CC BY
70
Гемопоэтические показатели при остром облучении мышей, подвергнутых терапии сополимером N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина
Панов А.В.1, Изместьева О.С., Селиванова Е.И., Кедик С.А.1, Яковлева Т.А.1, Жаворонков Л.П.
МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, Обнинск;
1 ЗАО «Институт фармацевтических технологий», Москва
Получены данные о состоянии гемопоэза и выживаемости мышей после острого облучения в дозах 7 и 8,5 Гр с оценкой морфофункциональных показателей клеток периферической крови и костного мозга. Проведено изучение противолучевых свойств сополимера N-винилпирро-лидона и 2-метил-5-винилпиридина при внутримышечном введении препарата (500 мг/кг) и двух схемах его использования: за 20 минут до облучения и через 20 минут после облучения при разных поглощённых дозах. В экспериментах на 280 самцах мышей линии C57Bl/6j показано, что применение сополимера при всех использованных схемах введения сопровождается противолучевым эффектом. При облучении животных в абсолютно летальной дозе (8,5 Гр) средняя продолжительность жизни подопытных мышей увеличивается на 40%. Со стороны гемопоэза радиомодифицирующее действие препарата выражается в 5-6 кратном повышении клеточности костного мозга и абсолютного содержания гемопоэтических стволовых клеток (7 Гр) со значительным выходом в кровь зрелых и пролиферирующих клеток. С учётом полученных данных изучаемый сополимер, по-видимому, можно отнести к группе ра-диомитигаторов, действие которых реализуется через активацию ряда провоспалительных сигнальных путей и усиление секреции гемопоэтических ростовых факторов.
Ключевые слова: острое облучение, сополимер N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина, автоматический гематологический анализатор, проточный цитофлуо-риметр, мыши линии C57Bl/6j, лейкоциты, гранулоциты, гемопоэтические стволовые клетки, каталаза, супероксиддисмутаза.
Введение
Фармакологические средства на основе синтетических ионогенных полимеров представляют большой интерес для фармации и медицины [1-7]. К таким соединениям относятся полимеры на основе мономеров винилпиридинового ряда, обладающие интересными биотропными свойствами, в том числе, иммуномодифицирующей активностью [8-12]. Анализ литературных данных свидетельствует о возможном смягчении эффектов ионизирующего излучения in vivo при воздействии подобных иммуноадъювантных субстанций, в том числе при хроническом внутреннем облучении [13]. Однако проведённые исследования носили достаточно узкий и несистематический характер. В связи с этим целью настоящей работы является выявление возможной противолучевой активности ионогенных синтетических полимеров (сополимеров N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина) при остром облучении in vЫо по показателям кроветворной системы мышей.
Материалы и методы
Животные. В экспериментах использовано 280 мышей-самцов линии C57Bl/6j в возрасте 1,5-2,0 месяца с массой тела 18-20 г, содержавшихся в стандартных условиях и на стандартном рационе на основе брикетированных кормов. Мышей распределяли на группы методом рандо-
Панов А.В. - директор по науке, к.х.н.; Кедик С.А. - ген. директор, д.т.н., проф.; Яковлева Т.А. - научн. сотр. ЗАО «Институт фармацевтических технологий». Изместьева О.С. - вед. научн. сотр., к.б.н.; Селиванова Е.И.* - ст. научн. сотр., к.б.н.; Жаворонков Л.П. - зам. директора по научн. работе, д.м.н. МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России. •Контакты: 249036, Калужская обл., Обнинск, ул. Королева, 4. Тел.: (484) 399-71-88; e-mail: [email protected].
мизации. Все работы с животными выполняли в соответствии с требованиями нормативно-правовых актов о порядке экспериментальной работы и гуманном отношении к животным [14].
Вводимое вещество. Сополимеры N-винилпирролидона с 2-метил-5-винилпиридином синтезировали радикальной сополимеризацией при постоянном соотношении мономеров в реакционной массе, обеспечиваемом периодическим введением смеси исходных мономеров [12]. Выделенный и очищенный сополимер представляет собой белый порошок, содержащий 35 мольных %, состоящих из звеньев 2-метил-5-винилпиридина, и характеризующийся средневяз-костной молекулярной массой 43000 Да.
Условия облучения. Тотальное облучение животных осуществляли в контейнерах из оргстекла у-лучами 60Со на терапевтической установке «Луч» (Россия), однократно, в дозах 7,0 и 8,5 Гр, при мощности поглощённой дозы 34,75 сГр/мин. Дозиметрические измерения проводили клиническим дозиметром типа 27012 (Veb RFT Messellktronik «Otto Schon», Германия). Доверительный интервал погрешности измерения при вероятности 0,95 не превышает 9%. При каждой дозе радиационного воздействия было сформировано 5 групп (по 10-14 мышей в каждой): интактный контроль, сополимер, облучение, сополимер + облучение (защитный вариант), облучение + сополимер.
