CC BY
10УДК 61:001.89
Я.Б. Москвичева1, Е.А. Казакова2, Н.Н. Савина3, А.И. Гинак4, И.В. Нынь5
Проблема раневой инфекции остается актуальной для медицины, особенно в случае медицины катастроф, а также в хирургии, травматологии и ряде других клинических дисциплин. Постоянный поиск новых вариантов лекарственных средств вызван наличием антибиоти-ко-устойчивых штаммов микроорганизмов, разработкой новых эффективных перевязочных материалов [1-3].
Действие антисептиков должно быть направленно на препятствие адгезии микроорганизмов к тканям раневого ложа, локализацию инфекционного агента, обеспечение длительного антимикробного эффекта, а, в целом, перевязочное средство должно стимулировать пролиферативные процессы [1, 2].
Протеолитические ферменты, широко использующиеся в биотехнологии, обладают активным некроли-тическим действием, и потому находят применение при лечении ран различного происхождения. Ценными лечебными свойствами обладают композиции из протеолитиче-ских ферментов и антисептика для снижения микробного обсеменения раны [3].
Новая ранозаживляющая композиция является комбинацией известных лекарственных средств: Терриде-
РАНОЗАЖИВЛЯЮЩАЯ КОМПОЗИЦИЯ С ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИМ ФЕРМЕНТОМ И ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ И РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет) 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26 Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов 198320, Санкт-Петербург, Красное Село, ул. Свободы, д. 52
Предложена новая композиция ферментосодержащего ранозаживляю-щего средства и проведено доклиническое изучение антимикробной и ранозаживляющей активности. Опыты in vitro показали выраженный противомикробный, дозозависимый эффект композиции в отношении золотистого стафилококка и независимый от дозы, эффект в отношении кишечной палочки. Выявлен слабый фунгицидный эффект раноза-живляющей композиции. Показано, что применение перевязочного материала, импрегнированного ранозаживляющей композицией оказывает весьма благоприятный эффект на течение раневого процесса как у инфицированных животных, так и у животных с "чистой" раной.
Ключевые слова: Террилитин®, Терридеказа®, Катацел®, ферменто-содержащая ранозаживляющая композиция, антисептик, антимикробная активность, ранозаживляющая активность
каза® и Катацел®. Терридеказа® - это модифицированная полиглюкином форма фермента террилитина (МНН: террилитин), которая является продуктом биосинтеза Aspergillus terrícola [4]. Катацел® (МНН: бензалкония хлорид) -хорошо изученное антимикробное средство для борьбы с полирезистентными возбудителями раневых инфекций, усиливает действие антибиотиков, угнетает синтез проте-олитических ферментов (плазмакоагулазы, гиалуронида-зы) [5, 6].
Ранозаживляющая композиция представляет собой марлевую салфетку, пропитанную упомянутыми лекарственными средствами. Антисептик Катацел® на основе Катамина АБ обладает широким спектром действия против грамположительных, грамотрицательных бактерий, дерматофитов и плесневых грибов. Фермент террилитин, продуцируемый культурой Aspergillus terrícola, выпускается по оригинальной ферментационной технологии.
Целью настоящей работы являлось доклиническое изучение антимикробной и ранозаживляющей активности композиции с протеолитическим ферментом.
В опытах in vitro исследовали действие перевязочного материала, содержащего ранозаживляющую ком-
1 Москвичева Яна Борисовна, науч. сотр. ФГУП СПбНИИВС ФМБА России, соискатель, каф. молекулярной биотехнологии СПбГТИ(ТУ), e-mail: Moskvichev.36@mail.ru
2 Казакова Екатерина Александровна, химик ФГУП СПбНИИВС ФМБА России, e-mail: Moskvichev.36@mail.ru
3 Савина Наталья Николаевна, химик ФГУП СПбНИИВС ФМБА России, e-mail: Moskvichev.36@mail.ru
4 Гинак Анатолий Иосифович, д-р хим. наук, профессор, зав. каф. молекулярной биотехнологии СПбГТИ (ТУ), e-mail: mbt@lti-gti.ru
5 Нынь Игорь Владимирович, канд. техн. наук, директор ФГУП СПбНИИВС ФМБА России, e-mail: Moskvichev.36@mail.ru
Дата поступления - 11 марта 2011 года
позицию, на рост микроорганизмов [7]. Для этого в чашки Петри на мясо-пептонный агар (МПА) «газоном» высевали культуры штамов Staphylococcus aureus, Escherichia coli и Candida albicans, а на агаризованную среду Сабуро -Trichophyton mentagraphytes. Сразу после посева микроорганизмов в центре чашек располагали образцы перевязочного материала (1x1 см2), импрегнированные исследуемой ранозаживляющей композицией, а в качестве контроля - образец без ранозаживляющей композиции. Чашки Петри с посевами культур S. aureus, E. coli и С. albicaus инкубировали при 37 °С двое суток, а с культурой T. mentagraphytes - при 28 °С десять суток.
