CC BY
25
УДК 577.1 12
Прямой молекулярный фишинг новых белков-партнеров тромбоксансинтазы человека
А. В. Свирид1, П. В. Ершов2, Е. О. Яблоков2, Л. А. Калужский2, Ю. В. Мезенцев2*, А. В. Флоринская2, Т. А. Сушко1,3, Н. В. Струшкевич1, А. А. Гилеп1, С. А. Усанов1, А. Е. Медведев2, А. С. Иванов2
1Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси, 220141, Беларусь, Минск, ул. Академика В.Ф. Купревича, 5, корп. 2
2Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, 119121, Россия, Москва, Погодинская ул., 10, стр. 8
3Department of Bioengineering, School of Engineering, The University of Tokyo, Tokyo 108-8639, Japan
*E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 20.04.2017 Принята к печати 11.10.2017
РЕФЕРАТ Тромбоксансинтаза (TBXAS1) катализирует реакцию изомеризации простагландина Н2 с образованием тромбоксана А2 - аутокринного и паракринного фактора многих клеток. Высокая активность и метастабильность этих производных арахидоновой кислоты позволяют предположить существование надмолекулярных структур, участвующих в регуляции биосинтеза и адресной транслокации тромбоксана к рецептору. Целью настоящей работы была идентификация белков-партнеров TBXAS1 из лизата ткани печени человека с использованием комплексного подхода, основанного на применении технологии прямого молекулярного фишинга, LC-MS/MS-идентификации белков и валидации белок-белкового взаимодействия с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Идентифицированы 12 потенциальных белков-партнеров TBXAS1, в том числе компоненты, регулирующие организацию цитоскелета (BBIP1 и ANKMY1), компоненты коагуляционного каскада крови (SERPINA1, SERPINA3, APOH, FGA и FN1) и фермент метаболизма ксенобиотиков и эндогенных биорегуляторов (CYP2E1). SPR-валидация на биосенсоре Biacore 3000 подтвердила эффективность взаимодействия CYP2E1 (фермент метаболизма простагландина Н2 до 12-ННТ/проантагониста тромбоксана А2) с TBXAS1 (Kd - (4.3 ± 0.4) х 10-7 М). Показательно, что аффинность комплексообразования TBXAS1-CYP2E1 пятикратно возрастает в присутствии изатина (индол-2,3-дион, низкомолекулярный непептидный эндогенный биорегулятор, продукт CYP2E1). Полученные нами результаты позволяют предположить важность взаимодействия данных гемопротеинов в регуляции биосинтеза эйкозаноидов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА белки-партнеры, изатин, поверхностный плазмонный резонанс, прямой молекулярный фишинг, тромбоксансинтаза (CYP5A1, TBXAS1), цитохром P450.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ББВ - белок-белковые взаимодействия; SPR (surface plasmon resonance) - поверхностный плазмонный резонанс; kon - константа скорости ассоциации; koff - константа скорости диссоциации; Kd - равновесная константа диссоциации.
ВВЕДЕНИЕ неров и приводящую к образованию тромбоксана А2
Тромбоксансинтаза человека (TBXAS1) входит в су- (TXA2) [2]. Последний, выступая в качестве пара-персемейство цитохромов Р450 (CYP5A1), однако, и аутокринного регулятора, является важным меди-по своей функции она отличается от «классических» атором агрегации тромбоцитов и сокращения стенок цитохромов Р450, которые катализируют разно- кровеносных сосудов, который способствует повы-образные монооксигеназные реакции при участии шению артериального давления.
редокс-партнеров в качестве донора электронов [1]. Помимо изомеризации PGH2 TBXAS1 катализи-TBXAS1 катализирует реакцию изомеризации про- рует альтернативную реакцию превращения PGH2, стагландина Н2 (PGH2), не требующую редокс-парт- осуществляя его расщепление на 12-гидрокси-
5,8,10-гептатриеновую кислоту (12-ННТ) и малоновый диальдегид (МЮА) [3]. В настоящее время нет точных сведений о функциональной роли МЮА и 12-ННТ. МЮА может образовывать аддукты с аминогруппами белков или полярных групп фосфоли-пидов и таким образом играть определенную роль в молекулярных механизмах возникновения атеросклероза, рака и ряда генетических заболеваний [4, 5]. 12-ННТ и ее метаболиты могут блокировать действие лейкотриеновых рецепторов и выступать в качестве частичного антагониста ТХА2 за счет увеличения синтеза простациклина и антагонистического воздействия на рецептор тромбоксана (TXAR) [6, 7]. Нельзя исключить, что TBXAS1 способна выполнять и другие функции, катализируя типичные для цитохромов Р450 монооксигеназные реакции с участием редокс-партнеров.
Первоначально TBXAS1 выделили из тромбоцитов человека [3] и легких свиньи [8]. TBXAS1 преимущественно синтезируется в протромбоцитах и стволовых гемопоэтических клетках-предшественниках моноцитов, лейкоцитов и макрофагов, где ТХА2 участвует в регуляции дифференцировки [9]. Синтез TBXAS1 обнаружен также в клетках легких, почек, желудка, кишечника, селезенки, тимуса, поджелудочной железы и печени [10]. TXAR, относящийся к классу сопряженных с G-белком рецепторов (GPCR), представлен в большом количестве тканей (в легком, селезенке, печени, матке, плаценте, аорте, сердечной мышце, кишечнике, тимусе, почках, спинном и головном мозге) [11]. Это может свидетельствовать о других возможных функциях TBXAS1 или об универсальности механизмов реализации его основной функции.