Для анализа радиопротекторных свойств сополимер в дозе 500 мг/кг вводили мышам в/м в объёме 0,2 мл за 20 минут до начала облучения, при изучении лечебного эффекта - в той же дозе через 20 минут после окончания лучевого воздействия.
Оценку радиозащитной и терапевтической эффективности препарата осуществляли по критериям 30-суточной выживаемости и средней продолжительности жизни животных всех экспериментальных групп, а также анализировали по комплексу параметров состояние гемопоэза и ферментативного звена антиоксидантной системы.
Анализ количественных и морфологических характеристик зрелых клеток периферической крови лабораторных мышей всех экспериментальных групп проводили на автоматическом гематологическом анализаторе Abacus junior vet, Diatron (Австрия). С этой целью у части мышей на 6-е сутки после облучения производили забор крови из синуса глаза по 0,25 мл в специальные одноразовые пробирки с ЭДТА (Aquisel® Tube). Во всех экспериментальных группах оценивали содержание эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, морфологическую гетерогенность эритроцитов и тромбоцитов, определяли концентрацию гемоглобина, гемато- и тромбокрит, а также активность основных ферментов антиоксидантной системы и содержание гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в крови и костном мозге, выделенном из бедренной кости тотчас после эвтаназии животных путём цервикальной дислокации.
Определение активности супероксиддисмутазы (СОД). Активность СОД в гемолизате крови (разведение 1:300) оценивали спектрофотометрическим методом (спектрофотометр «UNICO 2804», США) при длине волны 420 нм. Метод основан на торможении ферментом ауто-окисления кверцетина, вызванного анион-радикалом (О-2) [15]. Полученные результаты выражали в количественном содержании очищенного фермента (пг на 1 эритроцит) [16] и в процентном соотношении к исходному уровню.
Определение активности каталазы. Активность каталазы в гемолизированной крови определяли спектрофотометрически общепринятым методом при длине волны 420 нм. Принцип определения основан на способности перекиси водорода образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс [16]. Активность каталазы эритроцитов выражали в коли-
честве утилизированной перекиси водорода в пикакаталях (мкмоль за 1 мин) на один эритроцит, пкат/эритроцит. С этой целью гемолизат крови разводили таким образом, чтобы в реакционную смесь попадало 106 эритроцитов.
Определение ГСК. ГСК выявляли в костном мозге и крови мышей по высокой экспрессии CD34 и низкой экспрессии CD45 с помощью проточной цитометрии после инкубации образцов с соответствующими антителами и ДНК-связывающим красителем Хехст 33342 («Sigma», USA). Использовали моноклональные антитела к CD34, меченные фикоэритрином (ФЭ), и CD45, меченные флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) («eBioscience», США). Анализировали пробы на проточном цитофлуориметре FACS Vantage (BDIS, USA) в течение часа после окрашивания. Использовали двухлазерную систему: флуоресценцию ФИТЦа и ФЭ возбуждали с помощью лазерного пучка с длиной волны 488 нм (Spectra Physics, USA); флуоресценцию Хехста 33342 -с помощью лазера 364 нм (Coherent Enterprise, USA). Для измерения флуоресценции ФИТЦа использовали узкополосные фильтры 530/30 нм, ФЭ - 585/30 нм, Хехста 33342 - 424/20 нм. Мощность первого лазера (488 нм) составляла 56 мВт, мощность второго лазера (364 нм) - 10 мВт. В каждом образце анализировали до 100000 клеток, данные сохраняли в файл и затем обрабатывали с помощью программы CellQuestPro (BDIS, USA). Определяли относительное количество (%) CD45lowСD34+Хехст+ (в дальнейшем - CD45lowСD34+) ГСК. Затем рассчитывали абсолютное количество ГСК (число клеток/л крови или на бедро), исходя из общей концентрации ядросодержащих клеток в каждом образце.
Статистика. Были определены средние арифметические значения показателей, их стандартные ошибки, медианы и квартили. Для оценки значимости межгрупповых различий использованы параметрические критерии (t-критерий Стьюдента, F-критерий Фишера) и непараметрические (Вилкоксона - Манна - Уитни (U), медианный критерий кси-квадрат и ранговый критерий Вардена) [7]. Различия между группами признавали статистически значимыми при значении интеграла вероятности p, не превышающем 0,05.Статистический анализ проводился с помощью программ Origin 6.0 («MicroCal Software», США) и «Statistica 6.0» (StatSoft, Inc.).
