CC BY
31
Микробиология и эпидемиология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 34-40
УДК 579.26+510:514+616.345-008.87-053.2
РАНГОВЫЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСЛЕННОСТИ СООБЩЕСТВ СИМБИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ ТОЛСТОЙ КИШКИ ЗДОРОВЫХ И БОЛЬНЫХ ЛЮДЕЙ РАЗНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП
© 2012 г. А.Н. Варичев 1, И.В. Соловьёва 2, Д.Б. Гелашвили 1
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского 2 Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной
Поступила в редакцию 16.02.2012
С помощью ранговых распределений изучено изменение численности сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки здоровых и больных людей разных возрастных групп. Проведен анализ ранговых распределений при помощи метода кусочно-линейной регрессии. Показано, что у больных людей демаркационное число численности сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки всегда меньше, чем у здоровых людей.
Ключевые слова: микрофлора кишечника человека, ранговое распределение, симбиотические микроорганизмы, кусочно-линейная регрессия, возрастная группа.
Введение
В настоящее время одним из актуальных направлений экологических исследований является изучение видовой структуры сообществ симбиотических микроорганизмов и закономерностей ее организации. Как известно, видовая структура сообществ живых организмов включает в себя анализ числа видов (видовое богатство) и их относительных представленно-стей (видовое разнообразие) [1-4]. По современным представлениям сообщества симбиоти-ческих микроорганизмов, обитающие в кишечнике человека, нередко структурно организованы в биопленки, представляющие собой форму сосуществования микробов в окружающей среде [5]. Так, по имеющимся оценкам в желудочно-кишечном тракте взрослого человека присутствует более 2 кг микроорганизмов, относящихся к сотням разных видов. Из них идентифицированы лишь несколько десятков типичных представителей, которых можно вырастить на питательных средах. Большинство же существующих в природе микроорганизмов на искусственных средах не растет, это так называемые «некультивируемые» микробы. Однако вопрос об экологической структуре сообществ микроорганизмов толстой кишки человека, представленных фиксированным набором клинически значимых культивируемых видов, остается открытым.
Целью работы явился анализ ранговых распределений численности сообществ симбиоти-
ческих микроорганизмов толстой кишки, представленных фиксированным набором клинически значимых культивируемых видов, здоровых и больных людей разных возрастных групп, проживающих на территории Нижнего Новгорода.
Материал и методы
Исходным материалом для настоящей работы послужили экспериментальные данные бактериологических исследований микрофлоры толстой кишки человека, полученные к.м.н. И.В. Соловьевой в лаборатории микробиоценозов и конструирования пробиотиков Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной. Материал на исследование направлялся из 14 лечебно-профилактических учреждений Н. Новгорода. Экспериментальные группы здоровых и больных людей разных возрастных групп были сформированы по следующим критериям включения.
«Здоровые» - лица, обратившиеся в лечебно-профилактические учреждения по поводу профилактического осмотра, и дети во время диспансеризации, в анамнезе которых не было хронической патологии, не имевшие на момент обследования клинических проявлений каких-либо заболеваний и в течение двух месяцев до этого не принимавшие антибактериальные и другие химиопрепараты.
«Больные» - лица, в анамнезе которых на момент обследования отмечались хронические
заболевания в стадии обострения или клинические проявления острой формы, на фоне применения антибактериальных и других лекарственных средств, так и при первичном обращении до назначения этиотропной терапии. В исследование не включались люди, не отвечающие вышеперечисленным критериям. На стадии планирования работы тип исследования был определен как «поперечное» [6].
Все обследованные люди были разделены на 6 возрастных групп: 1) новорожденные в возрасте от 1 часа до 7 суток; 2) новорожденные в возрасте от 8 суток до 1 месяца; 3) дети в возрасте от 2 месяцев до 1 года; 4) дети в возрасте от 2 до 5 лет; 5) дети в возрасте от 6 до 15 лет; 6) взрослые в возрасте от 18 до 30 лет. Экспериментальный материал был получен от 1115 здоровых и больных людей разного возраста.
