CC BY
28
ЭКОЛОГИЯ
УДК 577.3
РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ РАСТЕНИЙ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМИ МЕТОДАМИ ПРИ РАЗНЫХ УСЛОВИЯХ ПИТАНИЯ*
Е.П. Пахненко, Н.С. Вацадзе, С.А. Глазунова, В.А. Караваев, А.А. Банков, |М.К. Солнцев
Проведено исследование медленной индукции флуоресценции и термолюминесценции листьев бобов и ячменя на ранних этапах онтогенеза в условиях применения минеральных удобрений и стимуляторов роста. Показано отношение между изменением люминесцентных показателей, характеризующих фотосинтетическую активность, и биомассой растений.
Ключевые слова: фотосинтез, люминесцентные методы, минеральные удобрения, стимуляторы роста.
Введение
В последние годы для изучения функциональной активности фотосинтетического аппарата растений активно используются люминесцентные методы, основанные на регистрации медленной индукции флуоресценции (МИФ) и термолюминесценции (ТЛ) листьев растений. Эти методы позволяют обнаружить те изменения в фотосинтетическом аппарате, которые происходят на самых ранних стадиях внешнего воздействия [3, 9].
Люминесцентные методы применяются для изучения изменений, происходящих в фотосинтетическом аппарате растений при их обработке различными физиологически активными веществами: гербицидами, фунгицидами, антиоксидантами и растительными экстрактами. Однако влияние минерального питания на фотосинтетическую активность растений на ранних стадиях онтогенеза этими методами исследовано недостаточно.
Медленная индукция отражает изменения флуоресценции хлорофилла при освещении листьев, адаптированных к темноте, светом средней интенсивности [15]. Тушение флуоресценции от максимального уровня Р до стационарного значения Т (рис. 1) тесно связано с процессами фотосинтеза и регулируется внешними факторами.
Одним из показателей МИФ является отношение (Рм - ¥т)/¥ъ где ¥м — интенсивность флуоресценции, соответствующая второму максимуму индукционной кривой, ¥т — стационарный уровень флуоресценции. Ранее было установлено [5], что изменения показателя (¥м — ¥т)/¥т при различных воздействиях на растения в процентном отношении соответствуют изменениям фотосинтетической актив -ности листа, оцениваемой по скорости выделения кислорода в расчете на хлорофилл.
В основе термолюминесценции лежит явление свечения вещества, возникающее при его нагревании. Та часть излучения, которая возникает в случае предварительного освещения листьев растений при более низкой температуре, имеет фотосинтетическую природу и связана с рекомбинацией зарядов, стабилизированных на акцепторной и донорной сторонах
Рис. 1. Кривая медленной индукции флуоресценции (МИФ) листьев растений: ¥м — интенсивность флуоресценции хлорофилла в момент достижения второго максимума; ¥т — стационарный уровень флуоресценции
фотосистемы 2 (ФС 2). На рис. 2 это полосы А, В1 и В2 [4]. В диапазоне температур от 40° до 60° может наблюдаться термолюминесценция, имеющая фотосинтетическую природу, а также связанная с термолизом продуктов деструкции мембранных липидов с последующей передачей энергии возбуждения на хлорофилл. При температуре выше 60° фотосинтетический аппарат растений инактивируется [13], поэтому высокотемпературная ТЛ имеет исключительно хемилюминесцентную природу. В работе [11] выска-
*Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 11-03-12129-офи-м-2011).
Рис. 2. Кривая термолюминесценции фотосинтезирующих объектов
зано предположение, что основной вклад в высокотемпературную полосу С вносят реакции продуктов, образующихся в результате деструкции мембран хлоропластов при замораживании, и протекающие только при наличии кислорода. В этих экспериментах интенсивность высокотемпературной ТЛ увеличивалась по мере понижения температуры за счет предварительного охлаждения образцов, а удаление кислорода во время регистрации ТЛ из окружающей образец среды приводило к исчезновению полосы С. Вместе с тем интенсивность полосы С зависела не только от условий эксперимента, но и от условий выращивания растений. Было отмечено, что при прочих равных условиях интенсивность высокотемпературной ТЛ увеличивается при воздействии на растение различных неблагоприятных факторов. Таким образом, был сделан вывод, что величина пика С характеризует устойчивость тканей растений (мембран хлоропластов) к стрессорам [18].