Результаты и обсуждение
Как видно из результатов, представленных в табл. 1, через 30 мин после однократного внутримышечного введения сополимера в дозе 500 мг/кг в периферической крови животных наблюдается рост общего количества лейкоцитов, преимущественно за счёт гранулоцитов. Через 6 суток на фоне сохранившегося лейкоцитоза у мышей этой группы регистрируется снижение количества гранулоцитов и повышение количества лимфоцитов. В состоянии ферментативного звена антиоксидантной системы через 30 мин после однократного введения препарата в указанной дозе отмечается незначительный рост активности супероксиддисмутазы и катала-зы (рис. 1). Реакцию подобного типа можно расценить как отклик на манипуляцию, связанную с проведением эксперимента. Однако через 6 суток после инъекции в антиоксидантной системе регистрируется отчётливый сдвиг функционирования основных ферментов, выразившийся в диссоциации их активности: повышении активности супероксиддисмутазы и снижении активности каталазы.
При изолированном воздействии у-лучами в дозе 8,5 Гр у облучённых животных на 6 сутки регистрируется глубокая лейко- и тромбоцитопения, а в эритроидном ростке кроветворения отмечаются признаки развития гипохромной анемии (табл. 1). На этом фоне отмечается выра-
женное опустошение костного мозга, регистрируемое по снижению клеточности костного мозга. Радиационное воздействие в поглощённой дозе 8,5 Гр вызывает 100% гибель облучённого контроля (табл. 2) в течение первых 10 дней после облучения. В состоянии антиоксидантной системы у этих животных регистрируется нарушение в функционировании основных ферментов, проявившееся в диссоциации их активности: выраженное повышение активности супероксид-дисмутазы и снижение активности каталазы. Выявленные отклонения в функционировании ферментов являются более глубокими, чем при изолированном воздействии сополимера. При всех использованных схемах применения испытуемого соединения у животных, облучённых в дозе 8,5 Гр, в пострадиационном периоде на 6 сутки не наблюдается отчётливого восстановления показателей гемопоэза и антиоксидантной системы. С учётом известных радиобиологических закономерностей лучевого поражения и временных параметров восстановления полученные данные вполне ожидаемы. Тем не менее, можно лишь говорить о тенденции к проявлению радиотерапевтического действия при использовании схемы: облучение + сополимер. В этой группе животных на 11-е сутки после острого воздействия у-лучами регистрируется 52,8% выживаемость (при 100% гибели в группе «облучение»), и на 6-е сутки после лучевого воздействия отмечается незначительный рост количества лейкоцитов, снижение степени анемии и тенденция к восстановлению функционирования индикативных ферментов антиоксидантной защиты. Средняя продолжительность жизни погибших животных в этой группе оказалась значимо выше по сравнению с облучённым контролем и группой сополимер + облучение. Этот более длительный период выживания на фоне резкой панцитопении в крови и костном мозге был отмечен и ранее у полимерных препаратов подобного строения [5]. Возможно, имеет значение их иммуномодулирующая активность. Изолированное радиационное воздействие в дозе 7,0 Гр, при которой погибает около 20% животных, вызывает меньшие нарушения в состоянии гемопоэза и антиоксидантной системы, чем доза 8,5 Гр (табл. 3, рис. 2).
Таблица 1
Основные показатели (М±т) периферической крови и клеточности костного мозга мышей-самцов линии С57Б1/6] при оценке противолучевых свойств сополимера
(500 мг/кг)
Показатели Группы
Интактный контроль Сополимер 6-е сутки после облучения в дозе 8,5 Гр
Через 30 мин Через 6 суток Облучение Облучение + сополимер Сополимер + облучение
Лейкоциты, х109/л 6,61±0,95 10,7±1,9* р<0,047 10,3±1,5* р<0,042 0,16±0,02* р<0,00005 0,87±0,34*¥ р<0,00004 0,41 ±0,15* р<0,00004
Лимфоциты, х109/л 4,63±0,72 5,8±0,89 6,90±0,76* р<0,04 0,08±0,01* р<0,00005 0,43±0,12*¥ р<0,0001 0,20±0,09* р<0,0001
Гранулоциты, х109/л 1,77±0,28 4,26±1,02* р<0,007 3,0±0,7 р<0,11 0,08±0,01* р<0,00005 0,44±0,11* р<0,0001 0,22±0,10* р<0,0001
Эритроциты, х1012/л 9,8±0,5 9,5±0,6 9,7±0,1 7,3±0,7 8,7±0,2 8,0±0,9
Гемоглобин, г/л 143±4 146±9 150±2 111 ±12* р<0,02 133±3 р<0,08 116±14* р<0,05
Тромбоциты, х109/л 309±67 429±23 452±75 54±8* р<0,003 72±15* р<0,006 59±8* р<0,004
Тромбокрит, % 0,18±0,04 0,24±0,01 0,23±0,04 0,031 ±0,005* р<0,003 0,046±0,007* р<0,007 0,033±0,007* р<0,006
Клеточность костного мозга, х106/бедро 18,5±1,2 19,2±1,3 18,8±1,4 0,78±0,34* р<0,0001 0,29±0,05* р<0,0001 0,29±0,04* р<0,0001
Примечания: * - статистически значимые различия по сравнению с группой «контроль»;
V - статистически значимые различия по сравнению с группой «облучение», в группах по 10-12 животных.
