CC BY
24
такие их сочетания, при которых значения веток И не выходили из области допустимых, заранее заданных ограничений.
Отг'лС[^]й ОстохСи]£ Ьтах'\Л- (И)
На основании соотношений был разработан и доведен до машинной реализации алгоритм, результаты расчета которого представлены в таблице.
Анализ полученных результатов свидетельствует, что по мере увеличения шагов идентификации ошибка прогноза уменьшается.
Таким образом, предлагаемый адаптивный алгоритм идентификации может быть использован при
реализации систем управления процессами приемки сырья на перерабатывающих предприятиях.
ЛИТЕРАТУРА
!. Борзенко И.М. Адаптация, прогнозирование и выбор решений в алгоритмах управления технологическими объектами. — М.: с)нергоатомиздат, 1984. — 144 с.
2, Штеннберг Ш.Е, Метод осредненных невязок для рекуррентной идентификации процессов / Вопросы промышленной кибернетики / Тр. ЦНИИКА. — М.: Энергоатомиздат, 1982. — 'Вып. 70. — С. 3-7.
Кафедра автоматизации производственных процессов
Поступила 10.06.93
637.52.002,237:577.15
РАДИОСПЕКТРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ФИЦИНА
Н.М. АКПЕРОВ, О.В. БЕЛОНОГОВА,
Г.И. ЛИХТЕНШТЕЙН, Э.Г. РОЗАНЦЕВ
Московская государственная академия прикладной биотехнологии
Филиал Института химической физики им. Н.Н. Семенова
Фицин млечного сока Ficus Carica является важным ферментом (КФ 3.4.22.3), широко применяющимся в перерабатывающей промышленности ряда стран для тендеризации мясопродуктов, сквашивания молока и осветления напитков [1]. Препарат относительно стабилен в широком интервале значений pH и температур, но его максимальная протеолитическая активность проявляется при pH 7,5 и 62,5°С. Каталитическая природа активного центра фицина [2] исследована недостаточно и нуждается в более глубоком изучении. Для этого избрали современный, хорошо зарекомендовавший себя метод спиновой метки [3j, основанный на анализе сверхтонкой структуры СТС спектров электронного парамагнитного резонанса ЭПР растворов фермента. Его химическую основу составляют реакции свободных радикалов с белком без затрагивания парамагнитного центра (нерадикальные реакции радикалов) [4j.
Изучение поведения парамагнитных центров спинмеченых макромолекул в жидких средах предоставляет уникальную информацию об их структурно-кинетических особенностях, локальной вязкости, непосредственном молекулярном окружении и распределении электростатических зарядов в зонах максимальной локализации неспаренного электрона [5]. Измерение параметров вращательной диффузии и констант скоростей обменной релаксации спиновых меток, ковалентно связанных с активным центром фермента, позволяет глубже понять его конформационное состояние.
В опытах использовался препарат фицина с активностью 5 ТЕ (тирозиновые единицы), полученный по методу Энглунда [6] и дополнительно очищенный нз сефадексе G-25 в 0,1 М фосфатном буфере при pH 8,35. Первую, наиболее активную фракцию фермента, л^пфилизовали. Протеолити-ческую активность препарата контролировали методам Ку“". да [7], используй s качестве субстрату 0Ч5«цй:!к.ый казеин
В качестве спиновой метки использовался п-хлормеркурибензоат 2,2,6,6-тетраметил-4-оксипи-перидин-1-оксила [8] фирмы Реанал. Спинмеченый препарат фицина готовили, используя нерадик^ль-ную реакцию радикала [9] смешением 10 ' М ацетонового раствора л-ХМБ и 5- 10 М раствора фицина в 0,1 М фосфатном буфере (pH 8,35) с последующей инкубацией смеси при комнатной температуре в течение 48 ч._
После удаления непрореагировавшего радикала и неорганических солей с помощью сефадекса С-25 спинмеченый фицин подвергали лиофильной сушке. Степень модификации фермента определяли методом ЭПР по стандартному образцу. Активность модифицированного образца фицина составляла 50% от активности нативного фермента [7].
