихся естественным путем, не позволяет провести корректный сравнительный анализ полученных АР8. Теоретически величины коэффициентов попарного сходства должны подчиняться закону нормального распределения, так как представляют собой непрерывный ряд значений. Однако выяснилось, что имеется отрицательная асимметрия (со значениями в пределах от -0,5 до -0,7). Эго говорит о смещении распределения в сторону более высоких значений коэффициентов попарного сходства; следовательно, имеется тенденция к повышению частоты близкородственных скрещиваний при существующей технологии искусственного воспроизводства русского осетра.
Таблица 2
Статистические параметры распределения коэффициентов попарного сходства
Праймер Среднее Ошибка среднего Асим- метрия Ошибка асим- метрии Эксцесс Ошибка эксцесса
АО 9 0,693 0,011 -0,594 0,269 0,032 0,532
А07 0,543 0,011 -0,701 0,269 1,495 0,532
В09 0,632 0,010 -0,522 0,269 0,078 0,532
К20 0,717 0,009 -0,510 0,269 -0,569 0,532
Праймеры, состоящие из разных последовательностей нуклеотидов, взаимодействуют с различными участками генома. Если полученные с их помощью ЯАРО-спсктры отражают объективно существующие соотношения в структурной организации геномов, следует ожидать корреляции численных значений коэффициентов попарного сходства. Результаты такого анализа представлены в табл. 3.
Таблица 3
Коэффициенты корреляции рядов численных значений 8,
полученных при помощи разных праймеров
Праймер АО 9 К20 В09 А07
АО 9 0,29* 0,36* 0,23*
К20 -0,12 0,17
В09 0,47*
* Достоверные результаты при р < 0,05
Из табл. 3 видно, что результаты, полученные при помощи разных праймеров, лучше коррелируют при наличии сходных последовательностей нуклеотидов в их структуре (табл. 4).
Таблица 4
Сравнительная структура использованных в работе праймеров (общие последовательности выделены жирным шрифтом)
Наименование праймера Последовательность нуклеотидов
АО 9 GGGTAAC GCC
А07 GAAAC GGGTG
В09 TGG GGG ACT С
К20 GTG TCG CGA G
Результаты, полученные при помощи праймера А09, дающего стабильную корреляцию со всеми остальными, можно принять за консенсусные и использовать для моделирования генетических последствий изменения схемы скрещивания. Как известно, в настоящее время на рыбоводных заводах практикуют оплодотворение икры смесью спермы всех самцов, т.е. проводят скрещивание всех со всеми. Как показывает простейший статистический анализ [8 - 11], индивидуальные скрещивания помогают добиться статистически достоверного изменения параметров распределения (табл. 5). Так, исключение всех пар, дающих 8 больше средней величины в случае скрещивания “всех со всеми”, позволяет уменьшить среднюю величину 8 на 14 %, однако при этом значительно увеличиваются асимметрия и эксцесс (табл. 4). Путем исключения особей, дающих наиболее близкородственные скрещивания, можно добиться уменьшения асимметрии, но при этом появляется отрицательный эксцесс.
Таблица 5
Моделирование влияния схемы скрещивания на характеристики распределения 8 для праймера А09____________
Схема скрещивания Средняя величина S Асимметрия Эксцесс
Все со всеми 0,693 ±0,011 -0,594 0,032
Исключение № 538 и №549 0,674 ±0,013 -0,430 -0,123
Исключение № 538, 549, 539, 540 0,666 ±0,015 -0,284 -0,438
Только пары, дающие Б < 0,693 0,595 ±0,012 -1,324 1,417
Сохранение генетической разнокачественности существующих популяций осетровых рыб - одна из наиболее актуальных и сложных задач современной
44
консервационной биологии. Как уже упоминалось выше, численность основных промысловых видов этой систематической группы поддерживается в основном за счет искусственного воспроизводства. При этом используется небольшое число производителей. Так, для зарыбления всего Азовского моря в 2002 г. было использовано около 400 производителей русского осетра. До недавнего времени производителей отлавливали в море, однако трудности с их заготовкой требуют создания ремонтно-маточных стад осетровых рыб. В этих условиях возникает опасность генетического вырождения сохраняемых видов. Таким образом, мониторинг генетических процессов в сохраняемых популяциях становится не просто интересной научной задачей, а условием успешного их сохранения [12].
Для такого мониторинга могут быть использованы различные молекулярногенетические методы (анализ изоферментных спектров, секвенирование ДНК, рестрикционный анализ и др.). По нашему мнению, RAPD-фингерпринтинг, позволяющий изучать интегральные характеристики генома должен стать важным элементом соответствующего методического арсенала. Как показали проведенные нами исследования, данные RAPD-фингерпринтинга позволяют контролировать и целенаправленно изменять генетические характеристики искусственно поддерживаемых популяций. В случае осетровых рыб эти данные могут быть использованы при формировании ремонтно-маточных стад, отборе спермы для криоконсервации и организации обмена производителями и их половыми продуктами между заводами.
Литература
1. Williams J.G.K. etal. //Nucleic Acids Research. 1990. Vol. 18. P. 6531 -6535.
2. Tegelstrom H., Hoggeren М. II Biochemical Genetics. 1994. Vol. 32. P. 249 -256.
3. Recoubratsky A. V. et a I. II RAPD-PCR evidence of dispermic origin of diploid an-drogenetic sturgeons. 4th International symposium on sturgeon. Oshkosh, Wisconsin, USA. 2001. AQ46.
4. Grunina A.S. et al. II Viable nucleoplasmic hybrids prodused by dispermic andro-genesis: experiments on sturgeons. 4th International symposium on sturgeon. Oshkosh, Wisconsin, USA. 2001. AQ 22.
5. Рекубратский A.B. и др. И Онтогенез. 2003. № 2. Т. 34. С. 92 - 102.
6. СиротаН.П. и др. //Генетика. 2000. № 4. С. 570 - 574.
7. РысковА.П. //Молекулярная биол. 1999. Т. 33. № 6. С. 997 - 1011.
8. ДолматоваП.Ю. и др. //Генетика. 2000. № 5. С. 682 -685.
9. Долматова П.Ю. и др. //Генетика. 2000. № 6. С. 805 - 809.
10. Токарская О.Н. и др. //Генетика. 2000. Т. 36. № 11. С. 1520 - 1530.
11. Семёнова С.К. и др. //Генетика. 2000. Т. 36. № 11. С. 1535 - 1545.
12. АлтуховЮ.П., АбрамоваА.Б. //Генетика. 2000. № 12. С. 1674 - 1690.
Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства 26 декабря 2003 г.