250 -
2 200
2 150-1 >>
£ о
X
t
2 100
50 -
t
i
Сополимер 30 минут
Облучение ♦со полимер
гЬп
§ * Г^-
сод сод
ш ш
Сополимер ♦облучение
Рис. 1. Изменение активности (М±т) супероксиддисмутазы и каталазы при изолированном назначении сополимера (препарата) в дозе 500 мг/кг и в сочетании с гамма-воздействием в дозе 8,5 Гр. Примечание: * - статистически значимые различия при сравнении с контролем.
Оценка противолучевых эффектов сополимера по тесту 30-суточной выживаемости (%) при разных схемах его введения
Таблица 2
Сутки после воздействия Сополимер Y-облучение 8,5 Гр Сополимер + облучение Облучение + сополимер
6 100 69,2±5,8 66,1 ±8,9 91,1 ±0,6
7 100 51,7±15,1 57,2±9,5 86,3±5,3
8 100 29,2±29,2 41,6±8,3 83,2±2,1
9 100 16,7±16,7 36,9±13,1 73,1 ±1,8
10 100 16,7±16,7 29,7±20,3 64,7±6,7
11 100 0 16,7±16,7 52,8±5,2
12 100 0 12,5±12,5 48,8±1,2
13 100 0 12,5±12,5 36,9±13,1
14 100 0 12,5±12,5 20,9±20,9
15 100 0 12,5±12,5 12,5±12,5
16 100 0 0 0
Средняя по группе продолжительность жизни, дни (М±т) 8,6±0,6 8,1 ±0,9 11,5±1,2 u
Примечание: u - достоверные различия по U-критерию Вилкоксона - Манна - Уитни, в группах по 8-10 мышей.
180 -
160 -
2 140 -
С
о
н 120 -о
* 100 -
2
о
гЕ 80 -
£
то
if 60 -X
V
„о 40 -20 -О -
ш
ш
ж
ж
Контроль Сополимер
в СуТЕИ
Облучение Облучение
+СОПОЛИ м ер
Ж
1
Соголим ер +облучение
Рис. 2. Изменение активности (М±т) супероксиддисмутазы и каталазы у облучённых мышей в дозе 7,0 Гр в сочетании с сополимером (препарат) в дозе 500 мг/кг. Примечание: * - статистически значимые различия при сравнении с контролем.
Таблица 3
Основные показатели (М±т) периферической крови и клеточности костного мозга мышей 057Б!/6] при применении сополимера при дозе 7 Гр
Показатели Группы
Контроль 6-е сутки после облучения в дозе 7,0 Гр
Облучение Облучение + сополимер Сополимер + облучение
Лейкоциты, х109/л 6,29±0,93 0,45±0,08* р<0,0005 1,14±0,37¥ 0,98±0,26¥
Лимфоциты, х109/л 4,42±0,70 0,31 ±0,06* р<0,0004 0,78±0,28* р<0,0007 0,88±0,04
Гранулоциты, х109/л 1,77±0,28 0,15±0,05* р<0,0004 0,46±0,09* р<0,0001 0,09±0,01
Эритроциты, х1012/л 9,8±0,5 7,91 ±0,30* 7,91 ±0,32 7,36±0,44
Гемоглобин, г/л 143±4 125±5* р<0,007 112±7* р<0,007 123±5* р<0,007
Тромбоциты, х109/л 309±67 103±42* р<0,05 60±13* р<0,005 63±19* р<0,004
Тромбокрит, % 0,17±0,03 0,10±0,05 0,04±0,01 0,06±0,02
Клеточность костного мозга, х106/бедро 18,5±1,2 0,65±0,11* р<0,0001 2,9±0,43*¥ р<0,0003 4,0±1,0*¥ р<0,005
Примечания: * - статистически значимые различия по сравнению с группой «контроль»;
V - статистически значимые различия по сравнению с группой «облучение».
Следует отметить тот факт, что при такой дозе облучения на 6-е сутки у мышей подопытных групп содержание лейкоцитов в крови более чем в 2 раза превышает показатели группы «облучение». При этом установлено, что общая клеточность костного мозга бедра животных обеих подопытных групп в 5-6 раз превышала уровень в группе «облучение». С учётом времени, необходимого для восстановления популяций стволовых клеток гемопоэза после облучения, а также продвижения их потомков по циклам деления вплоть до состояния функционально зрелых клеток, можно полагать, что в данном случае проявляется явный противолучевой эффект как в варианте протекции, так и в лечебном применении полимера. На основании полученных данных можно сделать вывод, что эти эффекты, несомненно, относятся и к пролифери-рующему пулу гемопоэза. Возможна также и активация процессов постлучевой репарации с возвращением «в строй» части гемопоэтических клеток.
