CC BY
1012. Guzzella L., Monarca S., Zani C. et al. In vitro potential genotoxic effects of surface drinking water treated with chlorine and alternative disinfectants // Mutat. Res., 2004. - V 564. - № 2. - P. 179-193.
13. Maffei F., Buschini A., Rossi C. et al. Use of the Comet test and micronucleus assay on human white blood cells for in vitro assessment of genotoxicity induced by different drinking water disinfection protocols //Environ. Mol. Mutagen., 2005. - V. 46. - № 2. -P. 116-125.
14. NTP Toxicology and Carcinogenesis Studies of Sodium Chlorate (CAS № 7775-09-9) in F344/N Rats and B6C3F(1) Mice (Drinking Water Studies). Natl. Toxicol. Program Tech. Rep. Ser., 2005. — V. 517. — P. 1-256.
15. Svecevicius G., Syvokiene J., Stasiunaite P. et al. Acute and chronic toxicity of chlorine dioxide (ClO2) and chlorite (ClO2-) to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // Environ. Sci. Pollut. Res. Int., 2005. — V. 302. — № 5. — P. 302-305.
Материал поступил в редакцию 20.12.06.
A.I.Kotelenets, A.M.Voitovich, L.A.Nadzharyan, V.Yu.Afonin, T.V.Demenkova, N.V.Dudchik, L.I.Soroka, Ye.S.Druzhinina, T.A.Fedorova, S.V.Tkachyov
TOXICOLOGICAL ASSESSMENT OF WATER TREATED WITH CHLORINE DIOXIDE
Republican Scientific and Practical Center for Hygiene, Minsk
A maximum tested concentration (2.0 mg/l) of chlorine dioxide led to a loss of body weight of white rats and decreased relative coefficients of adrenal and thyroid glands weight, increased the enzymatic activity of gamma-glutamyl transpeptidase and level of regenerated glutathione in blood serum. A dose-dependent increase of the methemoglobin level in blood hemolysate was shown. Chlorine dioxide did not show any mutagenic activity in Ames test but caused genotoxic effects in micronucleus assays and apoptosis.
УДК 615.9:615.281:577.112.382-389
Л.Б.Бондаренко, Н.А.Сапрыкина, В.Н.Коваленко
ПУЛ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ СЕРДЦА КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ВВЕДЕНИИ ПИРАЗИНАМИДА
Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев
В экспериментах на крысах-самцах проведено изучение изменений содержания свободных аминокислот сердца при введении 1000 и 2000 мг/кг пиразинамида с целью комплексной оценки его влияния на процессы метаболизма в миокарде.
Полученные результаты изучения указывают на возможные нарушения энергетического обмена, метаболизма аминокислот и др. азотсодержащих соединений, процессов взаимодействия гемоглобина с молекулами кислорода, процессов перекисного окисления и метилирования биологических макромолекул в сердце. Часть изменений может рассматриваться в качестве компенсаторного ответа организма на действие пиразинамида. Возрастание его дозы до 2000 мг/кг приводит к ослаблению адаптационных возможностей организма.
Ключевые слова: пиразинамид, пул свободных аминокислот, сердце.
Введение. В настоящий момент снова возрастает внимание исследователей к поиску оптимальных схем химиотерапии туберкулеза в связи с продолжающимся распространением этого заболевания в глобальных масштабах и высоким числом летальных исходов [1]. Ситуация усугубляется тем, что зачастую туберкулез сопровождается осложнениями в виде хронической сердечной недостаточности [2]. Это повышает вероятность летального исхода и осложняет подбор
оптимальной схемы антибактериальной терапии с наименьшими побочными последствиями.
К тому же, большинство антибактериальных средств, применяемых при туберкулезе, обладают выраженной гепатотоксичностью [3], а поражение печени влечет за собой нарушения сердечно-сосудистой системы и метаболических процессов в сердце [4].
Возможны и другие пути отрицательного воздействия антибактериальных препаратов на ми-
окард. В частности, оксидативный стресс, сопровождающий поступление в организм целого ряда ксенобиотиков, может явится причиной повреждения сердечной мышцы [5].
В связи с этим для минимизации нежелательных побочных последствий противотуберкулезной химиотерапии необходима комплексная оценка влияния антибактериальных средств на организм в целом и сердце в частности.
