CC BY
68
Медицинская Иммунология у*ъsi,уы'i/*'iмо
2003, Т.5, № 5-6, стр 621-624 лхршпиик CUUUiqVHUH
© 2003, СПб РО РААКИ
РАДИОПРОТЕКТОРНАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНОГО IL-1Р В ОТНОШЕНИИ КЛЕГОК-ПРВДШЕСТВЕННИКОВ ГЕМОПОЭЗА
Аксенова Н.В., Гребенюк А.Н., Кетлинский С.А.*, Симбирцев А.С.*, Сидоров Д.А., Тимошевский А.А.
Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова, Санкт-Петербург;
*ГНЦ - Научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург, Россия
Резюме. Рекомбинантный IL-1J3 в условиях профилактического (за 24 ч до радиационного воздействия) применения в дозе 50 мкг/кг предотвращает постлучевое снижение количества эндогенных и экзогенных КОЕ-Сд у облученных мышей. Радиопротекторный эффект препарата в отношении клеток-предшествен-ников гемопоэза проявляется у мышей различных линий, то есть не зависит от радиочувствительности животных. Предварительное введение животным препарата IL-lra в дозе 50 мг/кг полностью отменяет проявления защитного действия рекомбинантного IL-10 в отношении стволовых кроветворных клеток у облученных мышей, что свидетельствует о необходимости участия рецепторов IL-1 в механизмах радиопротек-торного действия данного цитокина.
Ключевые слова:радиопротекторная активность, rIL-1$, гемопоэз, колониеобразующие единицы селезенки.
Aksenova N.V., Grebenyuk A.N., Ketlinskiy S.A., Simbirtsev AS., Sidorov D.A., Timoshevskiy A.A. RADIOPROTECTIVE ACTIVITY OF RECOMBINANT IL-ip CONCERNING HEMOPOIETIC PRECURSORS
Abstract. Recombinant IL-1 (3 preventive (24 h prior to irradiation) application in a dose of 50 mkg/kg prevented postradiational decrease of endogenous and exogenous CFU-S4 levels in irradiated mice. Radioprotective effect of IL-ip concerning hemopoietic precursors, developed in mice of various lines, and it did not depend on their a radiosensitivity. Preliminary introduction of rlL-lra in a dose of 50 mg/kg completely cancels of the protective effect of recombinant IL-1(3 on hemopoietic stem cells in irradiated mice, that testifies the involvement of IL-1 receptors in mechanisms of radioprotective actions of this cytokine. (Med.Immunol., 2003, vol.5, № 5-6, pp 621-624)
Введение дотвратить или ослабить выраженность тех или
Важную роль в патогенезе различных форм ра- ииых проявлений лучевою процесса [2, 10, 13].
диационных поражений играет нарушение цитоки- Известно, что наиболее значимыми последствия-
новой регуляции межклеточных взаимодействий в ми Действия на организм ионизирующего излучения
тканях критических систем. В связи с этим, в после- В Д03ах ОТ 1 до 10 Гр являются изменения в системе
дние годы радиобиологи все чаще обращаются к изу- гемоноэза. С другой стороны, цитокины, в частности
чению состояния цитокинового звена регуляции го- IL-1, являются основными факторами регуляции ге-
меостаза при различных вариантах радиационных мопоэза, а их рекомбинантные препараты уже успеш-
воздействий, а также предпринимают попытки с по- н0 используются в профилактике и лечении различ-
мощыо рекомбинантных препаратов цитокинов пре- ных лейкопенических состояний [6, 15]. Все это от-
крывает новые и весьма перспективные возможнос-
Адрес для переписки • ™ ЦеленапРавлеыного воздействия на эту критичес-
194044, г. Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, д. 6, КУЮ системУ ПРИ радиационных поражениях.
Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова, ® связи с этим, целыо настоящего исследования
кафедра военной токсикологии явилась экспериментальная оценка радиозащитной
и медицинской защиты. эффективности рекомбинантного IL-ip в качестве
Тел ■ (812) 248-34-94 (Ьакс (812) 445-09-98 средства профилактики нарушений гемопоэза при
E-mail: grebenyuk_an@mail.ru ’ действии рентгеновского облучения.
Материалы и методы
Радиопротекторный эффект рекомбинантного IL-1P в отношении ранних предшественников гемо-поэза оценивали на 720 мышах-самцах линий ВALB/ с и F (СВА х С57В1), а также на белых беспородных мышах по методикам эндогенного и экзогенного ко-лониеобразования [14], подсчитывая число выросших на селезенках колоний на 9 сут. после облучения.
В качестве радиопротектора использовали рекомбинантный препарат IL-ip человека (IL-1P), который производится в ГНЦ Государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов (г. Санкт-Петербург). Препарат, растворенный в 0,2 мл дистиллированной воды, мышам всех экспериментальных групп вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мкг/кг (1 мкг/особь) за 24 ч до облучения. Синтезированный в том же институте рецепторный антагонист IL-1 (IL-lra) в дозе 50 мг/кг (1 мг/особь) вводили за 30 мин до применения IL-ip, а также в качестве самостоятельного радиозащитного препарата за 24,5 ч до облучения. Животным контрольных групп в те же сроки внутрибрюшинно вводилась дистиллированная вода в том же объеме.
Облучение животных осуществлялось на установке РУМ-17 кафедры военной токсикологии и медицинской защиты Военно-медицинской академии при следующих условиях: напряжение 180 кВ, сила тока 15 мА, фильтр 0,5 мм Си + 1,0 мм А1, фокусное расстояние 50 см, мощность экспозиционной дозы 2,32 х 10'4 А/кг (54 Р/мин), направление облучения спина-грудь. Дозиметрическое обеспечение экспериментов осуществляли с помощью дозиметра ИД-11 и расчетного метода.
В методике эндогенного колониеобразования мышей распределяли на 7 групп, после чего облучали в дозах 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 и 8,5 Гр, соответственно. На 9 сут после облучения оставшихся в живых мышей с помощью эфирного наркоза подвергали эвтаназии, извлекали селезенки, и подсчитывали число выросших на них колоний (КОЕ-С ).
В методике экзогенного колониеобразования реципиенты облучались в зависимости от исходной линейной радиочувствительности животных: мыши BALB/c - в дозе 7 Гр, белые беспородные мыши - в дозе 8 Гр и мыши F (СВА х С В() - в дозе 8,5 Гр. Через 1 сут. после облучения реципиентов доноров опытных (которым вводили соответствующие препараты) и контрольных групп облучали в дозе 2 Гр, и через 30 мин после этого подвергали эвтаназии под эфирным наркозом. Костный мозг, извлеченный из бедренных костей доноров и затем разведенный в среде 199, вводили в хвостовую вену реципиентов в количестве 105 клеток. На 9 сут. после облучения оставшихся в живых реципиентов забивали и подсчитывали число выросших на их селезенках колоний (КОЕ-С).
Все эксперименты проводились дважды, результаты двух аналогичных экспериментов суммировали.
Полученные в ходе экспериментальных исследований данные подвергали стандартной статистической обработке с расчетом среднего значения и ошибки средней. Оценку различий средних значений проводили с использованием Г-критерия Стьюдента. Вероятность р < 0,05 и выше считали достаточной для вывода о статистической достоверности различий полученных данных. Обработка результатов проводилась на персональном компьютере с использованием стандартных статистических программ.
Результаты и обсуждение
В результате проведенных исследований установлено, что рекомбинантный 1Ь-1Р обладает выраженной радиопротекторной активностью в отношении клеток-предшественников гемопоэза у облученных мышей.