Ранее было установлено, что при парентеральном введении ионогенных полимеров класса поливинилпиридинов резко ускоряется выход гранулоцитов из крови в ткани с последующим выбросом из депо кроветворения зрелых и созревающих клеток крови [5]. Выше показано, что процесс мобилизации клеток из костного мозга в кровь характерен и для внутримышечного введения изучаемого полимера. Классическим тестом для анализа противолучевой активности фармпрепаратов или же физических агентов является селезёночный эндоколониальный тест, когда на фоне постлучевого опустошения в селезёнке формируются колонии из потомков выживших стволовых гемопоэтических клеток. При этом не вполне ясен вклад в этот патофизиологический феномен циркулирующих в крови стволовых клеток, часть из них может занимать опустевшие «ниши», в которых сохраняются условия для размножения стволовых клеток гемопоэза. Циркуляция ГСК в крови, по-видимому, имеет достаточно широкую значимость при реализации как физиологических, так и патологических процессов. Так, установлена их важная роль в формировании преметастатических ниш при канцерогенезе [17]. Поскольку по сравнению с человеком процессы миграции ГСК у мышей более выражены, нами проведён анализ содержания клеток с маркерами ГСК в крови и костном мозге во всех подгруппах. Данный подход
позволяет определять абсолютное и относительное количество клеток стволового типа в органах кроветворения. Ниже представлены данные о количестве ГСК, циркулирующих в крови (рис. 3), или содержащихся в костном мозге, выделенном из бедренной кости мышей (рис. 4). Установлено, что введение полимера само по себе не приводит к статистически значимому увеличению мобилизации ГСК в кровь. Через 6 суток после облучения количество циркулирующих в крови ГСК резко снижено (более, чем на порядок), по сравнению с интактным контролем или же с группой, получившей препарат. В целом, это соответствует ожидаемому с учётом значения йо для данной категории клеток. На этом фоне отмечено статистически значимое повышение их количества после введения сополимера при обоих временных вариантах его введения. Обращает на себя внимание тот факт, что абсолютное количество ГКС в костном мозге бедренной кости через 6 суток после облучения у получивших полимер мышей значимо превышает уровень ГСК у облучённого в дозе 7 Гр контроля, достигая 30-50% уровня от их нормального содержания. Из перечисленного выше можно сделать вывод, что достаточно быстро произошло восстановление их популяции до минимального уровня, после чего часть ГСК уходит в пролиферацию, в конечном счёте, обеспечивая выход в кровь вновь образованных зрелых клеток. Более чётко выражен противолучевой эффект при защитном варианте применения препарата. После облучения в более высокой дозе (8,5 Гр) на данный срок противолучевой эффект по этому критерию не просматривается.
Кровь
а
о
а 2
о
]7Гр 18,5 Гр
Контроль Сополимер Облучение Облучение Сополимер ♦сополимер +облучение
Рис. 3. Абсолютное количество ГСК в крови мышей в изучаемых экспериментальных группах
через 6 суток после облучения (среднее ± эв).
Примечание:* обозначены различия при сравнении с облучением (р<0,05).
Костный мозг
а
о 1 -
а о
7 Гр 8,5 Гр
пН
Контроль Сополимер Облучение Облучение Сополимер +сополимер +облучение
Рис. 4. Абсолютное количество ГСК в костном мозге мышей в изучаемых экспериментальных группах через 6 суток после облучения (среднее ± эв). Примечание:* обозначены различия при сравнении с облучением (р<0,05).
Полученные нами данные по оценке реакции гемопоэза свидетельствуют о наличии противолучевых свойств у сополимера при внутримышечном способе его применения. В работе, выполненной ранее [18] методом миграционной активности клеток, образующих колонии на селезёнке - «эндогенное колониеобразование», было показано, что данный сополимер при самостоятельном применении вызывает существенный рост количества колоний на селезёнке мышей. Этот факт, в увязке с полученными нами результатами, позволяет отнести исследуемое соединение к группе радиомитигаторов - препаратов, противолучевые действия которых реализуются на системном уровне и обусловлены ускорением пострадиационного восстановления радиочувствительных тканей через стимуляцию секреции эндогенных провоспалительных ци-токинов и гемопоэтических ростовых факторов [19]. Активация миелопоэза в таком случае обусловлена пролиферацией унипотентных миелоидных предшественников [20]. Полученные нами результаты вписываются и в концепцию ранее полученных данных [5, 13], согласно которой противолучевое действие высокомолекулярных соединений типа поли-2-винилпиридина и по-ли-2-метил-5-винилпиридина могут опосредоваться факторами, содержащимися в плазме крови. В качестве возможного гуморального механизма защиты кроветворных клеток в то время рассматривалась система С3 комплемента [13, 21]. С учётом новых данных о возможном механизме реализации противолучевых свойств препаратов группы радиомитигаторов через активацию ряда провоспалительных сигнальных путей и усиление секреции гемопоэтических ростовых факторов определённый интерес вызывает оценка влияния этих факторов на патогенез лучевой болезни в условиях применения сополимера Ы-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина. Принимая во внимание тот факт, что сополимер сам по себе вызывает напряжение в функционировании антиоксидантной системы, может оказаться перспективным использование этого соединения с природными антиоксидантами или же с радиопротекторами, проявляющими антиоксидантную активность.
