CC BY
8
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2023. No. 1
Научная статья УДК 514.8, 577.35
doi: 10.18522/1026-2237-2023-1-17-23
ПРОЯВЛЕНИЕ СФЕРИЧЕСКОЙ ГЕОМЕТРИИ В МОНОСЛОЯХ КЛЕТОК *
Д.С. Рошальш, К. Аззаг2, К.К. Федоренко3, С.Б. Рошаль4, С. Багдигьян5
3■4Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону, Россия 2Университет Миннесоты, Миннеаполис, США 5 Университет Монпелье, Монпелье, Франция
1 roshal@sfedu.ruB
2 kazzag@umn.edu
3 fedorenkokiri@bk. ru
4 sbroshal@sfedu.ru
5 stephen.baghdiguian@univ-montp2.fr
Аннотация. Представление об эпителии как разбиении плоскости на многоугольники существует уже несколько столетий, но до сих пор точно неясно, как клеточная геометрия влияет на процессы, происходящие во время трансформации плоских эпителиальных монослоев в структуры со сложной геометрией. В данной работе исследованы топологические характеристики упаковки клеток в зависимости от формы эпителия. С этой целью проанализировано более 50 микрофотографий плоского и сферического эпителия. Проведено сравнение средней топологической дефектности плоских и сферических монослоев. Полученные распределения клеток по числу их соседей демонстрируют неизвестные ранее различия между сферическим и плоским случаями. Обсуждаются топологические дефекты в упаковке данных клеток. В отличие от более упорядоченных абиотических упаковок в сферических монослоях исследуемых клеток невозможно выделить линейные топологические дефекты в виде рубцов или складок.
Ключевые слова: эпителиальные клетки, топологические дефекты, сферическая геометрия, распределение клеток по числу их соседей, клетки COS, клеточные упаковки, пролиферативный эпителий, самоорганизация
Благодарности: исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-72-00128, https://rscf.ru/project/22-72-00128/.
Для цитирования: Рошаль Д.С., Аззаг К., Федоренко К.К., Рошаль С.Б., Багдигьян С. Проявление сферической геометрии в монослоях клеток // Известия вузов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2023. № 1. С. 17-23.
Статья опубликована на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International (CC-BY4.0).
Original article
MANIFESTATION OF SPHERICAL GEOMETRY IN CELL MONOLAYERS
D.S. Roshalm, K. Azzag2, K.K. Fedorenko3, S.B. Rochal4, S. Baghdiguian5
13 •4 Southern Federal University, Rostov-on-Don, Russia 2 University of Minnesota, Minneapolis, USA 5 Université de Montpellier, Montpellier, France
1 roshal@sfedu.ruB
2 kazzag@umn.edu
3 fedorenkokiri@bk. ru
4 sbroshal@sfedu.ru
5 stephen.baghdiguian@univ-montp2.fr
© Рошаль Д.С., Аззаг К., Федоренко К.К., Рошаль С.Б., Багдигьян С., 2023
Abstract. Despite the fact that the representation of epithelium as a tessellation of a plane into polygons has existed for several centuries, it is still not clear exactly how cellular geometry affects the transformation from plane epithelial monolayers into structures with complex geometry. In this work we study the topological characteristics of cell packing depending on the shape of the epithelium. More than 50 micrographs ofplane and spherical epithelium were analyzed. The average topological defectiveness of flat and spherical monolayers is compared. The obtained distributions of cells according to the number of their neighbors demonstrate a previously unknown difference between spherical and planar cases. Topological defects in the packing of these cells are also analyzed in the work. In contrast to more ordered abiotic packings, it is impossible to distinguish linear topological defects in the form of scars or pleats in the spherical monolayers of investigates cells.
Keywords: epithelial cells, topological defects, spherical geometry, distribution of cells by the number of their neighbors, COS cells, cell packing, proliferative epithelium, self-organization
Acknowledgments: the study was supported by the Russian Science Foundation grant No. 22-72-00128, https://rscf.ru/project/22-72-00128/.
For citation: Roshal D.S., Azzag K., Fedorenko K.K., Rochal S.B., Baghdiguian S. Manifestation of Spherical Geometry in Cell Monolayers. Bulletin of Higher Educational Institutions. North Caucasus Region. Natural Science. 2023;(1):17-23. (In Russ.).
