CC BY
34
© о. В. сундуков, и. А. тулаева, Е. а. Зубанов
ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений», Санкт-Петербург
на 20 инбредных генерациях проведен дизруптивный отбор самок обыкновенного паутинного клеща по наличию или отсутствию признаков резистентности к четырем инсектоакарицидам различных химических классов — диметоату, бифентрину, абамектину и бром-пропилату. при дифферециации генотипов во всех резистентных к токсикантам линиях в каждом поколении присутствовало в среднем около 30 % самок без признака резистентности к ака-рициду из-за гапло-диплоидного способа размножения клещей. У единичных самок сравниваемых линий клещей выявлена активность карбоксилэстеразных фракций при электрофоретическом разделении ферментов. клещи протестированы диагностическими концентрациями диметоата, бифентрина, пиридабе-на. сопоставлено синергистическое действие на них ингибитора мо-нооксигеназ — пиперонил буток-сида. сделан вывод, что индукция карбоксилэстеразной и моноок-сигеназной активности является универсальной реакцией адаптивного ответа организма членистоногих при проявлении резистентности к любым инсектоакарицидам острого токсического действия.
С ключевые слова: паутинный клещ; резистентность; инсектоакарициды; генотип; наследование; карбоксилэстераза.
Поступила в редакцию 1 1.03.2015 Принята к публикации 21.05.2015
УДК 632.95.025.8:577.153
проявление признаков резистентности к инсектоакарицидам в инбредных линиях обыкновенного паутинного клеща при дизруптивном отборе
ВВЕДЕНИЕ
Паутинные клещи рода Tetranychus являются наиболее вредоносными фитофагами сельскохозяйственных культур. Около полутора десятков видов этого рода обитают более чем на 1100 видах растений 140 различных семейств. Вследствие очень короткого срока развития каждой генерации они обладают большим биотическим потенциалом и чрезвычайно быстро формируют резистентные популяции к применяемым против них акарицидам. Попытки создания научно обоснованной системы чередования используемых ака-рицидов, основываясь на различиях в механизмах их токсического действия для преодоления сформировавшейся резистентности, дают, как правило, разовый эффект и данная проблематика в течение многих десятилетий в научных публикациях не утрачивает своей актуальности. В отличие от проводившихся уже экспериментов на популяционных выборках паутинных клещей настоящее исследование выполнено на генотипах, полученных дизруптивным отбором инбредно культивируемых линий клеща. Основным выясняемым вопросом при этом являлось сходство и отличительные особенности биохимических механизмов, детерминирующих признаки резистентности к использованным в опытах инсектоакарицидам, относящихся к различным химическим классам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на обыкновенном паутинном клеще (Tetranychus urticae Koch). При дизруптивном отборе клещей с наличием или отсутствием признака резистентности к инсектоакарициду потомство селектируемых семей обрабатывали весовой (в %) диагностической концентрацией токсиканта — СК^ х 2 для чувствительных к нему клещей. Тестирование проводилось методом окунания в раствор токсиканта на кусочке кормового растения появившихся на этот момент в каждой семье самок, если их было не менее 7. В семьях, селектируемых по признаку проявления резистентности к токсиканту, обрабатывали всех самок, а в семьях, отбираемых по факту чувствительности к применяемому инсектоакарициду — по 5—10 особей из каждой семьи. В случае их 100%-й смертности, от самок таких семей получали новое потомство. Семьи клещей в дифференцируемых линиях содержали на листовых плотиках фасоли, раскладывавшихся на залитую водой вату. Для воспроизводства каждого нового поколения брали по 10 самок из трех семей со 100%-й смертностью и из трех-четырех семей с 0%-й смертностью после обработки селектирующим токсикантом.
В опытах использованы препаративные формы инсектоакарицидов — диметоата (40 % к. э.* Би-58), бифентрина (10 % к. э. талстара), бромпропила-та (50 % к. э. неорона) и абамектина (1,8 % к. э. вертимека). Для выявления механизмов, ответственных за выражение признаков резистентности к токсикантам были взяты также пиридабен (20 % с. п.** санмайта) и ингибитор
*
к. э. — концентрат эмульсии; с. п. — смачивающийся порошок.