Использованы следующие соотношения антисептика и фермента на 100 г перевязочного материала:
1. 120 мг Катамина АБ и 286 ПЕ Терридеказы®;
2. 180 мг Катамина АБ и 640 ПЕ Терридеказы®;
3. 360 мг Катамина АБ и 1080 ПЕ Терридеказы®;
4. 720 мг Катамина АБ и 1440 ПЕ Терридеказы®;
5. 1800 мг Катамина АБ и 16000 ПЕ Терридека-
зы®.
Результаты эксперимента оценивали по степени задержки роста микроорганизмов на питательной среде. Площадь зоны задержки роста определяли планиметрированием.
При исследовании перевязочного материала с максимальным содержанием ингредиентов композиции (вариант 5) зона задержки роста культуры S. aureus увеличилась до (6,2±0,6) см2.
Анализ полученных результатов свидетельствует о незначительном, но пропорциональном возрастании активности композиции против культуры стафилококка при увеличении концентрации антисептика в 15 раз.
Иное воздействие оказала ранозаживляющая композиция с протеолитическим ферментом на культуры E. coli. Из изученных штаммов один оказался высоко чувствительным, а остальные были чувствительными - зона задержи роста штаммов E. coli не зависела от испытуемой концентрации антисептика и в среднем равнялась (5,7±0,3) см2.
Изучение противомикробного действия ранозаживляющей композиции на культуру С. albicans показало отсутствие выраженного такового действия. Действие на культуру T. mentagraphytes было непостоянным и характеризовалось задержкой роста в 2-3 мм вокруг перевязочного материала.
Исходя из полученных данных, удачным, на наш взгляд, являлось соотношение антисептика с ферментом в варианте 2 ранозаживляющей композиции: 180 мг Катамина АБ и 640 ПЕ Терридеказы® на 100 г перевязочного материала.
Таким образом, опыты in vitro показали выраженный противомикробный, дозозависимый эффект новой ранозаживляющей композиции в отношении культуры S. aureus и выраженный, независимый от дозы эффект в отношении культуры E. coli. Действие на культуру T. mentagraphytes было слабым, а на культуру С. albicans отсутствовало.
Известно, что введение под кожу лабораторным животным даже высоких доз патогенных стафилококков (107 - 109 КОЕ/мл) не приводит к развитию сколь-нибудь длительного инфекционного процесса. Уже через 24 часа после заражения, массы микробов отграничиваются лейкоцитарным валом и вскоре стафилококки погибают. Между тем из практики заболеваний у человека следует, что образованию панарициев, фурункулов, нагноений послеоперационных швов способствует попадание в рану инородных тел.
Для создания у экспериментальных животных инфекционного очага многие исследователи используют введение в рану инфицированных тампонов, марли и хирургических лигатур. Мы остановились на последнем методе, как вызывающем сравнительно небольшие, поверхностно расположенные гнойные очаги, доступные после вскрытия для воздействия перевязочного материала, им-прегнированного антисептиком и ферментом.
Исследовали действие перевязочного материала, импрегнированного ранозаживляющей композицией с протеолитическим ферментом, на состояние гнойной раны у белых мышей. Перевязочный материал содержал 180 мг Катамина АБ и 640 ПЕ Терридеказы® на 100 г.
В опытах использовали 59 беспородных белых мышей весом 18,0 ± 2,0 г. За сутки до опыта спинку животных депилировали 10% сернистым натрием на площади 1,5x1,5 см2. В качестве лигатуры использовали хирургический шелк №6. Нить инфицировали гемолитическим стафилококком (штамм от больного, полученный в МАПО).