Как видно из данных, представленных в таблице
1, в условиях профилактического (за 24 ч до радиационного воздействия) применения при всех изученных дозах облучения рекомбинантный 1Ь-1Р предотвращал снижение количества эндогенных КОЕ-Сд у облученных мышей. Статистически значимых отличий по сравнению с контролем (радиационным воздействием без предварительного введения рекомбинантного 1Ь-1р) данный показатель достигал при облучении животных в дозах 7,0 и 7,5 Гр (ЬО ). При действии более высоких доз - 8,0 и 8,5 (Ц) )
Г 4 90-100/30'
- только предварительное внутрибрюшинное введение препарата позволяло обнаружить рост колоний па селезенках облученных мышей.
Все это приводило и к тому, что под влиянием профилактического введения рекомбинантного 1Ь-1Р возрастало значение - расчетного критерия
радиочувствительности стволовых кроветворных клеток, определяемого как доза, облучение в которой снижает число сохранивших жизнеспособность клеток в е раз (2,72 раза). В частности, при оценке в методике эндогенного колониеобразования величина Б с применением 1Ь-1Р составила 1,81 Гр, а без применения препарата - лишь 1,57 Гр.
Защитный эффект препарата в отношении клеток-предшественников гемопоэза определялся и при проведении исследований в методике экзогенного колониеобразования.
В частности, профилактическое (за 24 ч до облучения) внутрибрюшинное введение рекомбинантного 1Ь-1р в дозе 50 мкг/кг позволяло в значительной степени предотвратить постлучевое снижение числа экзогенных КОЕ-С у облученных мышей (табл. 2). При этом радиозащитный эффект препарата в отношении клеток-предшественников проявлялся вне зависимости от радиочувствительности различных линий мышей. Интересно и то, что уже само по себе введение рекомбинантного 1Ь-1р существенным об-
2003, Т. 5, № 5-6
Радиопротекторная активность г!Ь-1$
разом стимулировало рост колонии на селезенках интактных животных.
По мнению большинства исследователей, механизм радиозащитного действия препаратов 1Ь-1 в значительной мере связан со способностью данного цитокина в норме и, особенно, при развитии патологических состояний оказывать стимулирующее вли-
яние на клетки-предшественники гемопоэза [4, 11].
По мнению ряда исследователей, биологическое действие П.-1 направлено, в основном, на стимуляцию пролиферативной активности стволовых кроветворных клеток наиболее ранних стадий развития [7,9]. Это положение подтверждается тем, что под влиянием 1Ь 1 в тестах эндогенного и экзогенного колониеобразо-
Табл. 1. ВЛИЯНИЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО (ЗА 24 ч ДО РАДИАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ) ВНУГРИБРЮШИННОГО ВВЕДЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО И-1 р В ДОЗЕ 50 МКГ/КГ НА КОЛИЧЕСТВО К0Е-С9 У ОБЛУЧЕННЫХ БЕЛЫХ БЕСПОРОДНЫХ МЫШЕЙ В МЕТОДИКЕ ЭНДОГЕННОГО К0Л0НИЕ0БРА30ВАНИЯ (М±т)
Доза облучения, Гр Условия воздействия
облучение ІЬ1Р + облучение
5,5 7,3 ±1,7 10,8 ±2,4
6,0 5,3 ±1,0 6,0 ± 1,8
6,5 4,6 ±0,9 5,5 ±0,8
7,0 2,1 ±0,7 5,2 ±1,2*
7,5 1,4 ±0,8 3,3 ±0,7*
8,0 Животные погибли 2,2 ±1,2
8,5 Животные погибли 2,0 ±1,0
Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с облучением.