Один из подходов к выяснению неизвестных функций белка основан на изучении его взаимодействия с другими белками, функции которых уже известны [12]. В основе этого подхода лежит концепция о том, что функции взаимодействующих белков-партнеров должны либо быть взаимосвязаны, либо образовывать единый белковый комплекс, выполняющий последовательные взаимосвязанные функции. Субстрат и продукт реакции TBXAS1 - крайне ко-роткоживущие и активные липофильные молекулы, диффузный транспорт которых затруднен, а рецептор к ТХА2 находится на внешней стороне плазматической мембраны. Это предполагает существование специфического транспортного механизма, или, вероятнее всего, взаимодействия с взаимосвязанными белковыми комплексами, ответственными за перенос этих короткоживущих соединений.
На сегодняшний день имеется крайне скудная информация об экспериментально подтвержденных белок-белковых взаимодействиях (ББВ) с учас-
тием TBXAS1. В базе данных BioGRID есть только две записи о зарегистрированных ББВ с участием TBXAS1 (https://thebiogrid.org/112778/summary / homo-sapiens/tbxas1.html?sort=bait): (1) взаимодействие с эукариотическим фактором элонгации 1 а-2 (EEF1A2) со ссылкой на неопубликованные данные [13]; (2) взаимодействие с убиквитином С (UBC) [14]. Наиболее вероятно, что оба этих взаимодействия неспецифические, так как в той же базе BioGRID зарегистрировано 132 возможных взаимодействия EEF1A2 со 124 партнерами и 2332 взаимодействия UBC с 1440 партнерами. В 2016 году Meling D.D. в реферате своей диссертации (Protein-protein interactions and mechanistic insights for CYP2J2 and TBXAS1) привел неопубликованные данные о взаимодействии TBXAS1 с цитохром-Р450-редуктазой (CPR) (http://hdl.handle.net/2142/90774), что, несомненно, может быть функционально значимым, так как CPR является известным белком-партнером микросомальных цитохромов Р450.
Ранее для поиска новых белков-партнеров, взаимодействующих с целевым белком, мы разработали комплексный подход, основанный на применении технологии прямого молекулярного фишинга на аффинном сорбенте с иммобилизованным целевым белком (или пептидом) в качестве лиганда, масс-спектрометрической идентификации выделенных белков и валидации потенциальных ББВ с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) [15-17].
Цель настоящей работы состояла в поиске возможных новых белков-партнеров TBXAS1 в лиза-те ткани печени человека с использованием данного подхода. В результате на аффинной колонке с иммобилизованной TBXAS1 с помощью LC-MS/ MS-анализа были выделены и идентифицированы 12 потенциальных белков-партнеров TBXAS1, один из которых оказался цитохромом Р450 (CYP2E1). Валидация методом SPR подтвердила его взаимодействие с иммобилизованной на оптическом чипе TBXAS1 и выявила еще один потенциальный белок-партнер (CYP11B2). Контрольные SPR-эксперименты с пятью другими цитохромами Р450 (CYP2C19, CYP11A1, CYP11B1, CYP3A4, CYP3A5) дали отрицательный результат, что говорит о высокой специфичности выявленных ББВ. Поскольку CYP2E1 участвует в метаболизме различных производных индола [18], то дополнительно исследовали возможное влияние известного эндогенного биорегулятора изатина (индол-2,3-диона) [19-22] на взаимодействие CYP2E1 и CYP1^2 с TBXAS1. Обнаружили, что изатин в 5 раз увеличивает аффинность взаимодействия TBXAS1-CYP2E1 и не влияет на взаимодействие TBXAS^CYP!^.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Биоматериалы
В работе использовали образцы ткани печени человека, полученные от фирмы ILSbio, LLC (www.ilsbio. com). Высокоочищенные (> 95% по данным электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE)) препараты рекомбинант-ных белков: TBXAS1, цитохромы Р450 - лимонен-6-монооксигеназа (CYP2C19), стероид-20,22-лиаза (CYP11A1), стероид-llß-гидроксилаза (CYP11B1), альдостеронсинтаза (CYP11B2), таурохенодезоксихолат-6а-монооксигеназа (CYP3A4), гидроксилаза циклических углеводородов (CYP3A5), 4-нитрофенол-2-гидроксилаза (CYP2E1), микросомальный цитохром b5 (CYB5A), NADPH-цитохром-P450-редуктаза (CPR), NADPH-адренодоксинредуктаза (ADR), адренодоксин (ADX), феррохелатаза (FECH), SMAD4, RAB27B - получены в Институте биоорганической химии НАН Беларуси путем молекулярного клонирования и ге-терологической экспрессии в бактериальной системе (E. coli) с последующей очисткой с помощью металл-аффинной и ионообменной хроматографии [23, 24]. Препарат ретинолсвязывающего белка 4 (RBP4) получен от Cayman chemical (США).
Лизат ткани печени человека
Лизат получали путем гомогенизации 100 мг образца в ступке Поттера с добавлением 1 мл лизирующего буфера CellLytic Mammalian Tissue Lysis/Extraction Reagent (Sigma, США) и 10 мкл коктейля ингибиторов протеаз (Sigma, США). После центрифугирования при 13400 g и 4°С в течение 25 мин собирали супернатант, добавляли 25% глицерина и хранили при температуре -80°С. Содержание общего белка в пробах лизата, определенное спектрофотометри-чески по методу Бредфорда, составляло 10-20 мг/мл.