Лигатуру помещали во взвесь стафилококка с концентрацией 109 кл./мл в 0,9% растворе натрия хлорида и выдерживали в течение 1 часа до операции. Депили-рованную и обработанную спиртом кожу белых мышей прошивали хирургической иглой, снабженной инфицированной лигатурой. На пятые сутки в участке вшивания лигатуры возникал инфильтрат 1,0x0,5 см2. Кожа вокруг инфицированного участка была гиперемирована, при надавливании из места введения лигатуры выделялся гной.
Контрольную группу (8 животных) не лечили, через 6 суток после заражения мышей умерщвляли эфирным наркозом, кожу с подкожной клетчаткой в области инфильтрата вырезали, делили на 2 равные части, одну фиксировали в 10% формалине и готовили гистологические препараты, из второй проводили количественные микробиологические высевы. У опытных животных инфицированный участок разрезали бритвой, а вскрывшийся абсцесс тампонировали перевязочным материалом с ранозаживляющей композицией (19 животных) и стерильным бинтом (18 животных). Сверху рану заклеивали лейкопластырем. Повязки меняли ежедневно в течение 10 дней. Начиная с 10 суток после начала наблюдения и лечения, часть животных умерщвляли для проведения микробиологических и гистологических исследований.
Результаты исследований представлены в таблице 1. Уже через 6 суток после начала лечения более чем у половины животных гной из раны исчезал, инфильтрация резко уменьшалась, на ране образовывалась сухая корочка, при снятии струпа - края ранки были сомкнуты.
У нелеченных мышей во всех случаях к 6 суткам наблюдения отмечались выраженные воспалительные изменения с выделением гноя, рана была открытая, корочка не образовывалась.
Таблица 1. Динамика клинических проявлений
Группа Срок наблюдения, сут.
животных
2 6 7 8 9 10
1 группа (9) (5) (2) (2) (1) (1)
Заражен- ++++ +++ +++ +++ +++ +++
ные ста- (6) + + + + +
филокок- +++ (3) (1) (3) (3) (2)
ком с (4) + + +++ +++ ++ ++ ++
лечением (0) - (2) (3) (4) + (5) + (3) +
перевя- ++ ++ (1) - (1) - (1) -
зочным (7) + (4) + * * *
материа- (2) - (1) -
лом *
(19 жи-
вотных)
2 группа (13) (12) (6) (5) (5) (3)
Заражен- ++++ +++ +++ +++ +++ +++
ные ста- (4) + + + + +
филокок- +++ (3) (2) (1) (1) (1) +
ком без (1) ++ +++ ++ +++ ++ (1) -
лечения (0) - (3) - (9) - (1) - (1) - *
(18 жи- * * *
вотных)
Примечание: ++++ абсцесс, спайки, обильно выделение гноя; +++ инфильтрат, спайка; ++ незначительные спайки с подлежащей тканью; + корочка, отсутствует эпителизация; * животные умерщвлены для микробиологического и гистологического исследования.
К десятым суткам в группе леченых мышей гнойные выделения из раны отмечены лишь у одного живот-
ного. В то же время у большинства нелеченных животных воспалительные изменения прогрессировали.
Результаты микробиологического исследования гнойных ран животных представлены в таблице 2.
Таблица 2. Результаты микробиологических высевов
Использованные среды Группа \ч экспериментов N. МПА Солевой МПА 5% кровяной МПА
6 суток после инфицирования 12 суток после инфицирования 16 суток после инфицирования (0,44±0,12) 109 (0,35 ±0,06)'109 (0,11 ±0,04)"109 (0,40±0,07)"109 (0,33±0,04)"108 (0,70±0,08)'10г (0,50±0,06)"108 (0,33 ±0,05)"109 (0,12±0,03)"109
6 суток лечения (12 суток после инфицирования) 10 суток лечения (16 суток после инфицирования) (0,17±0,08)"107 (0,28 ±0,12)"106 (0,35±0,05)"106 (0,32 ±0,13)'106 (0,18±0,11)"106 (0,12±0,09)"106
Наблюдения за инифицированными ранами без лечения показали, что количество микроорганизмов, обсеменяющих рану, не снижается в течение всего срока наблюдения (16 суток). Лечение животных в течение 10 дней перевязочным материалом, импрегнированным ра-нозаживляющей композицией с протеолитическим ферментом, снижает обсемененность раны на 3 порядка. У леченных животных характерно значительное снижение в высевах на кровяном МПА числа гемолитических колоний. К концу лечения у большинства животных (в сравнении с контролем) выделяемый из инфицированных ран стафилококк не обладал гемолитическими свойствами.