This is an open access article distributed under the terms of Creative Commons Attribution 4.0 International License (CC-BY4.0).
Введение
Геометрические и топологические методы важны в биологических исследованиях. Благодаря им были построены современные теории строения ДНК [1], вирусных оболочек [2], особенностей филотаксиса (расположение листьев на стебле растения) [3]. Исторически одним из первых геометрических наблюдений в биологии было исследование Р. Гуком топологических характеристик отдельных клеток лукового эпителия. В 1665 г. он обнаружил, что границы клеток выглядят как многоугольники. Первый статистический анализ распределения клеток по числу их ближайших соседей был проведен в 1926 г. для эпителия огурца [4]. Значительно позже, в 2006 г., было показано, что сходные распределения характерны для ряда пролиферативных (медленно делящихся) эпителиев многих видов растений и животных [5]. Очевидно, что данная топологическая инвариантность (сходство распределений) тесно связана с физиологической инвариантностью нормального эпителия [5]: у всех многоклеточных организмов эпителий действует как селективный барьер, который контролирует потоки питательных веществ, регулирует ионный и водный баланс и защищает хозяина от антигенов и микробов.
На ранних стадиях эмбрионального развития у млекопитающих плоские эпителиальные монослои могут образовывать структуры сложной геометрии. Например, примитивная эндодерма трансформируется в желточный мешок, который выполняет множество функций в зародыше [6]. Изменение формы также происходит во время образования эпителиальных трубок, которые затем войдут в состав различных желез, легких, почек и других органов животных и человека [7]. Изгиб, наблюдаемый при формировании кишечных ворсинок, является еще одним примером трансформации плоской структуры [8].
Недавно были найдены общие морфологические признаки (специфические топологические дефекты) сферического эпителия икринок асцидий [9] и коллоидных кристаллов [10, 11]. Другие топологические дефекты, подобные типичным для жидких кристаллов, контролируют апоптоз (смерть) и экструзию (выталкивание) клеток из монослоя [12]. Топологические методы успешно используются для объяснения различных морфологических преобразований эпителия. Например, нормальное развитие эпителия включает переход от быстро делящихся мезенхимальных (стволовых) клеток к обычному пролиферативному эпителию, что приводит к резкому снижению подвижности и скорости деления клеток. При этом переходе клетки принимают более правильную форму с меньшим средним периметром. Обратный процесс, приводящий к появлению вытянутых клеток с высокой подвижностью, связан с формированием раковых опухолей и метастазов [13].
Цель данной работы - рассмотреть топологические аспекты изменения формы и кривизны эпителия на примере выращенных в лабораторных условиях монослоев клеток эпителия почек африканских зеленых обезьян (COS) с плоской и сферической топологиями.
Выращивание клеток и получение изображений
Линия COS-клеток была получена впервые в 60-е гг. ХХ в. в лабораторных условиях путем воздействия на эпителий почек африканских зеленых обезьян вирусом SV40. Клетки COS (COS-1 (ATCC CRL-1650) - подарок от Института биотерапии (Монпелье, Франция)) высевали либо на стандартные чашки Петри (для выращивания плоских монослоев), либо на гидрофобные чашки Петри в особую питательную среду для получения сферических монослоев.
Далее клетки COS фиксировали и обрабатывали флуоресцентными красителями для получения контура клеток (метка TRITC фаллоидином) и ядер (метка DAPI). Образцы анализировали с помощью лазерного конфокального микроскопа Leica SPE (Montpellier RIO Imaging, Франция).
Анализ изображений
С помощью компьютерной программы на языке Python определялись геометрические центры ядер клеток (центры областей голубого цвета на изображении). Ближайшие друг к другу центры ядер соединялись линиями по методу триангуляции Делоне [14]. Также строилось разбиение Вороного и рассчитывались площади эпителиальных клеток (площади ячеек Вороного). Для проведения корректного статистического анализа отбрасывались ячейки, расположенные слишком близко к границе изображения, количество соседей для которых невозможно определить. Заметим, что даже если есть возможность построить замкнутую ячейку Вороного, необходимо проверить, может ли граница ячейки быть изменена дополнительными гипотетическими ядрами, лежащими непосредственно за границей изображения. Поэтому центр достоверно построенной ячейки Вороного должен располагаться как минимум в два раза дальше от границы изображения, чем любая из вершин этой ячейки.