системы цитохром Р450 монооксигеназ — пиперонил бутоксид (ППБ). Учет смертности клещей проводился через одни и трое суток после их окунания в раствор токсиканта.
Вычисление концентраций СКд5 выполнено методом пробит-анализа по Литчфильду и Уилкоксону (Беленький, 1959). Ошибка выборочной доли средних арифметических процента смертности клещей в поколениях диз-руптивного отбора клещей рассчитывали по формуле:
sp (%)=Jp(1°° -p ,
а коэффициент относительного рассеивания вариант — по формуле:
Sp (%)
v = X х 100 (Урбах, 1964).
Разделение эстераз подопытных клещей проводили методом диск-электрофореза в гель-системе с 7,5 % разделяющим полиакриламидным гелем pH 7,5 и трис-вероналовым электродным буфером pH 7,0 (Мау-рер, 1971).
Эстеразные фракции выявляли в инкубационной среде с 0,56 % 1-нафтилацетата и 0,2 % прочного синего RR в 0,2 М фосфатном буфере pH 6,9. Холинэс-
теразную фракцию и фракцию множественной молекулярной формы карбоксилэстеразы, активность которой увеличивалась у резистентных к акарицидам клещей, выявляли в инкубационной среде с бутирилтиохолин иодидом в 0,1 М фосфатном буфере pH 7,5 (Karnovky, Roots, 1964).
Разделяемые образцы гомогената паутинных клещей для инкубационной среды с 1-нафтилацетатом готовили из 1-й и, в качестве дубля, 3 самок той же семьи в 40 мкл 40%-й сахарозы, а для тиохолиновой инкубационной среды — из 20 самок в 50 мкл 40%-й сахарозы, содержащей 1 % детергента — тритона Х-100.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Селекция паутинных клещей на устойчивость и чувствительность к диметоату и бифентрину выявила сходный характер изменчивости проявления признака резистентности в поколениях дизруптивного отбора (табл. 1 и 2). Самки из семей полностью устойчивых к этим инсектоакарицидам производили новые семьи с различным количеством выживавших особей при тестировании их диагностическими концентрациями этих токсикантов. Суммарный среднестатистический показатель доли устойчивых к инсектоакарицидам клещей
Линия R Линия S
Семей Самок (n) Смертность (%) v (%) Семей Самок (n) Смертность (%) v (%)
30 304 29,3 ± 2,5 17 186 97,8 ± 1,3
30 314 33,4 ± 2,7 16 160 100
10 105 34,1 ± 5,1 13 141 99,1 ± 0,8
7 75 19,3 ± 3,4 13 130 100
19 207 47,7 ± 2,9 12 120 100
14 156 24,5 ± 3,1 11 106 100
8 92 39,2 ± 4,8 13 135 98,5 ± 1,5
14 164 39,2 ± 3,5 7 96 100
19 205 33,7 ± 2,8 16 163 99,0 ± 1,0
17 191 29,4 ± 3,0 18 180 98,5 ± 1,1
Е 168 Е 1813 X = 33,0 ± 3,4 10,3 ± 0,17 Е 136 Е 1417 X = 99,3 ± 0,6 0,6 ± 0,01
29 309 41,8 ± 2,1 15 164 93,7 ± 3,6
18 200 30,7 ± 2,9 14 165 92,4 ± 4,1
16 185 22,6 ± 2,7 14 150 97,7 ± 3,4
17 195 32,3 ± 3,1 17 182 92,5 ± 3,9
15 169 31,1 ± 3,2 18 189 99,2 ± 0,8
17 185 30,9 ± 3,1 8 90 97,5 ± 2,5
19 208 44,4 ± 3,2 16 175 96,5 ± 1,7
16 193 38,3 ± 3,5 13 138 97,1 ± 2,0
16 201 31,6 ± 3,1 20 210 99,1 ± 1,0
23 259 42,1 ± 2,4 20 190 100
Е 186 Е 2104 X = 34,6 ± 2,9 8,4 ± 0,13 Е 155 Е 1653 X = 96,6 ± 2,3 2,4 ± 0,04
Таблица 1