Прямой молекулярный фишинг
Аффинный сорбент с иммобилизованной TBXAS1 в качестве белка-наживки получали путем кова-лентного связывания белка на CNBr-сефарозе 4В (GE Healthcare, США) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Установлено, что оптимальным для связывания используемого препарата тром-боксансинтазы с сорбентом было соотношение 0.5 мг белка/1 г сорбента. Инактивацию оставшихся активных групп сорбента выполняли путем его инкубации в буфере, содержащем 100 мМ Трис-HCl (рН 7.4), 150 мМ NaCl. Прямой молекулярный фишинг осуществляли в оригинальной микроколонке (объем 200 мкл), заполненной аффинным сорбентом. В контрольных экспериментах использовали аналогич-
ную микроколонку, заполненную «пустой» (без белка-наживки) инактивированной CNBr-сефарозой 4В. В качестве рабочего буфера использовали буфер HBS-EP+ (10 мМ HEPES (pH 7.4), 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0.05% Tween 20), пропускаемый через микроколонку со скоростью потока 50 мкл/мин при температуре 15°С. Хроматографическое разделение проводили с использованием системы AKTA Purifier 10 (GE Healthcare, США). Аффинное выделение белков-партнеров тромбоксансинтазы выполняли, пропуская через колонку 2 мл лизата (0.5 мг/мл белка), разбавленного в 2 раза рабочим буфером, в течение 80 мин. Связавшиеся на сорбенте белки элюирова-ли 4% раствором HCOOH (pH 2.5) при скорости потока 50 мкл/мин в течение 100 мин. Содержание общего белка в элюатах, определенное по методу Бредфорда, составляло 25-35 мкг/мл (среднее 30 мкг/мл). Эксперименты по аффинному выделению потенциальных белков-партнеров TBXAS1 повторяли 3 раза.
LC-MS/MS-анализ
Для масс-спектрометрической идентификации белков выполняли специальную пробоподготовку. Из каждой хроматографической фракции отбирали аликвоту, содержащую 30 мкг общего белка, и подвергали стандартной процедуре трипсино-лиза с предварительным алкилированием и восстановлением сульфгидрильных групп белков. Все процедуры выполняли в концентраторах Vivaspin 500 Centrifugal Concentrator, 10 кДа MWCO (GE Healthcare, США) по методу FASP [25]. Для трип-синолиза белков использовали лиофилизирован-ный препарат трипсина из поджелудочной железы свиньи (активность 15600 Ед/мг, кат. номер V5111, Promega, США). Масс-спектрометрический анализ образцов выполняли в трех технических повторах с использованием хроматографа Agilent 1200 и масс-детектора Agilent серии 6300 с ионной ловушкой Ion Trap LC/MS (Agilent Technologies, США). Разделение пептидов выполняли на обращенно-фазовой HPLC-колонке ZORBAX Extend-C18 (2.1 х 150 мм, 1.8 мкм) (Agilent Technologies, США), в градиенте растворителя А (0.2% раствор муравьиной кислоты в воде) и растворителя B (0.2% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле) в течение 55 мин при скорости тока 350 мкл/мин. Объем образца, наносимого на колонку, составлял 15 мкл (~ 7-8 мкг материала). Характер градиента был следующим: от 0 до 20% растворителя B за 5 мин, от 20 до 80% за 40 мин, от 80 до 95% за 5 мин и 95%, 5 мин. Температура колонки - 50°C. Масс-спектры получали в режиме положительной ионизации (APESI-ионизация) со сле-
дующими параметрами: температура газа 400°C, скорость тока газа 9 л/мин, напряжение на капилляре 2 кВ, напряжение на фрагментаторе 360 В. Масс-анализатор работал в авто-MS/MS-режиме со следующими параметрами: диапазон m/z от 50 до 2200 m/z, энергию фрагментации рассчитывали по следующим формулам (3.1(m/z)/100 + 1.0)В для z = 2 и (3.6(m/z)/100 - 4.8)В для z > 3. Белки идентифицировали с помощью программы Mascot (www. matrixscience.com) с использованием базы данных SwissProt (www.uniprot.org). Использовали следующие параметры поиска: протеолитический фермент трипсин, допустимые отклонения по массе моноизотопных пептидов ± 2.6 Да, допустимые отклонения MS/MS ± 0.6 Да, число допустимых пропусков сайтов расщепления трипсином - 2, вариабельные модификации - «окисленный метионин», фиксированные модификации - «карбамидометил». В результирующий список достоверно обнаруженных белков включали только те белки, идентифицируемые при трех технических повторах то значимостью 0.01 и Mascot Score > 50.
Поверхностный плазмонный резонанс (SPR)
Анализ ББВ выполняли на четырехканальном оптическом биосенсоре Biacore 3000 (GE Healthcare, США), работающем на эффекте поверхностного плазмонного резонанса под управлением компьютерной программы Biacore Control Software v. 1.0. Сигналы биосенсора регистрировали в резонансных единицах RU (1 RU соответствует связыванию 1 пг белка на поверхности оптического чипа). Значения равновесных констант диссоциации (Kd), констант скорости образования (kon) и распада (koff) комплексов рассчитывали с помощью программного комплекса BiaEvaluation v. 4.1.
Иммобилизацию TBXAS1 осуществляли путем формирования ковалентных связей между карбоксильными группами на поверхности оптического чипа СМ5 и свободными аминогруппами белка. С этой целью использовали набор Amine Coupling Kit (GE Healthcare, США), а инжекцию образца TBXAS1 (50 мкг/мл) в 10 мМ ацетатном буфере (рН 5.0) выполняли со скоростью 5 мкл/мин в течение 20 мин. Уровень иммобилизации TBXAS1 в рабочем канале оптического биосенсора в среднем составлял 7500 RU (7.5 нг/мм2).