Измерения проводили на спектрометре ”ЯасНорап”-8Е/Х-2544. Температуру образца поддерживали с точностью 0, Г продуванием азота через термостатированную ячейку (частота модуляции 100 кГц. амплитуда модуляции 0,3 тТ, диапазон 10 тТ).
Время корреляции вращательной диффузии спиновых меток тс определяли по формулам [3]:
2- Ю8 т
,, 3,6-109 (п.
где
г = 1 /тс — величина, условно называемая частотой вращения меток;
/г+, /го и Л--интенсивность компонент спектра
с М - 0, +1 и -1;
А Но — ширина центральной компоненты СТС в тТ.
Выражения (1) и (2) достаточно справедливы для одного типа изотропного вращения метки. В других случаях V является эффективной величиной, характеризующей интенсивность молекулярного движения метки.
Эффективные значения энергии и энтропии активации врашательной диффузии спиновых меток рассчитывали по формуле:
1 / т г —
кТ А 5 эфф Л Н эфф)
"" ехр к Я ехр кТ \ /
. (3)
Для оценки диффузионной доступности парамагнитных центров в макромолекуле был использован метод ’’спиновый зонд — спиновая метка”, в котором роль зонда выполнял феррицианид калия. Наблюдаемое уширение А Но спектров ЭПР спиновых меток в интервале концентраций зонда 10 -10 М связано с константой скорости обменной релаксации соотношением [10]:
АН—6.5 ■ 10 ®/£ГС ,
(4)
где
С — концентрация спинового зонда, М; К,М *-с \
Спектры ЗЯРспинмеченого фицина при pH 5,5 и разных температурах {1 — 293 К; 2 — 313 К; 3 — 343 К) показаны на рис. 1. Легко видеть, что
Рис. 1
СТС этих спектров представляют собой триплеты, характерные для области быстрых вращений. При увеличении температуры соотношение компонент /го и /г- меняется от 6,18 до 2,18, а время корреляции вращательной диффузии меток 1 /Тс( — 1) соответствует '•'■'3' 109. Следует отметить, что фактор анизотропии
<У/Ю7к-~ 1 )/('■'/!()//; | - 1) Для всех исследуемых образцов при выбранных значениях pH и температур остается >0, поскольку центральная компонента триплета имеет наибольшую интенсивность.
Из степени парамагнитной модификации фицина (п = 0,2) и уменьшения его протеолитической активности после модификации на 50% можно заключить, что нерадикальная реакция радикала реализуется преимущественно по НБ-группам активного центра, которые по сравнению с периферийными группами, безусловно, обладают наибольшей реакционной способностью.
Мерой полярности ближнего окружения спиновых меток в растворах служит величина ао (изотропная константа СТВ) и для большинства ими-ноксильных радикалов в растворе од в зависимости от полярности растворителя изменяется от 14,5 до
17.0 гпТ. Для фицина, меченного я-ХМБ, в исследуемом диапазоне pH величина ао соответствует
17.1 гпТ и характерна для иминоксильных спиновых меток в водной фазе.
Таким образом, ’’слабозаторможенные” спектры
Рис. 2
ЭПР я-ХМБ, ковалентно связанного с активным центром фицина, и значение ао позволяют предположить, что НБ-группа активного центра фицина находится на поверхности белковой макромолекулы.