Одним из наиболее чувствительных и информативных показателей, характеризующих состояние внутренних резервов органа, его адаптивных возможностей и степень дезинтеграции в нем обменных процессов, является пул свободных аминокислот [6—8].
Целью данной работы являлось изучение пула свободных аминокислот сердца крыс в норме и при введении различных доз пиразинамида.
Материалы и методы исследования. В экспериментах использовали самцов белых крыс линии Вистар массой тела 160—200 г разведения вивария Института фармакологии и токсикологии АМН Украины, которых содержали в стандартных условиях с соблюдением пищевого и водного режимов.
В опытах использовали пиразинамид в таблетках по 500 мг действующего вещества в каждой, производства Борщаговского химико-фармацевтического завода (Украина).
После предварительного карантина на протяжении 10-ти дней крыс разделяли на контрольную и опытные группы методом рандомизации.
Водный раствор пиразинамида в дозах 1000 и 2000 мг/кг вводили внутрижелудочно металиче-ским зондом самцам крыс на протяжении 60 суток. Контрольной группе крыс внутрижелудочно вводили дистиллированную воду.
В течение всего времени введения препарата наблюдали за состоянием животных, их внешним видом и двигательной активностью.
На следующий день после окончания введения пиразинамида животных умерщвляли методом цервикальной дислокации под легким эфирным наркозом. Выделяли сердце, которое промывали охлажденным 1% раствором КС1 и гомогенизировали в 0,1 М К-фосфатном буфере (рН 7,4) в соотношении 1:3. Все процедуры выполняли с соблюдением холодового режима (1 +4°С).
Полученный гомогенат оставляли стоять на 30 мин при 1+4°С. После этого к гомогенату при-
Таблица
Содержание свободных аминокислот сердца крыс самцов в норме и при введении пиразинамида
(М±т, п = 5, мг/100 г влажной ткани)
Аминокислота Норма Пиразинамид 1000 мг/кг Пиразинамид 2000 мг/кг
Лизин 9,20+1,77 17,40+1,05* 14,7+2,86
Гистидин 2,00+0,53 5,70+0,37* 3,95+0,92
Аргинин 3,00+0,97 12,70+0,66* 11,17+2,26*
Орнитин 0,40+0,02 1,50+0,16* 0,72+0,18
Аспарагиновая кислота 18,70+3,81 15,90+0,31 16,58+1,00
Треонин 4,10+1,08 11,00+0,50* 4,70+1,11
Серин 5,70+1,63 15,30+0,61* 6,86+2,03
Глутаминовая кислота 82,70+7,55 71,50+1,52 75,28+4,86
Пролин 1,40+0,11 5,90+0,14* 3,59+0,24*
Глицин 5,10+0,91 16,30+0,16* 7,63+1,23
Аланин 21,40+4,66 29,90+0,97 22,32+4,07
Цистеин 2,10+0,37 1,10+0,04* 1,28+0,10
Валин 8,10+0,48 12,70+0,51* 8,88+0,86
Метионин 2,10+0,44 6,70+0,24* 9,29+1,11*
Изолейцин 2,10+0,48 8,30+0,36* 8,81+2,11*
Лейцин 4,80+1,35 18,00+1,00* 18,76+5,46*
Тирозин 3,70+0,91 8,00+0,50* 4,35+0,97
Фенилаланин 3,50+1,04 9,10+0,37* 7,42+2,18
Глутамин 63,80+14,47 19,90+4,39* 35,46+5,52
Сумма аминокислот 244,02+16,49 286,80+7,25* 261,74+15,52
* — p < 0,05 по отношению к норме
бавляли равный объем 3% сульфосалициловой кислоты и оставляли стоять на 10 мин при t+4°C. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием (5000 g, 10 мин, 4°С). Супернатант содержал пул свободных аминокислот сердца. Содержание свободных аминокислот определяли на аминокислотном анализаторе ААА-881 (Чехия).
Полученные данные подвергали статистической обработке общепринятыми методами вариационной статистики. Достоверность изменений оценивали с помощью t-критерия Стьюден-та, считая разницу достоверной при значении Р исследований < 0,05.