Регистрацию взаимодействий тестовых белков с иммобилизованной TBXAS1 осуществляли в режиме реального времени путем инжекций образцов белков в диапазоне концентраций от 50 нМ до 5 мкМ сначала через контрольный (без белка) и рабочий (с иммобилизованной TBXAS1) каналы оптического биосенсора в течение 10 мин при скорости по-
тока 5 мкл/мин. После каждого измерения выполняли регенерацию поверхности оптического чипа путем инжекции буфера, содержавшего 2 M NaCl и 0.4% CHAPS, в течение 30 с при скорости потока 20 мкл/мин. Все измерения выполняли не менее 4 раз, что обеспечивало достаточную точность и воспроизводимость результатов (значение CV было менее 10%). В экспериментах по оценке возможного влияния непептидного низкомолекулярного эндогенного биорегулятора изатина (2,3-диоксоиндола) на ББВ с участием TBXAS1 к образцам белков-ана-литов добавляли изатин в конечной концентрации 100 мкМ и инкубировали смесь в течение 15 мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для выявления новых белков-партнеров TBXAS1 использовали образцы ткани печени, поскольку в них экспрессируется как целевой белок, так и рецептор к TXA2. Комплексный подход, основанный на технологии прямого молекулярного фишинга на аффинном сорбенте с иммобилизованным на CNBr-сефарозе 4B целевым белком, масс-спектрометрической идентификации выделенных белков и валидации ББВ с SPR, позволил выделить и идентифицировать 12 потенциальных белков-партнеров TBXAS1 из лизата ткани печени человека (таблица).
На сегодняшний день в научной литературе отсутствует какая-либо информация о взаимодействии этих белков с TBXAS1. Однако можно сделать некоторые предположения об их возможной функциональной взаимосвязи с TBXAS1.
Например, белок BBIP1 (компонент BBSome, транспортного белкового комплекса ресничек) принимает участие в регуляции стабильности клеточного цитоскелета [26, 27].
Информация о ANKMY1 существует только на уровне транскрипта. Тем не менее, в его структуре выделяют анкириновые повторы, которые образуют один из наиболее распространенных интерфейсов для ББВ. Эти повторы обнаружены в белках, которым свойственны разнообразные функции [28]. Исходя из этого мы предполагаем, что анкириновые повторы ANKMY1 могут специфически узнавать определенные структурные мотивы TBXAS1, обеспечивая взаимодействия этих белков.
Вместе с тем, необходимо отметить, что белки, идентифицированные в результате прямого молекулярного фишинга, могут рассматриваться только в качестве потенциальных партнеров TBXAS1, так как из-за особенностей данной технологии из ли-зата могут быть выделены не только реальные белки-партнеры, но и «выловленные» вместе с ними посторонние белки, находящиеся в составе сложных надмолекулярных комплексов или мицелл [17]. В по-
Рис. 1. Схематическое представление системы биосинтеза TXA2, дополненное полученными нами экспериментальными данными. PLC - фосфолипаза C, PLA2 - фосфолипаза А2, COX - циклооксигеназа. Биосинтез TXA2 начинается с высвобождения арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембраны с помощью PLA2. Затем COX катализирует реакцию превращения арахидоновой кислоты в про-стагландин Н2, который затем метаболизиру-ется TBXAS1 с образованием TXA2, 12-HHT и MDA. Параллельно с этим простагландин Н2 превращается CYP2E1 в 12-HHT и MDA. TXA2, связываясь с TXAR, вызывает передачу сигнала по инозитолфосфатному пути с активацией PLC и мобилизацией внутриклеточного Ca2+, что оказывает стимулирующее действие на PLA2. 12-HHT под действием 15-гидрок-сипростагландина дегидрогеназы образует ^-кето-HHT, оказывающий частичный антагонистический эффект на TXAR. TBXAS1 предположительно взаимодействует с BBIP1, который является компонентом белкового транспортного комплекса ресничек (BBSome). BBIP1, в свою очередь, способен влиять на стабильность микротубулинового цитоскелета, опосредованно ингибируя HDAC6 (гистондеа-цетилазу 6)
лученном нами «улове» (таблица) к подобным белкам можно отнести SERPINA1, SERPINA3, АРОН, FGA и FN1, которые входят в каскад свертывания крови [29, 30], а также сывороточные белки НР, SAA1, СР, которые могут иметь высокий уровень неспецифической сорбции.
Особый интерес представляет присутствие в списке «улова» белка, CYP2E1, относящегося к классу цитохромов Р450. Функциональная связь CYP2E1 с TBXAS1 может иметь важное значение в контексте взаимодополняющих ферментативных реакций превращения общих субстратов. Как известно, для CYP2E1 характерны широкая субстратная специфичность и широкий профиль тканевой локализации, включая печень [31]. Например, CYP2E1 способен окислять арахидоновую кислоту (посредством ю-1-гидроксилирования), а также простагландин Н2 [32] до побочных метаболитов, которые, в свою очередь, образуются в реакциях изомеризации про-стагландина Н2 в тромбоксан А2. Дальнейший метаболит одного из продуктов реакции - 12-кето-ННТ - способен влиять на эффекты ТХА2 за счет увеличения продукции простациклина и антагонистического действия на TXAR [4, 5]. Таким образом, совместная локализация TBXAS1, осуществляющей синтез тромбоксана А2, и CYP2E1, могла бы служить
дополнительным механизмом регуляции эффективности ферментативных реакций превращения общих субстратов. С другой стороны, следствием олигоме-ризации разных цитохромов Р450 может быть также изменение каталитических параметров ферментативных реакций, например, сродства ферментов к субстрату [33]. Схематическое представление системы биосинтеза TXA2, дополненное полученными нами экспериментальными данными, представлено на рис. 1.