Проявление признака резистентности к диметоату в поколениях 1 — 10 и 11 — 20 дизруптивного отбора инбредных линий паутинного клеща
Таблица 2
Проявление признака резистентности к бифентрину в поколениях 1 — 10 и 11 — 20 дизруптивного отбора инбредных линий паутинного клеща
Линия R Линия S
Семей Самок(n) Смертность (%) v (%) Семей Самок(n) Смертность (%) v (%)
16 175 33,9 ± 4,4 8 87 100
11 125 15,8 ± 3,7 8 85 85,7 ± 5,9
30 292 15,8 ± 2,1 21 209 90,8 ± 2,8
27 277 13,8 ± 2,3 20 202 84,4 ± 3,9
30 309 11,8 ± 1,8 20 208 83,3 ± 3,6
30 302 20,2 ± 2,1 20 194 88,3 ± 3,3
26 280 19,4 ± 2,2 18 187 88,5 ± 4,0
22 248 25,8 ± 2,6 17 186 94,2 ± 2,5
14 145 29,7 ± 3,8 11 114 94,4 ± 3,1
9 118 38,1 ± 4,5 19 198 92,9 ± 2,6
£215 £2271 X = 22,4 ± 2,9 12,9 ± 0,19 £162 £1670 X = 90,2 ± 3,2 3,5 ± 0,06
7 76 17,4 ± 5,6 6 59 100
5 68 22,1 ± 5,0 11 106 98,2 ± 1,8
7 70 38,6 ± 5,8 16 160 100
8 90 26,7 ± 4,7 17 165 96,5 ± 2,0
7 78 20,0 ± 5,7 7 63 100
8 98 32,4 ± 4,5 14 140 95,7 ± 2,4
9 112 33,0 ± 4,4 16 163 96,4 ± 2,0
6 73 32,9 ± 5,5 15 157 96,1 ± 2,2
8 89 29,0 ± 5,5 18 190 95,6 ± 2,2
15 155 37,3 ± 3,6 15 156 96,1 ± 2,2
£80 £909 X = 28,9 ± 5,0 17,3 ± 0,4 £135 £1359 X = 97,4 ± 1,5 1,5 ± 0,03
в 10 первых поколениях отбора, включая и семьи, где все особи были резистентными, составлял при селекции диметоатом около 65 %, а при селекции бифентрином — 75 %. В следующих 10 поколениях отбора диметоатом и бифентрином данные показатели в резистентных линиях существенно не менялись.
При отборе потомства клещей, проявляющих чувствительность к действию этих токсикантов, в дочерних поколениях оказывались и устойчивые к этим инсек-тоакарицидам особи. Количество их в 10 поколениях отбора диметоатом было около 1 %, а при селекции бифентрином достигало в среднем 10 %. В следующих 10 дочерних поколениях количество клещей с признаком резистентности к диметоату увеличилось до 2,5 %, а при обработке бифентрином уменьшилось до такого же уровня.
Совсем иное соотношение устойчивых и чувствительных генотипов в дочерних поколениях самок, по сравнению с селекцией клещей на устойчивость к токсическому действию диметоата и бифентрина, выявлено при их дизруптивном отборе абамектином. Самки из семей с полной выживаемостью клещей при обработке диагностической концентрацией абамектина в 10 первых поколениях отбора давали потомство, в котором только около половины общего количества особей были резис-
тентными к этому инсектоакарициду. В следующих 10 генерациях среднестатистическое количество устойчивого к абамектину потомства клещей увеличивалось до 70 % (табл. 3).
При селекции чувствительной к абамектину линии клеща в каждом поколении отбора с самого начала стабильно воспроизводились только особи, погибавшие при обработке диагностической концентрацией токсиканта. Появление единичных самок, выживавших в некоторых поколениях — в среднем менее 0,5 % во всех 20 генерациях (табл. 3), могло быть следствием возможных технических погрешностей эксперимента при окунании кусочков листа кормового растения с клещами в раствор токсиканта.