Метод термолюминесценции позволяет определить характер воздействия различных препаратов на первичные процессы фотосинтеза, связанные с функционированием ФС 2, наиболее чувствительной к факторам внешней среды. Усовершенствование методов МИФ и ТЛ необходимо для разработки экспресс-методов оценки физиологического состояния растений в изменяющихся условиях окружающей природной среды [2].
Цель данной работы заключалась в изучении функциональной активности фотосинтетического аппарата растений на ранних стадиях онтогенеза методами МИФ и ТЛ при внесении минеральных удобрений и обработке стимуляторами роста.
Объекты и методы исследования
Вегетационный опыт с почвенной культурой проводили в июне—августе 2010 г. на бобах Vicia faba L. сорта Русские черные и ячмене Hordeum vulgare L. сорта Раушан. В опытах использовали дерново-подзолистую легкосуглинистую почву залежи из слоя 0—10 см. Место отбора образцов — Щелковский р-н Московской обл. Агрохимические характеристики почвы: рНКС1 — 5,1; Р2О5 — 111 мг/кг; К2О — 149;
NO3 — 21,5, NH4 — 47,1 мг/кг. Рентгеновский бесстандартный количественный анализ элементов и оксидов показал, что в ней преобладают кремний, алюминий и кальций.
В первом опыте изучали люминесцентные показатели растений в условиях различного минерального питания. Применяли удобрения: аммиачную селитру, двойной суперфосфат, хлористый калий в дозе 0,1 г д.в./кг почвы. Азот вносили в дозе 0,05 г д.в./кг почвы. Контроль — почва без внесения удобрений. Схема опыта: контроль, NP, NK, PK, NPK. Масса почвы в сосудах — 2 кг, повтор-ность опыта — 3-кратная. Люминесценцию листьев бобов измеряли на 14-е сут. после появления всходов в фазе трех пар листьев, ячменя — на 20-е сут. в фазе второго настоящего листа. Для установления закономерностей в изменении формы кривых МИФ проводили 9 параллельных измерений на разных листьях данного варианта. Для выяснения достоверности влияния минерального питания на показатель МИФ данные измерений были подвергнуты однофакторному (фактор — минеральное питание) дисперсионному анализу.
Во втором опыте использовали стимуляторы роста растений: сверхкритический флюидный экстракт (СКФ) на основе горца сахалинского Reynoutria sa-chalinensis (F. Schmitt) Nakai и коммерческий микробиологический препарат Восток ЭМ-1. Бобы опрыскивали препаратом из горца сахалинского в фазе трех пар листьев. Перед обработкой растений его разводили в 100 мл воды для получения 2%-й суспензии. Растения опрыскивали за два дня до первого измерения люминесцентных показателей. Обработку бобов раствором Восток ЭМ-1 проводили по соответствующим рекомендациям к данному препарату. Для измерения люминесцентных показателей использовали листья второго яруса бобов. Срок вегетации бобов в опытах — 15 дней от момента появления всходов, ячменя — 21 день.
Люминесцентные показатели растений измеряли на кафедре общей физики и кафедре биофизики физического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Описание установки и методика измерения МИФ и ТЛ приведены в работе [1].