Возможность образования гетеромерного комплекса TBXAS1/CYP2E1 подтверждена в прямых экспериментах с использованием технологии SPR и иммобилизованной на оптическом чипе СМ5 TBXAS1 (рис. 2). Для проверки специфичности взаимодействий TBXAS1 и CYP2E1 проведены контрольные SPR-эксперименты по регистрации возможных взаимодействий с тромбоксансинтазой других бел-ков-аналитов: микросомальных (CYP2C19, CYP3A4, CYP3A5) и митохондриальных (CYP11A1, CYP11B1, CYP11B2) цитохромов Р450, известных белков-партнеров цитохромов Р450 (CYB5A, CPR, ADR, ADX), а также ряда белков, не имеющих отношения к монооксигеназным системам цитохромов Р450 (FECH, SMAD4, RAB27B, RBP4) (рис. 3). Все остальные белки, за исключением CYP11B2, даже в микро-
Рабочий буфер
300-
э
X га
р о
и
I
е
и
о и б
| 100 и
и
-100
0.2 мкМ
CYP2E1
0.5 мкМ 2.0 мкМ
200
Рабочий буфер
400 600
Время, с
600
3 X
а, р
о с
I
е с о и б
с
а
I !_
и
и
500
400
300
200
100
-100
0.50 мкМ 0.25 мкМ
0.10 мкМ 0.05 мкМ
200
400 600 Время, с
800
1000
0.8
М
к
м
0.6
0.4
Рис. 3. Типичные серии сенсограмм взаимодействия CYP11B2 в разных концентрациях с иммобилизованной на оптическом чипе СМ5 TBXAS1
молярных концентрациях не связывались с иммобилизованной на оптическом чипе TBXAS1.
Аналогичный контрольный эксперимент с использованием TBXAS1 в качестве белка-аналита показал отсутствие процесса ее димеризации или олигоме-ризации. Таким образом, можно с уверенностью утверждать, что взаимодействие CYP2E1 и CYP11B2 с TBXAS1 является высокоспецифичным.
Вычисленные значения Кй образования комплексов TBXAS1•CYP11B2 и TBXAS1•CYP2E1 составили (6.9 ± 0.3) х 10-7 М и (4.3 ± 0.4) х 10-7 М соответственно. Эти значения сопоставимы с К комплексов
d
различных цитохромов Р450 с их функциональными партнерами (CPR, CYB5A, ADX) [23, 34-37]. Важно отметить, что при небольшом различии в аффинности комплексообразования (К различаются при-
0.2
800
□ Изатин (-)
□ Изатин (+)
1000
ь
CYP2E1
Рис. 2. Типичные серии сенсограмм взаимодействия CYP2E1 в разных концентрациях с иммобилизованной на оптическом чипе СМ5 TBXAS1
CYP11B2
Рис. 4. Диаграмма значений равновесных констант диссоциации комплексов (К^ TBXAS1• CYP2Е1 и TBXAS • CYP11B2 в отсутствие и в присутствии 100 мкМ изатина; М ± т, п = 3
мерно в 2 раза) взаимодействия TBXAS1• CYP11B2 и TBXAS1 • CYP2E1 сильно отличаются по кинетическим параметрам: образование и распад комплекса TBXAS1•CYP2E1 происходят примерно на порядок медленнее, чем TBXAS1 • CYP11B2. Константы скорости образования комплекса (к ) отличаются в 10
0
0
0
0
ТОМ 9 № 4 (35) 2017 | АСТА ^ТОИАЕ | 101
Масс-спектрометрическая идентификация белков в элюатах с хроматографических микроколонок, наполненных аффинным сорбентом
№ TeH Белок М.м., Да Входной номер!1 Score15 Пептидыв emPAP
Сорбент с иммобилизованной тромбоксансинтазой (только опыт). Потенциальные белки-партнеры тромбоксансинтазы (TBXAS1)
1 FGA Fibrinogen alpha chain 95656 P02671 97 19 (2) 0.04
2 FN1 Fibronectin 266052 P02751 95 14 (2) 0.01
3 CP Ceruloplasmin 122983 Q24478 85 10 (5) 0.03
4 SERPINA3 Alphal-antichymotrypsin 47792 P01011 67 9 (3) 0.08
5 SAA1 Serum amyloid A1 protein 13581 P0DJI8 67 7 (3) 0.29
6 CYP2E1 Cytochrome P450 2E1 56849 P05181 61 11 (4) 0.12
7 ANKMY1 Ankyrin repeat and MYND domain-containing protein 1 107101 Q9P2S6 59 25 (7) 0.03
8 ACTB Actin, cytoplasmic 1 42052 P60709 56 17 (2) 0.13
9 BBIP1 BBSome-interacting protein 1 10557 A8MTZ0 54 10 (4) 0.38
10 SERPINA1 Alpha 1-antitrypsin 46878 P01009 50 3 (3) 0.13
11 APOH Beta2-glycoprotein 1 39584 P02749 52 3 (3) 0.09
12 HP Haptoglobin 45861 Q61687 50 42 (6) 0.21
Сорбент без иммобилизации белка (только контроль)
1 ACY1 Aminoacylase-1 46084 Q03154 59 17 (3) 0.08
2 ADH1A Alcohol dehydrogenase 1A 40745 P07327 189 85 (19) 0.42
3 SLC25A4 ADP/ATP translocase 1 33271 P12235 59 16 (5) 0.24
4 SLC25A5 ADP/ATP translocase 2 33059 P05141 71 27 (5) 0.11
5 MAOB Amine oxidase [flavin-containing] B 59238 P27338 147 31 (8) 0.20
6 ASL Argininosuccinate lyase 51910 P04424 89 9 (3) 0.07