Общие замечания о топологических особенностях плоских и сферических клеточных монослоев
Многие физические и биологические объекты, в том числе вирусные оболочки, сферические коллоидные кристаллы и сферический эпителий икринок асцидий, состоят из структурных единиц, образующих искривленные двумерные структуры с локальным гексагональным порядком. Во всех этих системах структурные элементы имеют примерно один размер и плотно упакованы относительно друг друга, образуя локально периодический порядок со сферической топологией. При этом гауссова кривизна сферических оболочек запрещает полностью бездефектное покрытие сферы периодическим порядком и порождает топологические дефекты - структурные элементы, число соседей которых Ф 6 (рис. 1).
Рис. 1. Плотные упаковки на сфере. Структурные элементы с числом соседей, отличным от 6, выделены цветом: a, b - решение проблемы Томсона [15] для N=72 и 842 частиц; c - сферический коллоидный кристалл [10]; d - эпителий икринки асцидии [9] / Fig. 1. Dense packings on a sphere. Structural elements with a number of neighbors other than 6 are highlighted in color: a, b - solutions to the Thomson problem [15] for N=72, and 842 particles; c - spherical colloidal crystal [10]; d - ascidian egg epithelium [9]
Топологическим зарядом клетки с числом соседей i называется величина qt = 6 — i [11].
Если рассматривать каждый треугольник триангуляции Делоне, основанной на центрах ядер клеток сферического эпителия, как грань многогранника, то можно воспользоваться теоремой Эйлера, связывающей число ребер (Р), граней (Г) и вершин (В) многогранника: B - P + Г = 2, и показать, что суммарный топологический заряд всех клеток на сфере равен 12. Так как для бесконечного плоского монослоя среднее число соседей у клетки равно 6, то суммарный топологический заряд бесконечного плоского эпителия равен 0. Топологическую дефектность плотной упаковки можно охарактеризовать классическим для биологии способом [5] с помощью гистограммы распределения клеток по числу их соседей (рис. 2e), где Pt = Nt/EjNj - доля клеток с числом соседей i; Nj - количество клеток c j соседями. Введем меру асимметрии данного распределения: А = X iPiqi.
В бесконечном плоском монослое (при общем числе частиц Ntot^-<x>), где гауссова кривизна равна нулю, имеет место равенство Д=0, а распределение клеток по числу их соседей сбалансированно (симметрично): количество n-валентных клеток с n<6 уравновешивает количество n-ва-лентных с n>6. В этом равновесии веса 5- и 7-валентных клеток равны lq5l = lq7l =1 и т.д. Так как для любой триангулированной структуры со сферической геометрией суммарный топологический заряд равен 12, то А = 12/Ntot, и поэтому в сферических монослоях будет наблюдаться большее количество 5-валентных клеток, чем 7-валентных.
Поскольку полный заряд всех дефектов (как положительных, так и отрицательных) всегда сохраняется, можно определить степень топологической дефектности монослоя как общий отрицательный заряд всех топологических дефектов Q-, деленный на общее число клеток Ntot:
D=JT = Xl!am = ltb7Ptqt. (1)
"tot "tot
Результаты и обсуждение
Морфологическая характеристика монослоев COS (рис. 2) была проведена с использованием изображений 33 плоских и 26 сферических структур. Анализируемые области в плоских монослоях содержали от 73 до 758 клеток, в сферических - от 17 до 399 (на видимой области образца). Все процедуры усреднения (отдельно для сферических и плоских образцов), обсуждаемые ниже, проводились с весовым коэффициентом, представляющим собой количество клеток Вороного в образце.