При гистологическом исследовании у леченых мышей подкожные абсцессы выражены значительно слабее, развита грануляционная ткань, по которой происходит подрастание резко распластанного эпидермиса. Отдельные гнойные участки оказываются элиминированными подросшим эпидермисом. Произведен подсчет митоти-ческого коэффициента (МК), выражающего интенсивность регенерации эпидермиса. У нелеченых животных МК равен 12%, у леченых МК равен 30%. Следовательно, скорость деления клеток кожного покрова значительно увеличивается в случаях применения перевязочного материала.
Аналогичные эксперименты с применением перевязочного материала проведены на "облегченной" модели, где рана не была искусственно обсеменена значительным количеством стафилококка.
Белым мышам делали разрез кожи и подкожной клетчатки на эпилированном участке спины и сразу накладывали перевязочный материал. Контрольным животным накладывали стерильный бинт. Результаты исследования представлены в таблице 3.
Уже через 6 суток лечения наступала полная эпителизация ткани практически у всех животных, в то время как у контрольных животных корочки сохранялись до конца наблюдения. Во всех группах раны оказались стерильными.
Применение перевязочного материала, им-прегнированного ранозаживляющей композицией с протеолитическим ферментом, оказывает благоприятное воздействие на течение раневого процесса у мышей с инфицированными и "чистыми" ранами. Кроме выраженного противомикробного эффекта перевязочный материал стимулирует более быстрое заживление ран.
Таким образом, перевязочный материал, импрег-нированный ранозаживляющей композицией с протеолитическим ферментом, обладает выраженным противомик-робным действием и оказывает положительное действие на течение раневого процесса у животных как с инфицированными, так и с "чистыми" ранами.
Целесообразно продолжить доклиническое изучение ранозаживляющей композиции с протеолитическим ферментом для определения возможности её использования в качестве эффективного ранозаживляющего средства.
Таблица 3. Динамика клинических проявлений при лечении «чистой» раны у мышей
Группа животных
Срок наблюдения, сут.
2 6 7 8 9
1 группа + - - - -
«Чистая» рана, + - - - -
лечение + + - - -
(8 животных) + + - - -
+
+ -
+ -
+ -
2 группа + + + - -
«Чистая» рана, + + + + -
без лечения + + + - -
(6 животных) + + + + +
+ + +
+ + +
Примечание:+ корочки, инфильтрат отсутствует; - эпителизация.
Работа выполнена при поддержке гранта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры России № 02.740.11.0772 от 12.04.2010
Литература
1. Матюшина Г.П. Создание новых дезинфицирующих салфеток // Фармация. № 6. 2004. С. 32-35.
2. Шаповалов Г.С. Современные раневые покрытия в комбустиологии // фАРМиндексПрактик. 2005. Вып.8. С. 38-46.
3. Казанская Н.Ф., Ларионова Н.И., Торчилин В.П.. Ферменты и белковые препараты в медицине / Биотехнология: под ред.акад. Баева А.А. М.: Наука, 1984. С. 113-125.
4. Москвичев Б.В., Поляк М.С. Иммобилизованные ферменты. СПб: ВНИТИАФ, 1990. С. 65-84.
5. Нынь И.В., Москвичева Я.Б., Иванова Г.П., Та-ратина Т.М. Терридеказа - усовершенствованная лекарственная форма микробного протеолитического фермента // Поликлиника. 2007. № 6. С. 87-89.
6. Нынь И.В., Москвичев Б.В., Иванова Г.П., Тара-тина Т.М. Основные результаты клинических испытаний нового антисептического препарата Катацел ® // Поликлиника. 2007. № 2. С. 62-64.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Медицина, 2000. С. 25-32.