7 ASS1 Argininosuccinate synthase 46786 P00966 59 48 (6) 0.17
8 ATP5B ATP synthase subunit beta, mitochondrial 56525 P25705 108 27 (4) 0.07
9 ATP5C1 ATP synthase subunit gamma, mitochondrial 33032 P36542 95 16 (4) 0.24
10 CALR Calreticulin 48283 P27797 68 10 (4) 0.25
11 HSPD1 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 61187 P10809 126 28 (7) 0.13
12 CPS1 Carbamoyl-phosphate synthase [ammonia], mitochondrial 165975 P31327 249 119 (27) 0.17
13 DEFA1 Neutrophil defensin 1 10536 P59665 58 8 (5) 0.38
14 FBP1 Fructose-1,6-bisphosphatase 1 37218 P09467 78 4 (3) 0.10
15 FABP1 Fatty acid-binding protein, liver 14256 P07148 184 29 (17) 1.08
16 GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 36201 P04406 169 23 (5) 0.22
17 AGL Glycogen debranching enzyme 176819 P35573 77 18 (7) 0.06
18 SHMT1 Serine hydroxymethyltransferase, cytosolic 53619 P34896 88 16 (5) 0.14
19 HSPA5 78 kDa glucose-regulated protein 72402 P11021 75 19 (4) 0.11
20 GSTA1 Glutathione S-transferase A1 25672 P08263 94 74 (13) 1.29
21 IDH1 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic 46915 O75874 274 15 (9) 0.17
22 IDH2 Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial 51333 Q8IQA7 105 10 (4) 0.15
23 LDHA L-lactate dehydrogenase A chain 36950 P00338 240 9 (8) 0.21
24 NONO Non-POU domain-containing octamer-binding protein 54311 Q15233 102 27 (6) 0.14
25 PGM1 Phosphoglucomutase-1 61696 P36871 120 10 (6) 0.12
26 SFPQ Splicing factor, proline- and glutamine-rich 76216 P23246 106 27 (7) 0.10
27 ACAT1 Acetyl-CoA acetyltransferase, mitochondrial 45456 P24752 60 11 (4) 0.17
28 TPI1 Triosephosphate isomerase 31057 P60174 150 12 (4) 0.26
29 UGT2B10 UDP-glucuronosyltransferase 2B10 61190 P36537 55 8 (3) 0.06
30 UGP2 UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase 57076 Q16851 72 15 (4) 0.13
Контроль (К) и опыт (О)
1 UGP2 Alcohol dehydrogenase 1B 40684 P00325 408 117 (34) 1.02
90 53 (6) 0.30
2 ADH4 Alcohol dehydrogenase 4 41108 P08319 222 36 (16) 0.42
85 13 (8) 0.30
3 ALB Serum albumin 71317 P02768 2790 360 (150) 1.90
959 186 (50) 0.66
4 ALDH2 Aldehyde dehydrogenase, mitochondrial 56859 P05091 400 33 (15) 0.29
94 7 (3) 0.07
5 ALDOB Fructose-bisphosphate aldolase B 39961 P05062 167 25 (8) 0.31
220 28 (8) 0.09
6 APOA1 Apolipoprotein A-I 30759 P02647 98 12 (6) 0.42
53 25 (6) 0.59
7 ATP5F1 ATP synthase subunit b, mitochondrial 28947 P24539 192 17 (10) 0.45
97 13 (5) 0.28
8 ATP5L ATP synthase subunit g, mitochondrial 11421 O75964 265 7 (6) 0.35
157 5 (5) 0.35
9 DCXR L-xylulose reductase 26182 Q7Z4W1 194 27 (6) 0.15
161 8 (5) 0.15
10 DECR1 2,4-dienoyl-CoA reductase, mitochondrial 36330 Q16698 250 24 (11) 0.22
222 13 (8) 0.10
11 HSD17B4 Peroxisomal multifunctional enzyme type 2 80092 P51659 1754 179 (87) 1.26
112 16 (5) 0.09
12 SORD Sorbitol dehydrogenase 38927 Q00796 171 17 (13) 0.44
73 7 (4) 0.10
13 CES1 Liver carboxylesterase 1 62766 P23141 88 28 (4) 0.06
83 20 (4) 0.06
14 HBA1 Hemoglobin subunit alpha 15305 P69905 70 48 (10) 2.90
82 16 (6) 0.25
15 HBB Hemoglobin subunit beta 16102 P68871 153 30 (11) 0.54
222 29 (14) 0.54
16 HMGCS2 Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, mitochondrial 57113 P22791 249 26 (13) 0.37
98 10 (3) 0.07
17 HRG Histidine-rich glycoprotein 60510 P04196 60 14 (6) 0.13
52 9 (5) 0.13
18 PHB2 Prohibitin-2 33276 Q99623 107 11 (4) 0.11
99 7 (3) 0.11
19 ACAA2 3-ketoacyl-CoA thiolase, mitochondrial 42354 P42765 82 20 (6) 0.18
71 15 (3) 0.18
20 TF Serotransferrin 79294 P02787 138 20 (6) 0.15
142 22 (7) 0.20
21 SLC25A1 Tricarboxylate transport protein, mitochondrial 34333 P53007 70 9 (4) 0.23
54 10 (3) 0.23
а - Входящие номера в базе данных Uniprot (http://www.uniprot.org). б - Показатель надежности определения пептидов масс-спектрометрией (MASCOT score). в - Число пептидов MASCOT; число уникальных пептидов (в скобках). г - emPAI - Exponentially Modified Protein Abundance Index. Названия идентифицированных белков приведены в том виде, в котором они фигурируют в базе данных Uniprot, использованной для их идентификации.