На рис. 2а показан типичный плоский монослой клеток почек африканских обезьян со 129 четко видимыми ядрами. На монослой наложена триангуляция Делоне, узлами которой являются центры ядер. 68 ядер, далеких от границ изображения, окрашены в соответствии с числом их ближайших соседей. Для остальных ядер, отмеченных серыми кружками, достоверно определить количество соседей невозможно. На рис. 2b показано разбиение Вороного для того же монослоя. Разноцветными полигонами показаны 68 ячеек Вороного, центрами которых являются ядра с достоверно установленными валентностями. Топология типичного сферического монослоя (содержит 108 клеток COS в видимой области) представлена на рис. 2c, d. Окраска ядер на рис. 2с совпадает с цветом на рис. 2а. На рис. 2d показаны ячейки Вороного для 76 ядер монослоя, для которых достоверно определено число соседей.
Распределение клеток по числу их соседей для усредненных данных по плоским и сферическим монослоям клеток COS показано на рис. 2d. Это распределение типично для других проли-феративных (медленно делящихся) эпителиальных монослоев [5]. Действительно, для обоих типов монослоев значения Рб, в основном определяющие распределение клеток по числу их соседей [5, 16], укладываются в общепринятый диапазон от 0,38 до 0,48. Усредненные значения топологической дефектности D, рассчитанной по формуле (1), равны соответственно 0,36 и 0,29 для плоских и сферических монослоев. Любопытно, что эти значения примерно в три раза выше, чем средняя топологическая дефектность эпителия асцидий, равная 0,11 [9]. Значения Д, рассчитанные для гистограмм, показанных на рис. 1e, составляют соответственно 0,02 и 0,06 для плоского и сферического случаев. Поскольку Д является линейной комбинацией вероятностей Р-i и эта величина должна обращаться в нуль в бесконечном плоском монослое, ее отличие от нуля характеризует статистическую погрешность определения Р-i для плоского случая. Разумно предположить, что ошибка для анализируемых плоских и сферических фрагментов монослоя близка.
Тогда трехкратное увеличение значения Д для сферического случая можно объяснить только наличием гауссовой кривизны. Таким образом, анализ изображений локальных фрагментов сферических и плоских монослоев выявляет различие в величине Д, что, в свою очередь, приводит к разнице распределений по числу ближайших соседей у клеток (рис. 2e).
Рис. 2. Анализ микрофотографий монослоев, полученных из клеток эпителия почек африканской зеленой обезьяны. На верхних панелях представлено типичное изображение плоского монослоя клеток с наложенной триангуляцией Делоне (a) и разбиением Вороного (b). Аналогичный графический анализ для сферического эпителия представлен на панелях c и d. Красные, оранжевые, желтые, зеленые, голубые, синие и фиолетовые узлы триангуляции и ячейки Вороного соответствуют клеткам с соседями 4-10, e -распределение клеток по числу их соседей для плоских (правая гистограмма) и сферических монослоев (левая гистограмма) / Fig. 2. Analysis of African green monkey (COS) kidney epithelium. The upper panels of the figure show a typical image of a planar monolayer of cells with superimposed Delaunay triangulation (a) and Voronoi tessellation (b). A similar graphical analysis for spherical epithelium is presented in panels c and d. Red, orange, yellow, green, blue, dark blue and purple triangulation nodes and Voronoi cells correspond to cells with neighbors 4-10, e - distribution of cells by the number of their neighbors for flat (right histogram) and spherical
monolayers (left histogram)
Заключение
В данной работе мы рассмотрели топологические аспекты изменения формы и кривизны эпителия на примере монослоев клеток эпителия почек африканских зеленых обезьян COS с плоской и сферической топологиями. А именно проанализировали распределение клеток по числу их соседей в десятках монослоев обеих форм и показали, как геометрия монослоя влияет на это распределение. В частности, гауссова кривизна монослоя приводит к тому, что доля 5-валентных клеток P5 больше в сферическом случае, а доля клеток с семью соседями P7 меньше в плоском эпителии. Более высокую долю клеток с шестью соседями в сферических образцах можно объяснить разностью условий выращивания сферического и плоского эпителия. Также отметим, что в отличие от более упорядоченных коллоидных кристаллов и эпителия икринок асцидий в монослоях COS-клеток невозможно выделить линейные топологические дефекты в виде рубцов или складов. Меньшая упорядоченность монослоев COS-клеток по сравнению с эпителием асцидий,
демонстрируемая сравнением доли 6-валентных клеток P6 со средней топологической дефективностью D, видимо, объясняется пролиферативной природой исследованных монослоев.