Использованы результаты микробиологического анализа микрофлоры толстой кишки людей за период с 1981-2007 гг. На протяжении всего периода исследования микрофлора толстой кишки людей изучалась в соответствии с методическими рекомендациями «Бактериологическая диагностика дисбактериоза», утвержденными Минздравом СССР [7]. Метод основан на мерном посеве десятикратных разведений фекалий человека на питательные среды, позволяющие наиболее широко охарактеризовать состав микробных популяций кишечника, включающий 70 родов, 376 клинически значимых видов [8-10]. Следует отметить, что в настоящей работе не использованы данные по частоте выделения Clostridium spp., Rhodococcus spp., Ruminicoccus spp., Helicobacter spp., Streptomyces spp., Eubacterium spp., Nocardia
spp., Aspergillus spp., Mucor spp. и др., так как представления о значении этих микроорганизмов в патологии толстой кишки человека неоднозначны и менялись на протяжении анализируемого периода [11, 12]. Методом экспертных оценок определен набор клинически значимых культивируемых видов, объединенных в 29 фиксированных показателей (фиксированный набор клинически значимых культивируемых видов), характеризующихся количеством микроорганизмов в 1 г фекалий человека (табл. 1).
Восемь из этих показателей учитывают отдельные виды микроорганизмов (Escherichia coli и др.), двадцать один показатель - виды микроорганизмов, сгруппированные по родам (Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. и др.) [8, 13-14].
Результаты обрабатывались в соответствии с рекомендациями по анализу многомерных массивов данных при помощи пакета прикладных программ STATISTICA 8.0 и Microsoft Excel 9.0 для Windows XP.
Результаты и их обсуждение
В работе использованы канонические ранговые распределения [15] и их модификация с фиксацией порядка показателей, задаваемой вектор-строкой «эталонной» группы и сохраняемой для всех последующих групп сравнения (ранговые профили); кроме того, проведен анализ зависимости численности вида микроорганизмов от его ранга методом кусочно-линейной регрессии.
Каноническая модель рангового распределения представляет собой формальную зависи-
Таблица 1
№ п/п Показатели № п/п Показатели
l Bifidobacterium spp. l6 Enterobacter spp.
2 Lactobacillus spp. ll Citrobacter spp.
3 Streptococcus lactis lS Proteus mirabilis
4 Анаэробные кокки l9 Morganella morganii
S Bacteroides spp. 2G Proteus vulgaris
б Escherihia coli (лак+) 2l Providencia spp.
l E. coli (л /д) 22 Hafnia spp.
s E. coli (лак-) 23 Pseudomonas aeruginosa
9 E. coli (гем+) 24 Неферментирующие грамотрицательные бактерии (НГОБ)
lG E. coli (всего) 2S Candida albicans
ll Enterococcus spp. 26 Дрожжевые клетки
l2 Ent. spp. (гем+) 21 Shigella spp.
l3 Staphylococcus epidermidis 28 Salmonella spp.
l4 St. aureus 29 Энтеропатогенная кишечная палочка (ЭПКП)
lS Klebsiella spp.
Фиксированный набор клинически значимых культивируемых видов (показателей), характеризующих микрофлору толстой кишки жителей Н. Новгорода
Рис. 1. Профиль 29 показателей, характеризующих микрофлору толстой кишки здоровых людей разных возрастных групп: а - дети от 1 часа до 7 суток; б - дети от 8 суток до 1 месяца; в - дети от 2-х месяцев до 1 года; г - дети от 2 до 5 лет; д - дети от 6 до 15 лет; е - взрослые от 18 до 30 лет. Порядок показателей задается вектор-строкой для первой возрастной группы и сохраняется для пяти последующих
мость численности вида от его ранга, а параметры моделей представляют собой показатели видового разнообразия. В работе апробированы две модели ранговых распределений: экспоненциальная п = п?- и гиперболическая
П = п /' [16]. Полученные параметры обеих моделей ^ и в) для всех возрастных групп здоровых и больных людей были использованы для расчета теоретических значений числен-ностей микроорганизмов толстой кишки человека и оценки адекватности исследованных моделей.