Третий вариант количественного соотношения генотипов с признаком резистентности и с его отсутствием в поколениях дизруптивного отбора получен при селекции клещей бромпропилатом (табл. 4). От самок из полностью резистентных к бромпропилату семей в 10 первых поколениях отбора получали потомство, в котором по суммарному количеству особей было только около 30 % резистентных клещей. В следующих 10 поколениях селекции устойчивые к бромпропилату самки производили уже в среднем около 75 % резистентных к этому токсиканту особей.
Таблица 3
Проявление признака резистентности к абамектину в поколениях 1—10 и 11—20 дизруптивного отбора инбредных линий паутинного клеща
Линия R Линия S
Семей Самок (n) Смертность (%) v (%) Семей Самок(n) Смертность (%) v (%)
10 112 60,7 ± 4,6 20 200 100
7 86 43,5 ± 7,3 12 124 100
7 84 56,8 ± 7,5 9 95 100
14 155 51,8 ± 3,6 20 208 100
16 176 56,5 ± 3,1 18 180 100
19 199 26,8 ± 2,2 17 170 100
7 83 60,6 ± 8,5 7 84 100
7 78 46,4 ± 9,4 8 89 100
13 133 30,1 ± 4,1 9 94 100
12 120 25,8 ± 4,0 20 200 99,1 ± 0,1
Е 112 Е 1226 X = 45,9 ± 5,4 11,7 ± 0,23 Е 140 Е 1444 X = 99,9 ± 0,1 0,1 ± 0,002
8 83 21,7 ± 4,5 22 222 99,1 ± 1,0
9 99 13,2 ± 3,4 20 209 98,3 ± 1,2
19 197 42,0 ± 3,9 22 223 100
11 109 18,3 ± 2,6 24 243 100
18 197 14,5 ± 2,1 22 220 100
10 106 28,6 ± 4,0 18 187 99,1 ± 0,9
10 104 26,9 ± 4,3 18 184 100
8 79 50,8 ± 5,5 21 221 100
8 85 27,7 ± 5,5 10 102 100
9 108 50,0 ± 4,6 20 204 100
Е 110 Е 1167 X = 29,4 ± 4,0 13,6 ± 0,28 Е 197 Е 2015 X = 99,6 ± 0,4 0,4 ± 0,006
Селекция чувствительной к бромпропилату линии клеща давала в 10 первых генерациях в среднем около 80 % погибавших после обработки дискриминирующей концентрацией токсиканта особей, а после 20 поколения — около 90 % (табл. 4).
Одной из основных причин таких различий фенотипи-ческого проявления признака резистентности в инбред-ных поколениях клеща при дизруптивном отборе инсек-тоакарицидами мог быть партеногенетический способ его размножения по типу арренотокии. Диплоидная гетерозиготная самка, копируя диплоидных дочерних самок, производит гаплоидных самцов двух типов — с гаметами резистентных и чувствительных к токсиканту аллелей. Эти самцы при инбредном размножении имеют равные шансы участвовать в воспроизводстве следующего поколения при случайном соотношении количественной реализации такой возможности.
Как было выяснено гибридологическим анализом, из двух главных генов, детерминирующих признак резистентности к бромпропилату, один является доминантным, а дигенное наследование признака резистентности к абамектину было полностью доминантным (Сундуков и др., 2014). Доминантное состояние признака в инбред-ных поколениях дизруптивного отбора не позволяет освободиться от альтернативных чувствительных аллелей.
Вследствие этого и после 20 поколений дифференциации генотипов паутинного клеща по признаку устойчивости к четырем использованным инсектоакарицидам в общем количестве самок каждого нового поколения сохранялось в среднем около 30 % чувствительных к селектирующим инсектоакарицидам генотипов.