Список источников
1. Watson J., Crick F. Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid // Nature. 1953. Vol. 171. P. 737-738.
2. Caspar D.L., Klug A. Physical principles in the construction of regular viruses // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1962. Vol. 27. P. 1-24.
3. Reinhardt D., Pesce E.-R., Stieger P., Mandel Th., Baltensperger K., Bennett M., Traas J., Friml J., Kuhlemeier C. Regulation of phyllotaxis by polar auxin transport // Nature. 2003. Vol. 426. P. 255-260.
4. Lewis F.T. The effect of cell division on the shape and size of hexagonal cells // Anat. Rec. 1926. Vol. l. P. 331-355.
5. Gibson M.C., Patel A.B., Nagpal R., Perrimon N. The emergence of geometric order in proliferating meta-zoan epithelia // Nature. 2006. Vol. 442. P. 1038-1041.
6. Ross C., Boroviak T.E. Origin and function of the yolk sac in primate embryogenesis // Nat. Commun. 2020. Vol. 11. P. 1-14.
7. Andrew D.J., Ewald A.J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elaboration // Dev. Biol. 2010. Vol. 341. P. 34-55.
8. Trushko A., Di Meglio I., Merzouki A., Blanch-Mercader C., Abunattum Sh., Guck J., Alessandri K., Nassoy P., Kruse K., Chopard B., Roux A. Buckling of an epithelium growing under spherical confinement // Dev. Cell. 2020. Vol. 54. P. 655-668.
9. Roshal D.S., Azzag K., Le Goff E., Rochal S.B., Baghdiguian S. Crystal-like order and defects in metazoan epithelia with spherical geometry // Sci. Rep. 2020. Vol. 10. P. 7652.
10. Dinsmore A.D., Hsu M.F., Nikolaides M.G., Marquez M., Bausch A.R., Weitz D.A. Colloidosomes: selectively permeable capsules composed of colloidal particles // Science. 2002. Vol. 298. P. 1006-1009.
11. Roshal D.S., Konevtsova O. V., Myasnikova A.E., Rochal S.B. Assembly of the most topologically regular two-dimensional micro and nanocrystals with spherical, conical, and tubular shapes // Phys. Rev. E. 2016. Vol. 94. P. 052605.
12. Saw T.B., Doostmohammadi A., Nier V., Kocgozlu L., Thampi S., Toyama Y., Marcq Ph., Lim Ch.T., Yeo-mans J.M., Ladoux B. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion // Nature. 2017. Vol. 544. P. 212-216.
13. Chaffer C.L., Thompson E.W., Williams E.D. Mesenchymal to epithelial transition in development and disease // Cells. Tissues. Organs. 2007. Vol. 185. P. 7-19.
14. Delaunay B. Sur la sphère vide: A la mémoire de Georges Voronoi // Изв. Академии наук СССР. Отделение математических и естественных наук. 1934. № 6. C. 793-800.
15. Wales D.J., Ulker S. Structure and dynamics of spherical crystals characterized for the Thomson problem // Phys. Rev. B. 2006. Vol. 74. P. 212101.
16. Roshal D.S., Martin M., Fedorenko K., Golushko I., Molle V., Baghdiguian S., Rochal S.B. Random nature of epithelial cancer cell monolayers // J. R. Soc., Interface. 2022. Vol. 19. P. 20220026.
References
1. Watson J., Crick F. Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature. 1953;171:737-738.
2. Caspar D.L., Klug A. Physical principles in the construction of regular viruses. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1962;27:1-24.
3. Reinhardt D., Pesce E.-R., Stieger P., Mandel Th., Baltensperger K., Bennett M., Traas J., Friml J., Kuhlemeier C. Regulation of phyllotaxis by polar auxin transport. Nature. 2003;426:255-260.
4. Lewis F.T. The effect of cell division on the shape and size of hexagonal cells. Anat. Rec. 1926;l:331-355.
5. Gibson M.C., Patel A.B., Nagpal R., Perrimon N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 2006;442:1038-1041.