Результаты исследований и обсуждение. Изучение влияния пиразинамида на пул свободных аминокислот сердца крыс-самцов показало, что при введении 1000 мг/кг достоверные отличия от нормы отмечались по содержанию 16 отдельных аминокислот, а при дозе 2000 мг/кг — только по 5 аминокислотам (табл.).
При этом в обоих случаях общая сумма аминокислот возрастала (рис. 1). Такое увеличение суммы свободных аминокислот, как соединений с низкими и средними молекулярными массами, рассматривается в качестве одного из показателей развития эндотоксикоза [9]. Подобные изменения данного показателя отмечены нами ранее при изучении эффекта пиразинамида на пул печени [10].
Изменялось и соотношение незаменимых аминокислот к заменимым: в норме — 0,186, при дозе 1000 мг/кг пиразинамида — 0,548, а при дозе 2000 мг/кг пиразинамида — 0,504 (рис. 2). Это увеличение происходило в основном за счет роста содержания незаменимых аминокислот, тогда как количество большинства заменимых аминокислот оставалось неизменным или незначительно повышалось, что может быть следствием нарушения, в первую очередь, процессов биосинтеза аминокислот и протеинов, а также транспорта незаменимых аминокислот [11].
Важное значение для нормального функционирования клеток миокарда имеет их обеспеченность источниками энергии (особенно АТФ). Эти клетки активно участвуют в деградации аминокислот с разветвленной боковой цепью и ряда других аминокислот с одновременным запасанием высвобождаемой энергии в виде молекул макроэргов, в основном, АТФ [11]. Поэтому, особого внимания заслуживают наблюдаемые при введении пиразинамида изменения содержания аминокислот, принимающих участие в энергетическом обмене на стадии гликолиза (изменения содержания серина, гли-
цина) и в цикле Кребса (изменения содержания пролина, аргинина, орнитина, гистидина, тирозина, валина, метионина, треонина, изолей-цина, лейцина) [11]. Увеличение концентрации данных аминокислот в свободном состоянии приводит к интенсификации их включения в процессы катаболизма с запасанием энергии в виде АТФ. Наиболее заметные изменения содержания данных аминокислот отмечены при введении пиразинамида в дозе 1000 мг/кг, что возможно обусловлено интенсификацией адап-торных систем организма в ответ на поступление ксенобиотика.
Дальнейшее возрастание дозы пиразинами-да ведет к дозозависимому увеличению концентраций только аминокислот с разветвленной цепью Лей и Иле. На содержание Лиз, Гис, Арг, Орн, Тре, Сер, Про, Гли, Вал, Тир, Фен, Глн влияние пиразинамида в дозе 2000 мг/кг выражено слабее. Такие отличия в эффектах различных доз пиразинамида, отмеченные нами ранее и при исследовании пулов свободных аминокислот печени и почек [10, 12], возможно, обусловлены возникновением серьезных нарушений метаболических преобразований в организме при дозе 2000 мг/кг, которые уже не могут быть, даже частично, компенсированы его защитными и адапторными системами.
В ходе расщепления аминокислот продукты их распада должны высвобождаться из миокарда в кровь для дальнейшей транспортировки к почкам. Глутамин представляет собой важнейшую транспортную форму аммиака в кровь из всех органов [11]. Он стимулирует обменные процессы в миокарде и обеспечивает его нормальное функционирование [13]. Выявленное нами при введении 1000 мг/кг пиразинамида трехкратное снижение содержания этой амино-
*
220J
Рис. 1. Сумма свободных аминокислот сердца крыс самцов в норме и при введении различных доз пирази-намида
* - p < 0,05 по отношению к норме
□ Норма
□ 1000 мг/кг пиразинамида
И 2000 мг/кг пиразинамида
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Рис. 2. Соотношение «незаменимые/заменимые аминокислоты» в пулах свободных аминокислот сердца крыс самцов в норме и при введении различных доз пиразинамида
кислоты, сопровождаемое к тому же возрастанием концентраций аргинина и орнитина, свидетельствует о серьезных нарушениях азотистого обмена в сердце, которые не могут не отразится на его механической функции. Пиразинамид в дозе 2000 мг/кг оказывал на содержание Глн, Арг и Орн аналогичный, хотя и менее выраженный, эффект.