При дизруптивном отборе клещей на наличие альтернативного признака — чувствительности к токсикантам, выявлялись существенные различия его фенотипическо-го выражения в дочерних генерациях при действии ин-сектоакарицидов различных химических классов.
Наблюдаемое в чувствительной к диметоату линии некоторое увеличение количества появляющихся в новых поколениях резистентных особей в 10 первых генерациях отбора (табл. 1) не связано со спонтанной амплификацией генного локуса, кодирующего синтез множественной молекулярной формы карбоксилэстеразы, которая определяет проявление признака резистентности к фосфор-органическим соединениям (Bass, Field, 2011). Спонтанное умножение участков ДНК у членистоногих может происходить в одном поколении с частотой не более чем в 10-4 — 10-3 случаев (Сингер, Берг, 1998). Значительно большее количество выявляемых резистентных самок в 20 поколениях дизруптивного отбора, вероятно, было обусловлено тем, что в отсутствие главного гена,
Таблица 4
Проявление признака резистентности к бромпропилату в поколениях 1 — 10 и 11 — 20 дизруптивного отбора инбредных линий паутинного клеща
Линия Я Линия S
Семей Самок(n) Смертность (%) v (%) Семей Самок(n) Смертность (%) v (%)
18 122 61,5 ± 3,6 24 240 72,6 ± 2,7
27 275 68,7 ± 2,2 24 246 54,9 ± 2,8
28 298 49,4 ± 2,2 17 169 77,5 ± 3,2
30 304 70,0 ± 2,2 17 170 79,4 ± 3,1
30 314 66,3 ± 2,1 20 198 79,5 ± 2,9
30 294 65,0 ± 1,9 17 174 74,8 ± 3,0
30 309 66,4 ± 2,0 17 171 72,2 ± 3,5
29 297 83,4 ± 1,7 10 100 94,0 ± 2,4
30 299 93,5 ± 1,1 7 69 97,4 ± 2,5
23 229 62,2 ± 2,6 7 75 74,6 ± 5,4
£275 £2801 X = 68,6 ± 2,1 3,1 ± 0,04 £160 £1612 X = 77,7 ± 3,1 4,0 ± 0,07
26 263 15,9 ± 1,9 15 149 97,3 ± 1,3
20 206 31,9 ± 2,8 17 169 86,1 ± 2,6
8 91 14,9 ± 3,1 17 175 96,5 ± 1,7
18 189 28,6 ± 2,8 14 149 84,9 ± 3,3
28 285 19,3 ± 1,8 18 186 85,3 ± 2,8
28 291 24,2 ± 1,9 20 199 91,9 ± 1,9
24 239 21,5 ± 2,2 19 197 88,7 ± 2,4
22 220 39,7 ± 2,5 11 110 95,5 ± 2,0
25 260 33,7 ± 2,3 15 149 71,5 ± 3,8
23 240 36,5 ± 2,3 17 174 79,3 ± 3,2
£222 £2284 X = 26,6 ± 2,3 8,6 ± 0,13 £163 £1657 X = 87,7 ± 2,5 2,8 ± 0,05
гены-модификаторы оказывали собственное действие на проявление признака резистентности.
Селекция линии клеща на проявление чувствительности к бифентрину, напротив, происходила с уменьшением фенотипической изменчивости признака в 11—20 поколениях дизруптивного отбора (табл. 2), что можно объяснить процессом концентрации аллелей, детерминирующих чувствительность к токсиканту.
Отсутствие резистентных особей в поколениях чувствительной к абамектину линии клеща (табл. 3) являлось следствием того, что оба главных гена, определяющие чувствительность клещей к этому инсектоакарициду, были рецессивными, а модифицирующих факторов, способных влиять на выражение признака резистентности к абамектину, в геноме самок чувствительной к абамек-тину линии не оказалось.
Присутствие значительного количества резистентных генотипов во всех 20 генерациях дизруптивного отбора в чувствительной к бромпропилату линии клеща (табл. 4) можно объяснить тем, что один из двух главных генов, детерминирующих восприимчивость к токсическому действию инсектоакарицида, является доминантным.