Табл. 2. ВЛИЯНИЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО (ЗА 24 ч ДО РАДИАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ) ВНУГРИБРЮШИННОГО ВВЕДЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО И-1 (3 В ДОЗЕ 50 МКГ/КГ НА КОЛИЧЕСТВО К0Е-Сд У ОБЛУЧЕННЫХ БЕЛЫХ БЕСПОРОДНЫХ И ЛИНЕЙНЫХ МЫШЕЙ В МЕТОДИКЕ ЭКЗОГЕННОГО К0Л0НИЕ0БРА30ВАНИЯ (М+т)
Условия
Линия мышей
воздействия ВАІ.В/С Белые беспородные Р, (СВА X С57ВІ)
И-1Р облу- чение Число мие-локарио-цитов, X 106/бедро Число КОЕУСд Число миело-кариоцитов, х 106/бедро Число КОЕ/С9 Число миелока-риоцитов, х 106/бедро Число КОЕ/С9
в 1 бедре на 10вмие-локарио-цитов в 1 бедре на 10е миелока-риоцитов в 1 бедре на 10° миелока-риоцитов
- - 18,5 80 ±8 4,1 ±0,5 18,0 220 ± 56 24,4 ±6,1 21,0 358 ± 19 18,0 ±1,1
- + 18,2 11 ± 1 0,6 ±0,2 18,4 80 ±32 8,7 ±3,2 20,5 38 ±8 1,2 ±0,2
+ + 18,5 32 ± 3 * 1,7 ±0,3* 20,0 164 ±29* 15,4 ±3,0* 20,0 107 ±12* 5,2 ± 0,3 *
+ - 18,0 320 ± 34 17,7 ±2,0 18,4 400 ± 94 43,4 ± 9,9 19,3 404 ± 21 22,5 ± 0,2
Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с облучением.
Табл. 3. ВЛИЯНИЕ И-ШАВ ДОЗЕ 50 МГ/КГ НА РАДИОПРОТЕКГОРНУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНОГО И-1Р В ДОЗЕ 50 МКГ/КГ В ОТНОШЕНИИ КОЛИЧЕСТВА КОЕ-Сд У ОБЛУЧЕННЫХ МЫШЕЙ ЛИНИИ Р, (СВА X С57ВЦ В МЕТОДИКЕ ЭКЗОГЕННОГО КОЛОНИЕОБРАЗОВАНИЯ (М±т)
Схема воздействия Число миелокариоцитов, х 106/бедро Число КОЕ-Сд
11.-1 га И-1Р облу- чение в 1 бедре на Ю6 миелокариоцитов
- - - 20,5 160 ±19 6,5 ±1,1
— — + 19,5 48 ±8 2,5 ±0,2
_ + + 22,0 72 ±12* 3,2 ± 0,3 *
+ + + 20,0 40 ±7 2,0 ±0,6
Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с облучением.
вания определялось увеличение количества КОЕ-С12, а число КОЕ-С оставалось практически не измененным [1]. Под влиянием 1Е-1 в костном мозге наблюдается также увеличение количества поздних клеток-предшественников, однако этот процесс происходит, в основном, за счет их пополнения из числа ранних стволовых кроветворных клеток [3,5].
Показано также, что большинство биологических эффектов 1Ь-1 реализуется путем его непосредственного действия на соответствующие рецепторные структуры [8,12]. Однако прямых доказательств участия рецепторов 1Ь-1 в путях реализации его радио-защитного эффекта до настоящего времени не было получено. Это и послужило основанием для проведения следующего этапа исследования, в ходе которого изучалось влияние IЬ-1 га на радиозащитную эффективность рекомбинантного 1Ь-1Р (табл. 3).
В результате проведенных исследований было установлено, что предварительное введение животным препарата 1Ь-1га в дозе 50 мг/кг полностью отменяло проявления защитного действия рекомбинантного 1Ь-1Р в отношении клеток-предшественни-ков гемопоэза у облученных мышей, что свидетельствует о необходимости участия рецепторов 1Ь-1 в механизмах радиопротекторного действия данного цитокина.
Выводы
1. Рекомбинантный II.-1(3 в условиях профилактического (за 24 ч до радиационного воздействия) применения в дозе 50 мкг/кг предотвращает пост-лучевое снижение количества эндогенных и экзогенных КОЕ-Сд у облученных мышей.