Литература
1. Платэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. М.: Химия, 1986. 296 с.
2. Сидельковская Ф.П. Химия N-винилпирролидона и его полимеров. М.: Наука, 1970. 150 с.
3. Штильман М.И. Полимеры медико-биологического назначения. М.: ИКЦ Академкнига, 2006. 400 с.
4. Алексеев К.В., Грицкова И.А., Кедик С.А. Полимеры для фармацевтической технологии. М.: ЗАО ИФТ, 2011. 512 с.
5. Жаворонков Л.П. Влияние на систему крови и радиозащитная эффективность синтетических ионо-генных полимеров: дис. ... канд. мед. наук. М., 1979. 105 с.
6. Калистратов В.Г., Кедик С.А., Свергун В.И. Противолучевые и другие биологические свойства сополимера 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона //Медицинская радиология. 1993. Т. 38, № 10. С. 21-25.
7. Жаворонков Л.П. Основы прикладной медико-биологической статистики. Обнинск: ФГБУ МРНЦ Мин-здравсоцразвития России, 2012. 60 с.
8. Кедик С.А., Панов А.В., Зайцев М.А., Черта Ю.В. Сополимеры 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона, обладающие свойствами активаторов фагоцитоза: пат. РФ № 2430933 от 10.10.2011.
9. Кедик С.А., Свергун В.И., Черта Ю.В., Ярцев Е.И., Панов А.В. Сополимеры на основе N-винилпирролидона: пат. РФ № 2415876 от 10.04.2011.
10. Кедик С.А., Ворожцова С.В., Ярцев Е.И., Сакаева И.В., Кочкина (Черта) Ю.В., Панов А.В. Влияние совидона на цитогенетические изменения в клетках эпителия роговицы, повреждённых радиационным воздействием //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2012. № 8. С. 32-35.
11. Кедик С.А., Панов А.В., Сакаева И.В., Кочкина (Черта) Ю.В., Еремин Д.В., Суслов В.В. Синтез и радиопротекторная активность сополимеров N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилтетразола //Химико-фармацевтический журнал. 2012. Т. 46, № 12. С. 30-33.
12. Кедик С.А., Панов А.В., Сакаева И.В., Кочкина (Черта) Ю.В., Еремин Д.В., Суслов В.В. Синтез и молекулярно-массовые характеристики сополимеров N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина //Химико-фармацевтический журнал. 2012. Т. 46, № 8. С. 110-113.
13. Калистратова В.С., Иванов А.А., Нисимов П.Г. К проблеме профилактики при помощи иммуномо-дуляторов отдалённых последствий, вызванных внутренним облучением //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 1. С. 104-112.
14. Западнюк И.А., Западнюк В.И., Захария Е.А., Западнюк Б.В. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. Киев: Вища школа, 1983. 383 с.
15. Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина //Вопросы медицинской химии. 1990. Т. 36., № 2. С. 88-91.
16. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности катала-зы //Лабораторное дело. 1988. № 1. С. 16-19.
17. Semina O.V., Semenets T.N., Zamulaeva I.A., Selivanova E.I., Iljina T.P., Maliutina Y.V. , Deigin V.I., Saenko A.S. Dipeptide thymodepressin inhibits migration of CD34+ cells from the bone marrow into peripheral blood during tumor growth //Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2008. V. 146, N 1. P. 96-99.
18. Кедик С.А., Федоров Е.К., Свергун В.И., Гаврилов В.А., Зубаиров М.М. Сополимеры 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона, обладающие иммуностимулирующим действием: авт. свид. РФ № 2000004 от 15.02.1993.
19. Васин М.В. Классификация противолучевых средств как отражение современного состояния и перспективы развития радиационной фармакологии //Радиационная биология. Радиоэкология. 2013. Т. 53. № 5. С. 459-467.
20. Shannon M.F., Coles L.S., Vadas M.A., Cockerill P.N. Signals for activation of the GM-CSF promoter and enhancer in T cell //Critical Review of Immunology. 1997. V. 17. P. 301-323.
21. Богомазов С.Д. Антикомплементарные свойства полиэлектролитов и их защитная эффективность при радиационном поражении иммунитета: дис. ... канд. мед. наук. М., 1978. 198 с.
Hematopoietic parameters in acute irradiated mice treated with copolymer of N-vinylpyrrolidone and 2-methyl-5-vinylpyridine
Panov A.V.1, Izmestieva O.S., Selivanova E.I., Kedik S.A.1, Yakovleva T.A.1, Zhavoronkov L.P.