Под влиянием пиразинамида может происходить также нарушение биосинтеза S-аденозилгомоцистеина (изменения содержания метионина, цистеина, глицина и сери-на) [11], метаболизма гомоцистеина и метиони-на. Это, в свою очередь, может привести к нарушениям состояния сосудов, нормальной обеспеченности кислородом клеток миокарда и повреждению клеток, вследствие накопления ги-дроперекисных радикалов, стимулированного повышением концентрации гомоцистеина [14]. Введение 1000 мг/кг пиразинамида вызывало возрастание содержания свободного серина в пуле сердца на 168%, глицина — на 219%, мети-онина — на 220% при одновременном снижении содержания цистеина в два раза. Увеличение дозы пиразинамида до 2000 мг/кг вело к дозоза-висимому возрастанию содержания метионина (увеличение на 280%).
Изменения содержания цистеина и метиони-на в пуле могут также отражать нарушения глубинных процессов репарации ДНК, процессов ее метилирования [14].
Увеличение содержания аргинина, серина, пролина и тирозина заслуживают особого внимания, так как эти соединения могут выступать в качестве депо NO, регулирующего тонус сосудов и реагирующего с атомами железа (в составе гема и в свободном состоянии), с супероксид анионами, молекулами кислорода, перекисью
водорода, органическими перекисями и перок-сидными радикалами [15]. Выявленные нами изменения содержания аргинина, серина, пролина и тирозина при введении пиразинамида могут отразится на состоянии процессов перекисного окисления в миокарде, функционировании сосудистой системы сердца, эффективности связывания кислорода гемоглобином.
Кроме того, сами аргинин и метионин являются предшественниками полиаминов — стимуляторов и регуляторов пролиферативных процессов, а также служат мощными антиоксидан-тами и иммуномодуляторами [16]. Очевидно, выявленные изменения их содержания при введении обоих доз пиразинамида могут рассматриваться как адаптивные перестройки органа в ответ на длительное введение ксенобиотика.
Характер изменений содержания фенила-ланина и тирозина в пуле сердца при введении обоих доз туберкулостатика, очевидно, обусловлен тем, что поврежденная пиразинамидом печень уже не может полностью катаболизиро-вать данные аминокислоты и их концентрация возрастает в тканях организма [3]. Дозозависи-мо повышается и соотношение Фен/Тир, отражающее интенсивность процессов гидроксили-рования фенилаланина в тирозин. В норме этот показатель в пуле сердца составлял 0,946, при дозе 1000 мг/кг пиразинамида — 1,140, при дозе 2000 мг/кг пиразинамида — 1,66, что может свидетельствовать о значительном ингибировании фенилаланин-гидроксилазной активности при введении пиразинамида. Дозозависимые изменения фенилаланин-гидроксилазной активности были выявлены нами и ранее при изучении влияния данного туберкулостатика на печень [10].
Кроме того, повышение концентрации тирозина может стимулировать его преобразование клетками миокарда в нитротирозин, накопление которого сопровождает развитие хронической сердечной недостаточности [17].
Выводы. Таким образом, изучение изменений содержания свободных аминокислот сердца крыс при введении 1000 и 2000 мг/кг пиразина-мида позволило провести комплексную оценку влияния данного соединения на процессы метаболизма аминокислот, протеинов, нуклеотидов, нуклеиновых кислот и энергетический обмен.
В сердце изменения содержания свободных аминокислот указывают на возможные нарушения энергетического обмена, метаболизмов аминокислот и других азотсодержащих соединений, процессов взаимодействия гемоглобина с молекулами кислорода, процессов перекисного
окисления и метилирования биологических макромолекул.
Часть наблюдаемых изменений может рассматриваться в качестве компенсаторного ответа организма на действие данного ксенобиотика. Возрастание дозы пиразинамида до 2000 мг/кг приводит к ослаблению адаптационных возможностей организма.
Список литературы
1. Colston M.J., Hailes H.C., Stavropoulos E. et al. Antimycobacterial calixarenes enhance innate defense mechanisms in murine macrophages and induce control of Mycobacterium tuberculosis infection in mice // Infect. Immun., 2004. — V 72. — № 11. — P. 63186323.
2. Дитятков А.Е., Тихонов В.А., Радзевич А.Е. Влияние ингибиторов ангиотензин-преобразующих ферментов и Клара на качество жизни пациентов с туберкулезом легких и хронической сердечной недостаточностью // Пробл. туберкул., 2001. — № 8. — С. 37-39.