Таблица I
pH кбЮ~8М~1с 1 | кв / 2k.fi 7 2 • \о+ *
5,5 4,62 1,29 3,92
6,5 4,38 1,37 3,84
7,2 5,53 1,08 4,34
8,0 5,49 1,09 4.00
8,3 5,76 1,04 3.84
8,7 5,23 1,15 4,44
£е = 12 • 10“ ЇАГІ.С-1
Зависимость уширения А Но спектров ЭПР спин-меченого фицина от концентрации феррицианида калия при pH 5,5 (а) и 8,3 (°) при 293 К показана на рис. 2. Видно, что она представляет собой прямые, из наклона которых легко находятся константы скорости обменной релаксации (табл. 1). Отсутствие изломов на кривых титрования позволяет предположить, что спиновые метки связываются только с одной НЭ-группой белка. Для характеристики доступности спиновой метки можно использовать параметр микровязкости цм — -кв/2кб, где — константа скорости обменной
релаксации свободного радикала в воде, а кв — иммобилизованного на белке. Как видно из табл. 1, микровязкость в локусе присоединения спиновой метки к фицину близка вязкости воды при pH 7,2-8,3 (доступность метки в этом интервале pH), т.е. увеличивается, что сопровождается повышением подвижности метки^>(+1)^.Таким образом, в интервале pH 7,0-8,3 фермент подвергается конформационной перестройке, увеличивающей доступность НБ-группы его активного центра. Следует отметить, что полученные результаты
удовлетворительно согласуются с кинетическими данными по гидролизу казеина, согласно которым наибольшая константа скорости гидролиза соответствует pH 7,5 [11].
На рис. 3 представлены аррениусовы зависимости параметра вращательной диффузии $с(+1)= 1 /тС(+1))иминоксильного радикала, ковалентно связанного с фицином при pH 5,5 (<з)и 8,0 (б). Измерения проводились при 293 К. Наличие излома на кривых можно объяснить конформаци-онным переходом белка (предденатурационное состояние). Следует отметить, что температура этого перехода зависит от pH и сдвигается в сторону более высоких значений при pH 7,2 и 8,0 (табл. 2), Это согласуется с результатами работы по изучению стабильности фицина [11]. Из аррениу-
совых зависимостей нами оценены эффективные значения энергии А Еэфф и энтропии активации &&эфф вращательной диффузии иминоксильных меток, присоединенных к фицину (табл. 2).
Таблица 2
pH ^эфф ' ккал моль ^•эфф • ККО.-1 моль эк.ед. эн.ед. V
5,5 4,65 3,98 -5 - 7,3 326
6,5 4.18 3,1 -6,65 - 10,2 326
7,2 4,18 3,72 - 6,8 - 8,32 329
8.0 3.95 4,07 - 7,67 - 7,25 332
8,3 4,38 4,65 - 6,88 - 5,95 324
8,7 4.65 4,07 - 5,35 - 7,25 323
Легко заметить, что для спинмеченого фицина при разных значениях pH наблюдается увеличение А Еэфф и АЗэфф (компенсационный эффект). Последний может быть следствием кооперативности водно-белковых взаимодействий, поскольку отражает перестройку водно-белковой матрицы.
ВЫВОДЫ
1. Методом спиновой метки исследована природа активного центра фицина.
2. Представлена динамика конформационных переходов фицина при изменении pH среды.
ЛИТЕРАТУРА
1. Розанцев Э.Г., Акперов Н.М. // Мясная пром-сть. — 1992. — К? 4.
2. Paul D, Boyer. / The Enzymes, 3-rd ed. — 3. — New-York, 1971. — P. 501-546,
3. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. — М.: Наука, 1974.
4. Rozantsev E.G, // Pure and Appl. Chem. — 1990. — 62. — №2, — P. 311-316.
5. Метод спиновых меток, теория и применение: Пер. с англ. / Под ред. Э.Г. Розанцева. — М.: Мир, 1979.
6. Englurid Р.Т., King Т.P., Craig L.C., Walts A. // Biochemistry. — 1968. — 7. — 16.3.
7. Kunitz MX / Methods Enzymol. — 2. — P. 33.
8. Розанцев Э.Г. // Изв. АН СССР, Сер. хим. — 1964. — Вып. 12. — 2187.
9. Розанцев Э.Г. / / Изв. АН СССР, Сер. хим. — 1963. — Вып. 9. — 1669.
10. Гребенщиков Ю.Б., Лихтенштейн Г.И., Иванов В.П., Розанцев Э.Г. // Молек. биол. — 1972. — № 6. — 498.
П. Williams D.C., Sgarbien V.C., Whitaker I.R. Plant Physiol. — 1968. — 43. — 1083.
Кафедра биохимии, пищевой химии и технологии ВМС Кафедра кинетики катализа
Поступим 12.10.92