A. Tsyb MRRC, Obninsk;
1 JSC «Institute of Pharmaceutical Technology», Moscow
In framework of this work we obtained the experimental data on hematopoiesis and viability of mice after acute irradiation with 7 and 8.5 Gy and measured the morphofunctional readings for peripheral blood cells and bone marrow under this condition. We investigated anti-radiation properties of N-vinylpyrrolidone and 2-methyl-5-vinylpyridine copolymer using the intramuscular injection (dose 500 mg/kg) in two experimental scenarios: 20 minutes before and 20 minutes after irradiation with different intensity. We demonstrated anti-radiation effectiveness of copolymer compound using 280 C57B1/6j line male mice. The average life expectancy was increased by 40% for mice irradiated with absolutely lethal dose (8.5 Gy) .Copolymer increases bone marrow cellularity and absolute number of hematopoietic stem cells (7 Gy) in 5-6 time and leads to a significant release of mature and proliferating cells into blood stream. This study shows that the N-vinylpyrrolidone and 2-methyl-5-vinylpyridine copolymer is radiomitigator, which acts via the activation of a number of proinflammatory signaling pathways and stimulates the secretion of hematopoietic growth factors.
Key words: acute irradiation, copolymer of N-vinylpyrrolidone and 2-methyl-5-vinylpyridine, automatic Hematology analyzer, flow cytometer, mouse lines C57Bl/6j, leukocytes, granulocytes, hematopoietic stem cells, catalase, superoxide dismutase.
References
1. Plateh N.A., Vasil'ev A.E. Fiziologicheski aktivnye polimery [Physiologically active polymers]. Moscow, Himiya, 1986. 296 p.
2. Sidel'kovskaya F.P. Himiya N-vinilpirrolidona i ego polimerov [N-vinylpyrrolidone chemicals and зolymers]. Moscow, Nauka, 1970. 150 p.
3. Shtil'man M.I. Polimery mediko-biologicheskogo naznacheniya [Polymers medical and biological applications]. Moscow, IKC Akademkniga, 2006. 400 p.
4. Alekseev K.V., Grickova I.A., Kedik S.A. Polimery dlya farmacevticheskoj tekhnologii [Polymers for pharmaceutical technology]. Moscow, ZAO IFT, 2011. 512 p.
5. Zhavoronkov L.P. Vliyanie na sistemu krovi i radiozashchitnaya ehffektivnost' sinteticheskih ionogennyh polimerov. Diss. kand. med. nauk [Effects on the blood system and radioprotective efficacy of synthetic ionic polymers. Can. med. sci. diss.]. Moscow, 1979. 105 p.
6. Kalistratov V.G., Kedik S.A., Svergun V.I. Protivoluchevye i drugie biologicheskie svojstva sopolimera 2-metil-5-vinilpiridina i N-vinilpirrolidona [Antiradiation and other biological properties of the copolymer of 2-methyl-5-vinylpyridine and N-vinylpyrrolidone]. Medicinskaya radiologiya - Medical Radiology, 1993, vol. 38, no. 10, pp. 21-25.
7. Zhavoronkov L.P. Osnovy prikladnoj mediko-biologicheskoj statistiki [Fundamentals of applied biomedical statistics]. Obninsk, FGBU MRNC Minzdravsocrazvitiya Rossii, 2012. 60 p.
Panov A.V. - Director of Science Dep., C. Sc., Chem.; Kedik S.A. - General Manager, D.Sc., Tech., Prof.; Yakovleva T.A. - Researcher. JSC
«Institute of Pharmaceutical Technology». Izmestieva O.S. - Lead. Researcher, C. Sc., Biol.; Selivanova E.I.* - Senior Researcher, C. Sc., Biol.;
Zhavoronkov L.P. - Deputy Director, D.Sc., Med. A. Tsyb MRRC.
•Contacts: 4 Korolyov str., Obninsk, Kaluga region, Russia, 249036. Tel.: (484) 399-71-88; e-mail: [email protected].
8. Kedik S.A., Panov A.V., Zajcev M.A., Cherta Yu.V. Sopolimery 2-metil-5-vinilpiridina i N-vinilpirrolidona, obladayushchie svojstvami aktivatorov fagocitoza [Copolymers of 2-methyl-5-vinylpyridine and N-vinylpyrrolidone having properties activators phagocytosis]. Patent RF, no. 2430933, 2011.
9. Kedik S.A., Svergun V.I., Cherta Yu.V., Yarcev E.I., Panov A.V. Sopolimery na osnove N-vinilpirrolidona [Copolymers of N-vinylpyrrolidone]. Patent RF, no. 2415876, 2011.