6. Ross C., Boroviak T.E. Origin and function of the yolk sac in primate embryogenesis. Nat. Commun. 2020;11:1-14.
7. Andrew D.J., Ewald A.J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elaboration. Dev. Biol. 2010;341:34-55.
8. Trushko A., Di Meglio I., Merzouki A., Blanch-Mercader C., Abunattum Sh., Guck J., Alessandri K., Nassoy P., Kruse K., Chopard B., Roux A. Buckling of an epithelium growing under spherical confinement. Dev. Cell. 2020;54:655-668.
ISSN 1026-2237 BULLETIN OF HIGHER EDUCATIONAL INSTITUTIONS. NORTH CAUCASUS REGION. NATURAL SCIENCE. 2023. No. 1
9. Roshal D.S., Azzag K., Le Goff E., Rochal S.B., Baghdiguian S. Crystal-like order and defects in metazoan epithelia with spherical geometry. Sci. Rep. 2020;10:7652.
10. Dinsmore A.D., Hsu M.F., Nikolaides M.G., Marquez M., Bausch A.R., Weitz D.A. Colloidosomes: selectively permeable capsules composed of colloidal particles. Science. 2002;298:1006-1009.
11. Roshal D.S., Konevtsova O.V., Myasnikova A.E., Rochal S.B. Assembly of the most topologically regular two-dimensional micro and nanocrystals with spherical, conical, and tubular shapes. Phys. Rev. E. 2016;94:052605.
12. Saw T.B., Doostmohammadi A., Nier V., Kocgozlu L., Thampi S., Toyama Y., Marcq Ph., Lim Ch.T., Yeomans J.M., Ladoux B. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 2017;544:212-216.
13. Chaffer C.L., Thompson E.W., Williams E.D. Mesenchymal to epithelial transition in development and disease. Cells. Tissues. Organs. 2007;185:7-19.
14. Delaunay B. Sur la sphère vide: A la mémoire de Georges Voronoi. Izv. Akad. nauk SSSR. Otdelenie matematicheskih i estestvennyh nauk = Proceedings of the USSR Academy of Sciences. Department of Mathematical and Natural Sciences. 1934;(6):793-800.
15. Wales D.J., Ulker S. Structure and dynamics of spherical crystals characterized for the Thomson problem. Phys. Rev. B. 2006;74:212101.
16. Roshal D.S., Martin M., Fedorenko K., Golushko I., Molle V., Baghdiguian S., Rochal S.B. Random nature of epithelial cancer cell monolayers. J. R. Soc., Interface. 2022;19:20220026.
Информация об авторах
Дарья Сергеевна Рошаль - кандидат физико-математических наук, кафедра теоретической и вычислительной физики, физический факультет.
Карим Аззаг - доктор физико-математических наук, лаборатория Перлингейро, Институт сердца Лил-лехей.
Кирилл Константинович Федоренко - магистрант, кафедра нанотехнологии, физический факультет. Сергей Бернардович Рошаль - доктор физико-математических наук, профессор, кафедра нанотехноло-гии, физический факультет.
Стивен Багдигьян - профессор, Институт наук об эволюции, CNRS, Практическая школа высших исследований, Институт исследований в области развития.
Information about the authors
Daria S. Roshal - Candidate ofScience (Physics and Mathematics), Department of Theoretical and Computational Physics, Physics Faculty.
Karim Azzag - Doctor of Science (Physics and Mathematics), Perlingeiro Lab, Lillehei Heart Institute. Kirill K. Fedorenko - Master's Student, Department of Nanotechnology, Faculty of Physics. Sergey B. Roshal - Doctor of Science (Physics and Mathematics), Professor, Department of Nanotechnology, Faculty of Physics.
Stephen Baghdiguian - Professor, Institut des Sciences de l'Evolution-Montpellier, CNRS, Ecole Pratique des Hautes Etudes, Institut de Recherche pour le Développement.
Статья поступила в редакцию 28.09.2022; одобрена после рецензирования 20.10.2022; принята к публикации 02.03.2023. The article was submitted 28.09.2022; approved after reviewing 20.10.2022; accepted for publication 02.03.2023.