Результаты и их обсуждение
В результате полевых и вегетационных опытов установлено, что бобы формируют биомассу в соответствии с уровнем минерального питания. В условиях слабоокультуренных дерново-подзолистых почв вносят «стартовые» дозы азота, так как в начале вегетации слабо реализуется способность проростков к азотфиксации. Основными удобрениями под бобовые культуры являются фосфорные и калийные [8]. Фосфор обеспечивает циклическое и нециклическое фосфорилирование, калий повышает механическую
прочность тканей, способствует передвижению в них питательных веществ, повышает устойчивость к температурному стрессу и соответствующим патогенам [7].
Анализ данных по биомассе показал, что наилучшие условия вегетации бобов на ранних стадиях онтогенеза складывались при внесении трех элементов минерального питания (прибавка к контролю — 17%). Из парных комбинаций элементов наибольшая прибавка биомассы была достоверно зафиксирована в варианте РК (11%, табл. 1).
Таблица 1
Значения (Гм — Рт)/Рт медленной индукции флуоресценции листьев бобов и ячменя и сухая биомасса растений (г/сосуд) в условиях различного минерального питания
Вариант минерального питания
Контроль
ОТ
Ж
РК
ОТК
Бобы
биомасса
5,38 ± 0,17 100%
5,52 ± 0,22 103%
5,55 ± 0,25 103%
5,99 ±0,18 111%
6,31 ±0,11 117%
(рм - Рт)/Рт
0,45 ± 0,03 100%
0,61 ± 0,04 136%
0,53 ± 0,03 118%
0,60 ± 0,03 133%
0,86 ± 0,05 191%
Ячмень
биомасса
0,20 ± 0,03 100%
0,28 ± 0,02 138%
0,23 ± 0,02 113%
0,24 ± 0,01 120%
0,35 ± 0,04 173%
(рм - Рт)/рт
0,42 ± 0,03 100%
0,59 ± 0,04 140%
0,54 ± 0,03 129%
0,55 ± 0,03 131%
0,62 ± 0,04 148%
Ячмень — культура короткого вегетационного сезона, имеет слаборазвитую корневую систему, основные элементы минерального питания потребляет в ранние сроки вегетации, на его развитие позитивно влияет применение стимуляторов роста [6]. Внесение полного минерального удобрения (вариант ОТК) обеспечивает увеличение его биомассы на 73% по отношению к контролю. Из парных комбинаций элементов достоверное увеличение биомассы наблюдалось в варианте КР (38% к контролю, табл. 1).
Внесение в почву минеральных удобрений во всех комбинациях приводило к увеличению значений (Рм — Рт)/Рт в случае бобов, но в разном процентном отношении по сравнению с контролем. При этом для парных комбинаций РК и КР данный люминесцентный показатель возрастал на 33—38, а при внесении полного минерального удобрения — на 91%. Это свидетельствует о росте фотосинтетической активности (скорости выделения О2) у растений, выращенных в почве с внесением минеральных удобрений.
В опыте с ячменем на ранней стадии онтогенеза также было зафиксировано су-
щественное увеличение люминесцентного показателя (¥м — Рт)/Рт во всех вариантах минерального питания (табл. 1). Судя по этому показателю, лучшим следует признать внесение под ячмень азотно-фос-форных (увеличение на 40% по отношению к контролю) и полного минерального (на 48% по отношению к контролю) удобрений, что соответствует данным по биомассе растений.
Характерные кривые термолюминесценции листьев бобов, выращенных в условиях различного минерального питания, представлены на рис. 3. ТЛ с максимумом в области 0° следует рассматривать как полосу А, сдвинутую в область более высоких температур вследствие индивидуальных особенностей растений, выращенных на почве данного типа.