10. Kedik S.A., Vorozhcova S.V., Yarcev E.I., Sakaeva I.V., Kochkina (Cherta) Yu.V., Panov A.V. Vliyanie Sovidona na citogeneticheskie izmeneniya v kletkah ehpiteliya rogovicy. povrezhdennyh radiacionnym vozdejstviem [Influence Sovidona on cytogenetic changes in corneal epithelium cells damaged by radiation exposure]. Voprosy biologicheskoi medicinskoi i farmacevticheskoi khimii - Problems of Biological Medical and Pharmaceutical Chemistry, 2012, no. 8, pp. 32-35.
11. Kedik S.A., Panov A.V., Sakaeva I.V., Kochkina (Cherta) Yu.V., Eremin D.V., Suslov V.V. Sintez i radioprotektornaya aktivnost' sopolimerov N-vinilpirrolidona i 2-metil-5-viniltetrazola [Synthesis and radioprotective activity of copolymers of vinylpyrrolidone and N-2-methyl-5-vinyltetrazole]. Khimiko-farmacevticheskij zhurnal - Pharmaceutical Chemistry Journal, 2012, vol. 46, no. 12, pp. 30-33.
12. Kedik S.A., Panov A.V., Sakaeva I.V., Kochkina (Cherta) Yu.V., Eremin D.V., Suslov V.V. Sintez i molekulyarno-massovye harakteristiki sopolimerov N-vinilpirrolidona i 2-metil-5-vinilpiridina [Synthesis and molecular weight characteristics of the copolymers of N-vinylpyrrolidone and 2-methyl-5-vinylpyridine]. Khimiko-farmacevticheskij zhurnal - Pharmaceutical Chemistry Journal, 2012, vol. 46, no. 8, pp. 110-113.
13. Kalistratova V.S., Ivanov A.A., Nisimov P.G. K probleme profilaktiki pri pomoshchi immunomodulyatorov otdalennyh posledstvai, vyzvannyh vnutrennim oblucheniem [By preventing the problem of using immunomodulators long-term effects caused by internal exposure]. Radiatsionnaya biologiya. Radioekologiya - Radiation Biology. Radioecology, 2001, vol. 41, no. 1, pp. 104-112.
14. Zapadnyuk I.A., Zapadnyuk V.I., Zahariya E.A., Zapadnyuk B.V. Laboratornye zhivotnye. Razvedenie, soderzhanie, ispol'zovanie v ehksperimente [Laboratory animals. Breeding, maintenance, use in the experiment]. Kiev, Vishcha shkola, 1983. 383 p.
15. Kostyuk V.A., Potapovich A.I., Kovaleva Zh.V. Prostoj i chuvstvitel'niy metod opredeleniya aktivnosti superoksiddismutazy. osnovannyj na reakcii okisleniya kvercetina [A simple and sensitive method for determining the activity of superoxide dismutase. based on the reaction of oxidation of quercetin]. Voprosy meditsinskoy khimii - Problems of Medical Chemistry, 1990, vol. 36, no. 2, pp. 88-91.
16. Korolyuk M.A., Ivanova L.I., Majorova I.G., Tokarev V.E. Metod opredeleniya aktivnosti katalazy [The method for determining the activity of catalase]. Laboratornoe delo - Laboratory Case, 1988, no. 1, pp. 16-19.
17. Semina O.V., Semenets T.N., Zamulaeva I.A., Selivanova E.I., Iljina T.P., Maliutina Y.V., Deigin V.I., Saenko A.S. Dipeptide thymodepressin inhibits migration of CD34+ cells from the bone marrow into peripheral blood during tumor growth. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2008, vol. 146, no. 1, pp. 96-99.
18. Kedik S.A., Fedorov E.K., Svergun V.I., Gavrilov V.A., Zubairov M.M. Sopolimery 2-metil-5-vinilpiridina i N-vinilpirrolidona, obladayushchie immunostimuliruyushchim dejstviem [Copolymers of 2-methyl-5-vinylpyridine and N-vinylpyrrolidone having immunostimulating activity]. Copyright certificate RF, no. 2000004, 1993.
19. Vasin M.V. Klassifikaciya protivoluchevyh sredstv kak otrazhenie sovremennogo sostoyaniya i perspektivy razvitiya radiacionnoj farmakologii [Classification of radioprotective agents as a reflection of the current state and prospects of development of radiation pharmacology]. Radiatsionnaya biologiya. Radioekologiya -Radiation Biology. Radioecology, 2013, vol. 53, no. 5, pp. 459-467.
20. Shannon M.F., Coles L.S., Vadas M.A., Cockerill P.N. Signals for activation of the GM-CSF promoter and enhancer in T cell. Critical Review of Immunology, 1997, vol. 17, pp. 301-323.
21. Bogomazov S.D. Antikomplementarnye svojstva poliehlektrolitov i ih zashchitnaya ehffektivnost' pri radiacionnom porazhenii immuniteta. Diss. kand. med. nauk [Anti complementary properties of polyelectrolyte and protective efficacy in radiation injury immunity. Can. med. sci. diss.]. Moscow, 1978. 198 p.