Проверка адекватности исследованных моделей производилась при помощи показателя детерминации R2. Несколько более высокий коэффициент детерминации характерен для параметра в гиперболической модели: доля случаев, где Щ - Щ > 0, составила 86%. Поэтому в дальнейшем мы использовали гиперболические ранговые распределения симбиотиче-ских микроорганизмов толстой кишки для всех возрастных групп здоровых и больных людей, имеющие характерную убывающую форму. На рис. 1а представлено каноническое ранговое распределение численности симбиотических микроорганизмов толстой кишки здоровых детей в возрасте от 1 часа до 7 суток.
Однако визуальное единообразие канонических ранговых распределений, имеющих характерную убывающую форму, затрудняет сравнительный анализ данных, полученных в разных экспериментальных условиях, например, для здоровых и больных людей, либо в динамике исследования. С этой целью на следующем этапе работы были использованы ранговые профили.
Для сравнительного анализа перестройки ранговых распределений численностей микрофлоры толстой кишки человека в возрастном аспекте был использован прием с фиксацией порядка показателей для «эталонной» группы здоровых и больных, который сохраняется для последующих возрастных групп, так называемые ранговые профили [17].
У больных детей в возрасте от 1 часа до 7 суток (рис. 2б) по сравнению со здоровыми (рис. 2а) этой же возрастной группы наблюдается появление новых видов микроорганизмов. Появляется 4 новых вида: S. lactis (позиция 14), Bacteroides spp., E. coli (гем+) (позиции 16, 17 соответственно) и P. vulgaris (позиция 20).
Известно, что реальные ранговые распределения видовой структуры чаще всего являются квазигиперболическими, и их особенность -наличие немногих обильных видов и большого числа редких видов [15, 18]. Это дает основание
S 7
ц G
= 5
= J
Ïï 3
г
i 1
>10 % 5
— a
=' 7
u 6
I 5
3 *
- 1
'i 3
¡□Г i
1 2 3 it 5 6 7
9 10 11 12 13 14 1516 17 IB 19 20 2122 23 24 2526 27 23 29
12 3 4 5 6 7
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2627 28 29
Ранги (показателе)
1. Echerichia coli (всего)
2. К coir (л'д)
3. E. coli (лак+)
4. Enterococc us spp.
5. Klebsiells spp.
6. E. coli (лак-)
7. Morganella morgan it S. Pro tens mirabilis
9. Lac îo bac rllus spp. 10- Bifidobacterium spp.
11. Staphylococcus epidermidis
12. St aureus
13. Enteroc oc c us spp (гем+)
14. Streptococcus lactis
15. Анаэробные кокки
16. Bacteroides spp.
17. Escherichia coli (гем+) IS. Enterobacter spp.
1?. Citrobacter spp.
20. Proteus vulgaris
21. Prcridencia spp.
22. Hqjnia spp.
23. Pseudomonas aewaginosa
24. НГОБ ffie ферментирующие гр¿неотрицательные бактерии)
25. Candida albicans
26. Дрожжевые клетки
27. Shigella spp.
2S, Salmonella spp.
291. Э1ЖП (Энтеропатогенная кишечная папочка)
Рис. 2. Сравнение профилей 29 показателей, характеризующих микрофлору толстой кишки у здоровых (а) и больных (б) детей в возрасте от 1 часа до 7 суток. Порядок показателей задается вектор-строкой для группы здоровых детей и сохраняется для больных
применить для аппроксимации кусочно-линейную регрессию с точкой разрыва [19]. Такая модель удобна в том случае, когда зависимая переменная (в данном случае численность вида) при достижении некоторого критического значения меняется достаточно резко. Тогда оценивание до критической точки (точки разрыва) производится по одной модели, а после достижения - по другой. С помощью модуля Piecewise linear regression (STATISTICA 8.0) такие оценки можно получить как для наблюдаемых, так и предсказанных значений.
В качестве примера на рис. 3 продемонстрирована кусочно-линейная аппроксимация ранговых распределений предсказанных значений численностей симбиотических микроорганизмов толстой кишки у здоровых детей в возрасте от 8 суток до 1 месяца. Проекция точки пересечения графиков «пойнтер - точка» [20] на ось ординат (шкалу численности микроорганизмов) делит демаркационным числом DN анализируемое сообщество на две совокупности видов с относительно высоким и низким обилием.