Обращают на себя внимание следующие закономерности:
1. Интенсивность ТЛ в области полосы А для вариантов КР, КК и РК оказывается существенно выше, чем в контроле (в контроле пик А выражен в виде плеча). Ранее было показано [12, 18], что увеличение интенсивности пика А свидетельствует о росте фотосинтетической активности растений. Эти данные согласуются с таковыми, полученными методом МИФ. Для варианта КРК максимум ТЛ полосы А (выражена в виде плеча) смещен в область положительных температур, к 10°. Это указывает на увеличение энергии активации, необходимой для освобождения электронов из «ловушек» на акцепторной стороне ФС 2. Отсюда следует, что в условиях сбалансированного минерального питания можно говорить о снижении эффективности обратных реакций переноса электронов на акцепторной стороне ФС 2. Это в свою очередь приводит к ускорению электронного транспорта между фотосистемами и в конечном итоге — к увеличению фотосинтетической активности.
Рис. 3. Кривые термолюминесценции бобов при внесении минеральных удобрений (полосы А — от -20° до 0°; В — от 0° до +40°; С — от +40° до +60°—+70°)
2. Интенсивность ТЛ в области от 50 до 100° (полоса С) для вариантов МР и МРК ниже, чем в контроле, для варианта МК — такая же, как в контроле, а для варианта РК — даже несколько выше. Снижение интенсивности ТЛ в области полосы С сопровождается уменьшением общей светосуммы (площади под кривой) ТЛ во всем диапазоне температур. Это наглядно видно на примере вариантов МР и МРК. Очевидно, это связано с тем, что в условиях повышенной устойчивости мембран хлоропла-стов к пониженной температуре (об этом свидетельствует менее интенсивная полоса С) накопление зарядов в более глубоких «ловушках» на донорной и акцепторной сторонах ФС 2 при предварительном освещении образцов оказывается менее эффективным, и интенсивность ТЛ в области полос ^ и ^ уменьшается. Следует отметить, что «разгорание» полосы С наблюдалось в вариантах опыта, где применяли калийное удобрение. Можно предположить, что в нашем опыте присутствие аниона хлора снижает физиологичекую значимость калия и негативно влияет на устойчивость мембран хлоропластов к пониженным температурам.
Анализ кривых термолюминесценции листьев ячменя показал их устойчивую однородность по всем вариантам опыта, включая контроль. Небольшое увеличение полосы А наблюдалось только при внесении МК, полоса С на всех вариантах отсутствовала, что, по-видимому, отражает видовые особенности ячменя. Зерновка ячменя имеет высокое содержание фосфора и калия, что обеспечивает устойчивость фотосинтетического аппарата на ранних этапах онтогенеза в широком интервале температур. Периодом максимальной эффективности в питании ячменя является стадия конец кущения—начало трубкова-ния. Измерение люминесцентных показателей злаковых культур на этой стадии онтогенеза оказывается более информативным [3].
Во второй части работы было проведено сравнительное изучение влияния на фотосинтетическую активность двух стимуляторов роста — коммерческого препарата Восток ЭМ-1 и препарата на основе горца сахалинского, полученного экстракцией диоксидом углерода в сверхкритическом состоянии. Впервые СКФ-технологии были применены в 1974 г. для извлечения из кофейных зерен кофеина. В настоящее время в РФ производится более 150 препаратов на основе СКФ-экстрактов из различных видов растений [1]. Преимущество этого метода заключается в сохранении большого количества физиологически активных веществ, зачастую теряемых при других способах экстракции [10].
Листья горца сахалинского богаты различными фенольными соединениями [16, 17, 19]. Стимулирующее действие препаратов на основе горца на фотосинтетический аппарат растений, как предполагается, связано с поступлением в клетки листа физио-
логически активных соединений хиноновой природы, которые увеличивают пул акцепторов электрона фотосистемы 2 [14]. Ранее было установлено, что препарат на основе горца сахалинского, полученный с использованием 2%-го этанола в качестве со-растворителя методом сверхкритической флюидной экстракции, является более эффективным в плане стимуляции фотосинтетической активности по сравнению с полученными другими методами [2]. В полевых опытах, проведенных группой исследователей на поле Московской сельскохозяйственной академии имени К.А. Тимирязева на посевах ячменя Hordeum vulgare L. сорта Михайловский, было показано, что повышение фотосинтетической активности в первые дни после обработки растений препаратами на основе горца сахалинского в фазе конец кущения—начало трубкования приводит к увеличению основных показателей структуры урожая — общей и продуктивной кустистости, массы зерна с колоса и делянки [2, 3].