3. Сливка Ю.И. Сравнительная характеристика гепатотоксичности изониазида, рифампицина и пиразинамида // Фармакол. токсикол., 1989. — Т. 52. — № 4. — С. 82-85.
4. Hunter R.J., Patel V.B., Baker A.J. et al. Liver dysfunction induced by bile duct ligation and galactos-amine injection alters cardiac protein synthesis // Me-taboliusm, 2004. — V 53. — № 8. — P. 964-968.
5. Raman M, Wang L., Kang Y.J. Myocardial oxidative stress and toxicity induced by acute ethanol exposure in mice //Exp. Biol. Med., 2004. — V. 229. — № 6. — P. 553-559.
6. Нечипоренко Н.А., Нефедов Л.И., Климович И.И. Изменение белкового обмена и фонд свободных аминокислот при раке мочевого пузыря // Вопр. он-кол, 1990. — Т. 36. — № 10. — С. 1201-1205.
7. Павлов В.А. Влияние микобактерий на адаптивную перестройку в организме морских свинок при длительном воздействии на них ПАУ-содержащих веществ // Пробл. туберкулеза, 1998. — № 1. — С. 51-53.
8. Li J. Y. Sequential changes of free amino acid pool in burned rabbits // Zhonghua Zh., 1991. — V. 7.
— № 3. — P. 208-211.
9. Ерюхин И.А., Шашков Б.В. Эндотоксикоз в хирургической практике. — СПб.: Логос, 1995. — 304 с.
10. Бондаренко Л.Б., Сапрыкина Н. А., Коваленко В.Н. Пул свободных аминокислот печени крыс в норме и при введении различных доз пирази-намида // Токсикологический вестник, 2006. — № 2. — С. 24-29.
11. Marks D.B. Biochemistry / Ed. Williams & Wilkins, Baltimore, 1994. — P. 234-249.
12. Бондаренко Л.Б., Сапрыкина Н. А., Коваленко В.Н. Эффект различных доз пиразинамида на пул свободных аминокислот почек // Токсикологический вестник, 2006. — № 5. — С. 27-31.
13. Wishmeyer P.E., Jayakar D., Williams U. et al. Single dose of glutamine enchances myocardial tissue metabolism, glutatione content, and improves myocardial function after ischemia-reperfusion injury // J. Parenter. Enteral Nutr., 2003. — V 27. — № 6. — P. 396-403.
14. Dimitrova C.R., DeGroot K., Myers A.K. et al. Estrogen and homocysteine // Cardiovascular Res., 2002. — 53. — P. 577-588.
15. Степуро И.И. Роль аминокислот и белков в обмене оксида азота // Матер. конф. «Аминокислоты и их производные в биологии и медицине». — Гродно, 2001. — С. 104.
16. Павлов В.А. Влияние микобактерий на адаптивную перестройку в организме морских свинок при длительном воздействии на них ПАУ-содержащих веществ // Пробл. туберкулеза, 1998.
- № 1. — С. 51-53.
17. Pacher P., Liaudet L, Mabley J. et al. Pharmacologic inhibition of poly(adenosine diphosphate-ri-bose) polymerase may represent a novel therapeutic approach in chronic heart failure// J. Am. Coll. Cardiol., 2002. — V. 40. — № 5. — P. 1006-1016.
Материал поступил в редакцию 09.01.07.
L.B.Bondarenko, N.A.Saprykina, V.N.Kovalenko TREE AMINO ACID POOLS IN NORM IN RAT HEARTS AND AT ADMINISTRATION OF PYRAZINAMIDE
Research institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kiev
In experiments on male rats, studies were conducted on changes in the amount of free amino acids in heart pools at administration of pyrazinamide in doses of 1000 mg/kg and 2000 mg/kg.Results obtained pointed out possible disturbances in metabolism of energy, amino acids and other nitrogen-containing compounds, in processes of hemoglobin-oxygen interaction, lipid peroxidation and methylation of macromolecules in heart. These changes can be partly considered as a compensatory response of the organism to the pyrazinamide action. The increase of its dose to 2000 mg/kg led to weakening adaptive abilities of the organism.