2. Радиопротекторный эффект рекомбинантного 1Ь-1Р в отношении клеток-предшественников гемопоэза проявляется у мышей различных линий, то есть не зависит от радиочувствительности животных.
3. Предварительное введение животным препарата 1Ь-1га в дозе 50 мг/кг полностью отменяет проявления защитного действия рекомбинантного 1Ь-1Р в отношении стволовых кроветворных клеток у облученных мышей, что свидетельствует о необходимости участия рецепторов 1Ь-1 в механизмах радиопротекторного действия данного цитокина.
Список литературы
1. Громыхина Н.Ю., Орловская И.А., Дубинина Л.В., Козлов В.А. Участие стволовой кроветворной клетки в механизмах иммуностимулирующего эффекта интерлейкина-1 у мышей // Иммунология. -1995. - № 2. - С. 29-33.
2. Рождественский Л.М. Цитокины в аспекте патогенеза и терапии острого лучевого поражения // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1997. - Т. 37, вып. 4(6). - С. 590-596.
3. Casparetto С., Laver S., Abdoud М. Effects of interleukin-1 on hematopoietic progenitor. Evidence of stimulatory and inhibitory activities in a primate model // Blood. - 1989. - Vol. 74, № 2. - P. 547-550.
4. Constine L.S., Harwell S., Keng P. Interleukin-1 alpha stimulates hemopoiesis but not tumor cell proliferation and protects mice from lethal total body irradiation // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. - 1991. - Vol. 20. - P. 447-456.
5. Dalmau S. R., Freitas C. S., Tabak D. G. Interleu-kin-1 and tumor necrosis factor-alpha as radio and chemo protectors of bone marrow // Bone Marrow Transplant. - 1993. - Vol. 8, № 12. - P. 551 - 554.
6. Dinarello C.A. The biological properties of inter-leukin-1 // Eur. Cytokine Netw. - 1994. - Vol. 5, № 3. -P. 517-531.
7. Fibbe W.E., Falkenburg J.H. Regulation of hemopoiesis by interleukin-1 //Biotherapy.- 1990.-Vol.
2, № 3. - P. 325-330.
8. Hestdal K., Jacobsen E.W., Ruscetti F.W. et al. In vivo effects of interleukin-la on hemopoiesis. Role of colony stimulating factor receptor modulation // Blood.
- 1992. - Vol. 80, № 2. - P. 2486-2494.
9. Moore M.A., Munch M.O., Warren D.J., Laver J. Cytokine networks involved in the regulation of hemopoietic stem cell proliferation and differentiation // Ciba Found Symp. - 1990. - Vol. 148, № 2. -P. 43-58.
10. Neta R. Modulation of radiation damage by cytokines // Stem. Cells. - 1997. - Vol. 15, Suppl. 2. - P. 87-94.
11. Neta R., Stein M.B., Oppenheim J.J. et al. The in vivo effects of interleukin-1. Bone marrow cells are induced to cycle after administration of interleukin-1 //J. Immunol. - 1987. - Vol. 139, № 6. - P. 1861-1866.
12. Rodriguez C., Lacasse C., Hoang T. Interleukin-lb suppressed apoptosis in CD34 positive bone marrow cells through activation of the type I IL-1 receptor // J. Cell. Physiol. - 1996. - Vol. 166, № 3. _ p. 387-395.
13. Testa N.G. Cytokines and hematological response to radiation // Int. J. Radiat. Biol. - 1991. - Vol. 60, № 6. - P. 940.
14. Till J.E., Me Culloeh E.A. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. // Radiat. Res. - 1961. - Vol. 14, № 2. - P. 213-222.
15. Trotta P.P. Cytokines: an overview // Am. J. Reprod. Immunol. - 1991. - Vol. 25. - P. 137-141.
поступила в редакцию 16.07.2002 принята к печати 04.02.2003