Таблица 2
Значения (Ем — Еу)/Еу медленной индукции флуоресценции листьев бобов после их обработки препаратом Восток ЭМ-1 и СКФ-экстрактом горца сахалинского
Вариант обработки Срок после обработки растений, сут.
2-е 5-е 8-е
Контроль 0,50 ± 0,03 100% 0,48 ± 0,03 100% 0,63 ± 0,05 100%
Восток ЭМ-1 0,53 ± 0,04 106% 0,48 ± 0,03 100% 0,62 ± 0,05 98%
СКФ-экстракт R. sachalinensis 0,73 ± 0,05 146% 0,57 ± 0,04 119% 0,64 ± 0,05 102%
Измерения медленной индукции флуоресценции листьев бобов проводили на 2-, 5- и 8-й дни после обработки растений. Наибольшее стимулирующее действие на фотосинтетический аппарат (увеличение показателя — Fт)/FT) было зарегистрировано при использовании СКФ-экстракта горца сахалинского на 2-й день после обработки растений (табл. 2). При обработке растений микробиологическим препаратом Восток ЭМ-1 достоверных изменений этого показателя обнаружено не было (табл. 2). По визуальной диагностике и биомассе растения, обработанные микробиологическим препаратом, практически не отличались от контрольных. Биомасса бобов при использовании препарата на основе горца превышала контроль на 23%.
Выводы
Таким образом, можно констатировать, что полноценное минеральное питание бобов и ячменя (вариант МРК) на ранних стадиях онтогенеза существенно стимулирует функциональную активность фо-
тосинтетического аппарата растений, что приводит к росту биомассы. При обработке растений бобов перпаратом на основе сверхкритического флюидного экстракта горца сахалинского наблюдалось увеличение фотосинтетической активности в течение
одной недели после обработки. Достоверных изменений фотосинтетической активности листьев бобов после обработки препаратом Восток ЭМ-1 в данных условиях эксперимента зафиксировано не было.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Водяник А.Р., Шадрин А.Ю., Синев М.Ю. Сверхкритическая флюидная экстракция природного сырья: мировой опыт и ситуация в России // Сверхкритические флюиды. Теория и практика. 2008. Т. 3, № 2.
2. Глазунова С.А. Люминесцентные характеристики растений, обработанных рострегулирующими препаратами: Дис. ... канд. физ.-мат. наук. М., 2009.
3. Гунар Л.Э. Современные методы комплексной оценки действия пестицидов и рострегуляторов на растения: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. М., 2009.
4. Иноу Й, Сибата К. Термолюминесценция фотосинтетического аппарата. Т. 1. Фотосинтез / Под ред. Орт.Д. Говинджи. М., 1987.
5. Караваев В.А. Нелинейные регуляторные процессы в фотосинтезе высших растений: Дис. ... докт. физ.-мат. наук. М., 1990.
6. Пахненко Е.П. Влияние биопрепарата Альбит на продуктивность ячменя и содержание биофильных элементов в урожае // Агрохимия. 2002. № 1.
7. Пахненко Е.П. Роль почвы и удобрений в устойчивости растений к патогенным грибам в агроценозах: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. М., 2001.
8. Плешков Б.П. Биохимия сельскохозяйственных растений. М., 1984.
9. Полякова И.Б. Медленная индукция флуоресценции листьев растений при разной фотосинтетической активности: Дис. ... канд. физ.-мат. наук. М., 2002.
10. Ревельский И.А., Глазков И.Н. О применении СФЭ для получения экстрактов из лекарственных, сельскохозяйственных растений и фармпрепаратов // Сверхкритические флюиды. Теория и практика. 2008. Т. 3, № 2.