раз, а константы скорости распада комплекса (koff) -в 15 раз.
Обнаружение специфического комплексообразо-вания TBXAS1 • CYP11B2 оказалось действительно новым и неожиданным результатом, ибо CYP11B2 отсутствовал в качестве идентифицированного белка-партнера как в контроле, так и в опыте при молекулярном фишинге из лизата ткани печени (таблица). Эти данные вполне сопоставимы, не обусловлены появлением ложноотрицательного результата молекулярного фишинга и могут быть объяснены с точки зрения тканеспецифичного профиля экспрессии CYP11B2 (преимущественная экспрессия в ткани надпочечников), что следует из информации в открытых интернет-ресурсах Proteinatlas (http:// www.proteinatlas.org) и Ge^cards (http://www. genecards.org) и публикации [38]. О функциональных последствиях данного ББВ и его причинах пока говорить затруднительно, поэтому в настоящей работе приведен только сам факт экспериментального подтверждения прямого взаимодействия TBXAS1 с CYP11B2.
Известно, что одним из субстратов ряда цитохро-мов P450 (CYP2A6, CYP2C19 и CYP2E1), ответственных за метаболизм разнообразных ксенобиотиков, является индол, который окисляется до изатина [18]. Изатин - эндогенный биорегулятор с широким спектром биологических и фармакологических активностей, которые реализуются при его взаимодействии с многочисленными внутриклеточными изатинс-вязывающими белками [19-22, 39-41]. Поскольку среди белков, взаимодействующих с TBXAS1, оказался цитохром Р450 CYP2E1, мы предположили, что изатин может влиять на образование комплекса TBXAS1-CYP2E1. Для проверки данной гипотезы проведен SPR-анализ взаимодействия CYP2E1 с иммобилизованной на оптическом чипе TBXAS1 в отсутствие и в присутствии изатина. В качестве контроля использовали другую пару белков -TBXAS1- CYP11B2. Обнаружили, что изатин действительно влияет на формирование комплекса TBXAS1-CYP2E1, увеличивая аффинность взаи-
модействия в 5 раз, и при этом не действует на взаимодействие TBXAS1• CYP11B2 (рис. 4). Эффект пятикратного увеличения аффинности комплексо-образования TBXAS1•СYP2E1 в присутствии изатина обусловлен как увеличением скорости образования комплекса (величина коп выросла в 2 раза), так и снижением скорости его распада (коИ уменьшилась 2.5 раза).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
С использованием комплексного прямого молекулярного фишинга с последующей масс-спектрометрической идентификацией из лизата ткани печени человека выделены 12 потенциальных белков-партнеров тромбоксансинтазы, относящихся к белкам цитоскелета, коагуляционного каскада крови и цитохромов Р450. С помощью SPR-технологии впервые показано прямое взаимодействие двух ци-тохромов Р450 (CYP2E1 и СYP11B2) с тромбоксан-синтазой. Впервые показано, что аффинность образования комплекса TBXAS1•CYP2E1 пятикратно увеличивается в присутствии низкомолекулярного непептидного эндогенного биорегулятора изатина (2,3-диоксоиндола). Полученные результаты дают основание предполагать наличие у TBXAS1 других функций, таких, как участие в функционировании цитоскелета и регуляции биосинтеза биологически активных молекул. •
Работы по получению рекомбинантных белков выполнены в ИБОХ НАН Беларуси при поддержке БРФФИ (грант № Х16Р-062). Работы по молекулярному фишингу и идентификации потенциальных белков-партнеров тромбоксансинтазы были выполнены в ИБМХ при поддержке РФФИ (грант № 16~54~00097 Бел_а), а работы по исследованию влияния изатина на ББВ с участием TBXAS1 -при поддержке РНФ (грант № 16-14-10327). LC-MS/MS-идентификация белков выполнена в ЦКП «Протеом человека» при ИБМХ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Waterman M.R., Pikuleva I.A. Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, Weinheim, Germany: Wiley-VCH., 2006. 716 p.
2. Hamberg M., Svensson J., Samuelsson B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. № 8. P. 2994-2998.
3. Haurand M., Ullrich V. // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 1505915067.
4. Uchida K. // Trends Cardiovasc. Med. 1999. V. 9. № 5. P. 109-113.
5. Chaudhary A.K., Nokubo M., Reddy G.R., Yeola S.N., Morrow J.D., Blair I.A., Marnett L.J. // Science. 1994. V. 265. № 5178.
P. 1580-1582.
6. Sadowitz P.D., Setty B.N., Stuart M. // Prostaglandins. 1987. V. 34. № 5. P. 749-763.
7. Ruf A., Mundkowski R., Siegle I., Hofmann U., Patscheke H., Meese C.O. // Br. J. Haematol. 1998. V. 101. № 1. P. 59-65.
8. Shen R.F., Tai H.H. // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. № 25. P. 11592-11599.
9. Ullrich V., Nüsing R. // Stroke. 1990. V. 21. № 12 Suppl. P. IV 134-138.
10. Nüsing R., Sauter G., Fehr P., Dürmüller U., Kasper M., Gudat F., Ullrich V. // Virchows Arch. A. Pathol. Anat. Histopathol. 1992. V. 421. № 3. P. 249-254.
11. Huang J.-S., Ramamurthy S.K., Lin X., Le Breton G.C. // Cell. Signal. 2004. V. 16. № 5. P. 521-533.
12. Ivanov A.S., Zgoda V.G., Archakov A.I. // Russ. J. Bioorganic Chem. 2011. V. 37. № 1. P. 4-16.
13. Huttlin E.L., Ting L., Bruckner R.J., Gebreab F., Gygi M.P., Szpyt J., Tam S., Zarraga G., Colby G., Baltier K., et al. // Cell.