В свою очередь, перпендикуляр, опущенный из точки разрыва на ось абсцисс, делит сообщество микроорганизмов демаркационным числом на две совокупности видов с разной скоростью изменения численности при увеличении числа видов. Таким образом, координатная плоскость оказывается разделенной на 4 области. В области 1 находится совокупность видов микроорганизмов, характеризующихся сравнительно высоким обилием и низкой скоростью изменения численности при увеличении числа видов. В области 4 - совокупность видов с относительно низкой численностью микроорганизмов и более быстрым убыванием численности при увеличении размеров сообщества. Каждая совокупность видов микроорганизмов удовлетворительно аппроксимируется линейной функцией с различными коэффициентами наклона: для здоровых детей (рис. 3а) область 1 (уы), область 4 (уи)
ун =-0.15х + 8.12, у2 =-0.42х + 9.91,
Рис. 3. Ранговые распределения предсказанных значений численностей симбиотических микроорганизмов толстой кишки здоровых (а) и больных (б) детей в возрасте от 1 часа до 7 суток, полученные методом кусочно-линейной регрессии
Таблица 2
Наблюдаемые и предсказанные значения демаркационного числа (Б) сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки здоровых и больных людей разных возрастных групп
Возрастные группы Наблюдаемые значения D Предсказанные значения D
здоровые, DNh больные, DNd здоровые, DNh больные, DNd
1 час - 7 суток 7.7 6.4 7.04 6.1
8 суток - 1 месяц 7.7 5.4 6.1 5.01
2 месяца - 1 год 7.5 7.25 7.49 7.15
2-5 лет 7.3 6.3 6.7 5.6
6-15 лет 7.5 6.9 7.11 6.2
18-30 лет 6.4 5.7 7.3 5.9
Критерий Манна-Уитни p = 0.04 p = 0.01
Парный критерий Стьюдента p = 0.01 p = 0.002
для больных детей (рис. 3б) область 1 (yd¡), область 4 (yd2)
ydl =-0.16x + 7.64, yd2 = -0.49x +10.76.
Принципиальным является установленный для всех возрастных групп факт, что у здоровых людей демаркационное число (DNh) всегда статистически значимо больше, чем у больных людей (DNd), так что DNd > DNh (табл. 2) как для наблюдаемых, так и для предсказанных значений численности сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки человека.
Заключение
Использование ранговых профилей позволило наглядно продемонстрировать изменение видового состава симбиотических микроорганизмов толстой кишки человека в возрастном и функциональном аспекте. Применение метода кусочно-линейной регрессии с точкой разрыва для анализа ранговых распределений микрофлоры толстой кишки пациентов всех возрастных групп показало, что у больных людей демаркационное число численности сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки всегда меньше, чем у здоровых людей. Это обстоятельство может быть связано с тем, что, начиная со второй недели жизни и до 30 лет, значение численности сообществ симбио-тических микроорганизмов толстой кишки здоровых людей статистически значимо превышает таковое у больных. Таким образом, применение кусочно-линейной регрессии для анализа канонических ранговых распределений имеет диагностическую перспективу.
Список литературы
1. Одум Ю. Экология. М.: Мир, 1986. Т. 2. 376 с.
2. Margalef R. Human impact on transportation and diversity in ecosystems. How far is extrapolation valid? // Proc. 1st Int. Congr. of ecology. Structure, functioning and management of ecosystems. The Hage, Sept. 8-14, 1974. Centre for Agricultural publishing and documentation: Wageningen, Netherlands, 1975. P. 237-241.
3. Whittaker R.H. Communities and ecosystems. N.Y.; L.: Macmillan, 1970. 162 p.
4. Whittaker R.H. Evolution and measurement of species diversity // Taxon. 1972. V. 21. № 2/3. P. 213251.
5. Осипов Г.А. Биопленка или коллективное сообщество микроорганизмов // Medicus amicus. 2005. № 5. (Интернет-журнал для врачей www.medicusamicus.com).
6. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных
программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2002. 312 с.
7. Эпштейн-Литвак Р.В. Бактериологическая диагностика дисбактериоза // Методические рекомендации. М., 1977. 20 с.
8. Соколова К.Я., Соловьева И.В. Дисбактерио-зы: теория и практика. Н. Новгород: НГМА, 1999. 199 с.
9. Бондаренко В.М. Роль условно-патогенных бактерий кишечника в полиорганной патологии человека. М.: Триада, 2007. 64 с.
10. Дисбиоз кишечника. Руководство по диагностике и лечению / Под ред. Е.И. Ткаченко, А.Н. Суворова. СПб.: ИнформМед, 2009. 276 с.
11. Ипатова М.Г., Шумилов П.В., Осипов Г.А., Ястребова Н.Е., Цимбалова Е.Г. Особенности пристеночной микробиоты при воспалительных заболеваниях кишечника у детей // Матер. 2-го междунар. конгресса по пробиотикам и 6-й Объединенной научной сессии Института гастроэнтерологии и клинической фармакологии СПбГМА им. Н.И. Мечникова. 2009. № 4. С. М56.
12. Osipov G.A., Verkhovtseva N.B. Microecology of environment and human being: Mass-spectrometry and microbial markers approach // Abstr. XXXII international congress of the society for microbial ecology and disease (October 29-30, 2009, St. Petersburg, Russia) // Gastroenterology. 2009. Т. 4. P. A18-A19.
13. Соколова К.Я., Соловьева И.В, Власенко М.А. Микробиоценоз кишечника новорожденных // Вопросы охраны материнства и детства. 1991. № 10. С. 69-70.
14. Диагностика и биокоррекция нарушений антиинфекционного гомеостаза в системе «мать - дитя»: Книга для практического врача / Под ред. Е.И. Ефимова, К.Я. Соколовой. Н. Новгород: НГМА, 2004. 376 с.
15. Левич А.П. Структура экологических сообществ. М.: Изд-во МГУ, 1980. 181 с.
16. Левич А.П., Забурдаева Е.А., Максимов В.Н., Булгаков Н.Г., Мамихин С.В. Поиск целевых показателей качества для биоиндикаторов экологического состояния и факторов окружающей среды (на примере водных объектов реки Дон) // Водные ресурсы. 2009. Т. 36. № 6. С. 730-742.
17. Гелашвили Д.Б, Басуров В.А., Ефимова (За-знобина) Н.И. Эколого-экономический анализ эко-токсикологической опасности промышленных предприятий города Н. Новгорода // Экологический ежемесячник. 2001. № 7(82). С. 22-25.
18. Максимов В.Н., Булгаков Н.Г., Джабруе-ва Л.В. Ранговые распределения размерно-морфологических групп микроводорослей в перифитоне и их связь с уровнем загрязнения водоема // Известия АН. 1997. № 6. С. 697-704.
19. Халафян А.А. STATISTICA 6. Статистический анализ данных. М.: «Бином-пресс», 2007. 512 с.
20. Кудрин Б.И. Мои семь различий от Ципфа // Общая и прикладная ценология. 2007. № 4. С. 25-33.
40
A.H. BapmeB, H.B. ConoBbeBa, ff.E. renarneunu
RANK DISTRIBUTIONS OF THE ABUNDANCE OF SYMBIOTIC MICROORGANISM COMMUNITIES IN THE LARGE INTESTINE OF HEALTHY AND SICK PERSONS
IN VARIOUS AGE GROUPS
A.N. Varichev, I.V. Solovyeva, D.B. Gelashvili
Changes in the abundance of symbiotic microorganism communities in the large intestine of healthy and sick persons in various age groups were studied by means of rank distributions. The analysis of rank distributions was carried out using the method of piecewise-linear regression. It was shown that in sick persons the demarcation number of the abundance of symbiotic microorganism communities in the large intestine was always less than in healthy persons.
Keywords: human intestinal microflora, rank distribution, symbiotic microorganisms, piecewise-linear regression, age group.