11. Солнцев М.К. О природе полосы термолюминесценции фотосинтетических объектов при 40—80°С // Журн. физ. химии. 1989. Т. 63.
12. Юрина Т.П., Умное A.M., Караваев В.А. и др. Физиологические особенности листьев моногенных линий пшеницы, различающихся по устойчивости к стеблевой ржавчине // Физиол. раст. 1988. Т. 35, вып. 3.
13. Allakhverdiev S.I., Feyziev Y.M., Ahmed A. et al. Stabilization of oxygen evolution and primary electron transport reactions in photosystem II against heat stress with glycinebe-taine and sucrose // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1996. Vol. 34.
14. Daayf F., Schmitt A., Belanger R.R. Evidence of phy-toalexins in cucumber leaves infected with powdery mildew following treatment with leaf extracts of Reynoutria sachali-nensis // Plant Physiol. 1997. Vol. 113.
15. Lazar D. Chlorophyll a fluorescence induction // Biochem. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1412.
16. Moyano E, McCullagh M, Galceran M.T., Games D.E. Supercritical fluid chromatography — atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry for the analysis of hydroxyl polycyclic aromatic hydrocarbons // J. Chro-matogr. A. 1997. Vol. 777.
17. Schmitt A., Gansbauer K.H., Vostrowski O.J. et al. Characterization of active compounds in resistance-inducing plant extracts of Reynoutria sachalinensis: Abstr. of the 7th Intern. Congr. of Plant Pathol. Edinburgh, Scotland. 1998.
18. Solntsev M.K., Ekobena H.P.F., Karavaev V.A., Yuri-na T.P. Dynamics of the action of various physical and chemical factors on the thermoluminescence of photosynthetic systems // J. Luminesc. 1998. Vol. 76—77.
19. Vrchotova N, Sera В., Tfiska J. et al. Biologically active compounds as a possible cause of invasibility of knot-weeds (Reynoutria spp.) from Eastern Asia. In: D.V. Alford and G.F. Backhaus (Eds.). Plant Protection and Plant Health in Europe: Introduction and Spread of Invasive Species. Norwich, 2005.
Поступила в редакцию 17.09.2011
THE EARLY PHYSIOLOGICAL STATE DIAGNOSTICS OF PLANTS UNDER VARIOUS NUTRITION CONDITIONS BY MEANS OF LUMINESCENT APPROACH
E.P. Pakhnenko, N.S. Vatsadze, S.A. Glazunova, V.A. Karavaev, A.A. Baikov, I M.K. Solntsevl
The experimental data for the dependence of luminescence intensity of plants photosynthesis on different mineral fertilizers and growth stimulators are presented. The methods include slow fluorescence induction and thermoluminescence at early stages of Vicia faba L. and Hordeum vul-gare L. onthogenesis. The correlations between changes of luminescent characteristics and plant biomass are found.
Key words: photosynthesis, luminescent methods, mineral fertilizers, growth stimulators.
Сведения об авторах
Пахненко Екатерина Петровна, докт. биол. наук, профессор каф. агроинформатики ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8(495)939-50-58. Вацадзе Пина Сергеевна, студентка 5 курса каф. агроинформатики ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8(495)931-38-24; e-mail: vatnina@narod.ru. Глазунова Светлана Андреевна, канд. физ.-мат. наук, ассистент каф. общей физики физического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8(495)939-41-88; e-mail: sglazunova84@yandex.ru. Караваев Владимир Александрович, докт. физ.-мат. наук, профессор каф. общей физики физического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова. Тел.: 8(495)939-41-88; e-mail: karavaev@phys.msu.ru. Байков Алексей Алексеевич, науч. сотр. лаб. физиологии и биохимии растений ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур. Тел.: 8(906)702-79-59; e-mail: lab308@vniissok.ru. | Солнцев Михаил Константинович, канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотр. каф. биофизики физического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова.