2015. V. 162. № 2. P. 425-440.
14. Nathan J.A., Kim H.T., Ting L., Gygi S.P., Goldberg A.L. // EMBO J. 2013. V. 32. № 4. P. 552-565.
15. Ershov P., Mezentsev Y., Gnedenko O., Mukha D., Yantsevich A., Britikov V., Kaluzhskiy L., Yablokov E., Molnar A., Ivanov A., et al. // Proteomics. 2012. V. 12. № 22. P. 3295-3298.
16. Ivanov A.S., Medvedev A., Ershov P., Molnar A., Mezentsev Y., Yablokov E., Kaluzhsky L., Gnedenko O., Buneeva O., Haid-ukevich I., et al. // Proteomics. 2014. V. 14. № 20. P. 2261-2274.
17. Ivanov A.S., Ershov P.V., Molnar A.A., Mezentsev Y.V., Kaluzhskiy L.A., Yablokov E.O., Florinskaya A.V., Gnedenko O.V., Medvedev A.E., Kozin S.A., et al. // Russ. J. Bioorganic Chem.
2016. V. 42. № 1. P. 14-21.
18. Gillam E.M., Notley L.M., Cai H., De Voss J.J., Guengerich F.P. // Biochemistry. 2000. V. 39. № 45. P. 13817-13824.
19. Medvedev A.E., Clow A., Sandler M., Glover V. // Biochem. Pharmacol. 1996. V. 52. № 3. P. 385-391.
20. Medvedev A., Igosheva N., Crumeyrolle-Arias M., Glover V. // Stress. 2005. V. 8. № 3. P. 175-183.
21. Medvedev A., Buneeva O., Glover V. // Biologics. 2007. V. 1. № 2. P. 151-162.
22. Pandeya S.N., Smitha S., Jyoti M., Sridhar S.K. // Acta Pharm. 2005. V. 55. № 1. P. 27-46.
23. Сергеев Г.В., Гилеп А.А., Усанов С.А. // Биохимия. 2014. Т. 79. № 5. С. 520-531.
24. Дормешкин Д.О., Свирид А.В., Гилеп А.А., Усанов С.А. // Докл. Нац. акад. наук Беларуси. 2015. Т. 59. № 2. С. 53-60.
25. Wisniewski J.R., Zougman A., Nagaraj N., Mann M. // Nat. Methods. 2009. V. 6. № 5. P. 359-362.
26. Loktev A.V., Zhang Q., Beck J.S., Searby C.C., Scheetz T.E., Bazan J.F., Slusarski D.C., Sheffield V.C., Jackson P.K., Na-chury M.V. // Dev. Cell. 2008. V. 15. № 6. P. 854-865.
27. Cerecedo D. // Blood Coagul. Fibrinolysis. 2013. V. 24. P. 798-808.
28. Mosavi L.K., Cammett T.J., Desrosiers D.C., Peng Z. // Protein Sci. 2004. V. 13. № 6. P. 1435-1448.
29. Moussavi-Harami S.F., Annis D.S., Ma W., Berry S.M., Coughlin E.E., Strotman L.N., Maurer L.M., Westphall M.S., Coon J.J., Mosher D.F., et al. // J. Proteome Res. 2013. V. 12. № 7. P. 3393-3404.
30. Pankov R., Yamada K.M. // J. Cell Sci. 2002. V. 115. Pt 20. P. 3861-3863.
31. Lu Y., Cederbaum A.I. // Free Radic. Biol. Med. 2008. V. 44. № 5. P. 723-738.
32. Arnold C., Konkel A., Fischer R., Schunck W.-H. // Pharmacol. Rep. 2010. V. 62. № 3. P. 536-547.
33. Davydov D.R., Davydova N.Y., Sineva E. V., Halpert J.R. // J. Biol. Chem. 2015. V. 290. № 6. P. 3850-3864.
34. Gnedenko O.V., Yablokov E.O., Usanov S.A., Mukha D.V., Sergeev G.V., Bulko T.V., Kuzikov A.V., Moskaleva N.E., Shu-myantseva V.V., Ivanov A.S., et al. // Chem. Phys. Lett. 2014. V. 593. P. 40-44.
35. Bridges A., Gruenke L., Chang Y.T., Vakser I.A., Loew G., Waskell L. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. № 27. P. 17036-17049.
36. Strushkevich N., MacKenzie F., Cherkesova T., Grabovec I., Usanov S., Park H.-W. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. V. 108. № 25. P. 10139-10143.
37. Lewis D.F., Hlavica P. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1460. № 2-3. P. 353-374.
38. Fallo F., Pezzi1 V., Barzon L., Mulatero P., Veglio F., Sonino N., Mathis J. M. // Eur. J. Endocrinol. 2002. V. 147. P. 795-802.
39. Бунеева O.A., Копылов A.T., Тихонова O. В., Згода В.Г., Медведев А.Е., Арчаков А.И. // Биохимия 2012. Т. 77. № 11. С. 1584-1599.
40. Buneeva O., Gnedenko O., Zgoda V., Kopylov A., Glover V., Ivanov A., Medvedev A., Archakov A. // Proteomics. 2010. V. 10. № 1. P. 23-37.
41. Medvedev A.E., Buneeva O.A., Kopylov A.T., Gnedenko O.V., Medvedeva M.V., Kozin S.A., Ivanov A.S., Zgoda V.G., Makarov A.A. // Int. J. Mol. Sci. 2014. V. 16. № 1. P. 476-495.