Предположение, что признак резистентности у клещей к абамектину и к бромпропилату может индуцироваться такими же мутациями, как и резистентность
к инсектоакарицидам других химических классов, биохимические механизмы токсического действия и, соответственно, резистентности к которым считаются выясненными, проверяли тестированием клещей сопоставляемых линий диагностическими концентрациями этих токсикантов.
Результат действия на резистентных и чувствительных к абамектину и бромпропилату клещей диагностической концентрацией бифентрина, свидетельствовал о том, что мутация, нивелирующая дефекты в потенциал-зависимых натриевых каналах, с которыми связывают проявление устойчивости членистоногих к пиретроид-ным соединениям, в геноме резистентных к абамектину и к бромпропилату клещей отсутствует. Высокий уровень смертности клещей чувствительных и резистентных к абамектину и к бромпропилату линий при действии би-фентрина был одинаковым (табл. 5, 6).
Проведенное тестирование сопоставляемых линий клеща диагностической концентрацией пиридабена показало, что способ противодействия нарушению процессов митохондриального электронного транспорта, рассматриваемый как основной механизм, определяющий устойчивость членистоногих к токсическому действию этого соединения, не входит в состав факторов, детерминирующих выражение признаков
Таблица 5
Токсикологическая дифференциация биохимических факторов, определяющих выражение признака резистентности к абамектину
Идентифицирующие агенты R-линия S-линия
Семей Самок (n) Смертность (%) v (%) Семей Самок (n) Смертность (%) v (%)
Диметоат 0,005 % 22 240 35,5 ± 4,6 12,9 ± 0,58 16 181 77,4 ± 7,5 9,6 ± 0,5
Бифентрин 0,002 % 19 194 83,8 ± 4,3 5,1 ± 0,12 12 134 87,3 ± 3,2 3,7 ± 0,22
Пиридабен 0,006 % 20 225 52,9 ± 4,6 8,7 ± 0,41 10 118 59,1 ± 5,9 10,0 ± 0,65
Бромпропилат 0,005 % 9 102 78,0 ± 4,6 5,9 ± 0,41 10 98 97,9 ± 2,2 2,2 ± 0,16
Абамектин 0,00009 % 9 153 37,9 ± 3,9 10,3 ± 0,58 12 66 100 0
Абамектин 0,00009 % + + ППБ 0,005 % 8 75 74,7 ± 5,0 6,7 ± 0,54 11 145 93,1 ± 2,1 2,2 ± 0,13
Таблица 6
Токсикологическая дифференциация биохимических факторов, определяющих выражение признака резистентности к бромпропилату
Идентифицирующие агенты R-линия S-линия
Семей Самок (n) Смертность (%) v (%) Семей Самок (n) Смертность (%) v (%)
Диметоат 0,005% 21 224 25,3 ± 2,9 11,5 ± 0,54 17 190 92,5 ± 4,2 4,5 ± 0,23
Бифентрин 0,002% 18 175 93,0 ± 1,6 1,7 ± 0,09 15 167 100 0
Пиридабен 0,006% 23 276 67,6 ± 2,8 4,1 ± 0,17 17 172 41,3 ± 3,8 9,2 ± 0,49
Абамектин 0,00009% 18 198 33,8 ± 3,4 10,0 ± 0,5 12 144 89,6 ± 2,5 2,8 ± 0,16
Бромпропилат 0,005% 23 323 25,4 ± 2,4 9,4 ± 0,37 10 53 98,1 ± 2,0 2,0 ± 0,19
Бромпропилат 0,005% + + ППБ 0,005% 21 263 69,6 ± 2,8 4,0 ± 0,17 9 75 98,7 ± 1,3 1,3 ± 0,1
резистентности к абамектину и к бромпропилату (табл. 5, 6). Пиридабен одинаково действовал на выживаемость резистентных и чувствительных к этим токсикантам клещей.
Перекрестное тестирование диагностической концентрацией бромпропилата клещей, отселектированных по наличию признака резистентности к абамектину и наоборот, показало, что резистентные и чувствительные к бромпропилату клещи проявляли такие же уровни устойчивости и к абамектину. Клещи резистентной и чувствительной к абамектину линий, напротив, были почти одинаково неустойчивы к токсическому действию диагностической концентрации бромпропилата (табл. 5, 6). Следовательно, признак резистентности к бромпропи-лату детерминируется комплексом факторов, включающих и те, которые обеспечивают защиту от отравления абамектином.
Обработка клещей сопоставляемых линий диагностическими концентрациями селектирующих токсикантов с добавкой ППБ, который, как считается, ингибиру-ет преимущественно цитохром Р450 монооксигеназную активность, синергистически усиливая действие токсикантов, достоверно снимая защиту, создаваемую генами резистентности при интоксикации и абамек-тином, и бромпропилатом. Это позволяет заключить,
что индукция монооксигеназной активности включается в комбинацию факторов адаптивных модификаций, противодействующих отравлению этими инсектоакари-цидами (табл. 5, 6).
Результат тестирования клещей сопоставляемых линий диметоатом показал, что выражение признака резистентности и к абамектину, и к бромпропилату связано с индукцией карбоксилэстеразной активности. Уровень смертности клещей резистентных к абамекти-ну и бромпропилату линий при действии диметоата был таким же, как и процент смертности самок клеща при действии диагностических концентраций селектирующих токсикантов (табл. 5, 6). Данный вывод подтверждается выявленными различиями в активности электрофорети-чески разделяемых эстеразных фракций у клещей сопоставляемых линий. У самок резистентных к абамектину и бромпропилату генотипов выявлялся более высокий уровень общей эстеразной активности с отличительно высокоактивной фракцией одной из множественных молекулярных форм карбоксилэстеразы (рис. 1). Наиболее предпочтительными субстратами для этого аллозима, как было выяснено ранее, являются карбоксиэфиры масляной кислоты (Leeuwen, ТМ 2007; Сундуков, 2012), что позволяет выявлять только эту множественную молекулярную форму карбоксилэстеразы вместе с фракцией
а б в г д
Рис. 1. Состав и активность эстеразных фракций в гомогенате самок отдельных семей обыкновенного паутинного клеща: гидролизуемые субстраты: 1-нафтилацетат (а, б, г, д) и бутирилтиохолиниодид (в). а — 3$$ S-абамек-тин; б — 3$$ И-абамектин; в — 20$$ И-абамектин; г — 3$$ S-бромпропилат; д — 3$$ И-бромпропилат. Еб — ацетилхолинэстеразная фракция; Е3 — маркерная фракция множественной молекулярной формы карбоксилэстеразы
ацетилхолинэстеразы, которая также гидролизует бути-рилтиохолин иодид (рис. 1 в).
По результатам проводившихся спектрофотометри-ческих экспериментов суммарная удельная активность карбоксилэстеразы (в мк моль/мин/мг белка) у самок клещей из резистентных к диметоату семей была в 1,5 раза выше, чем у чувствительных к этому токсиканту особей, при одинаковой удельной активности ацетилхолинэстеразы (Сундуков, 2012). Уровень индуцируемой карбоксилэстеразной активности у резистентных к инсектоакарицидам генотипов, как известно из литературных источников, зависит, прежде всего, от запрограммированной кратности умножения локусов ДНК, кодирующих синтез этой множественной молекулярной формы фермента.
Дополнительные копии какого-либо гена, образующиеся в результате его амплификации и обеспечивающие активацию регулируемой им ферментной системы, как известно, определяют доминантное состояние детерминируемого этим геном признака.
Биохимические механизмы, определяющие выражение признаков резистентности у клещей к абамектину и к бромпропилату, как свидетельствуют полученные данные, должны различаться, следовательно, только по одному из двух главных генов — регулирующему изменение чувствительности периферических рецепторов к воздействию каждого из токсикантов.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Проявление устойчивости членистоногих к токсическому действию инсектоакарицидов реализуется двумя основными физиологическими механизмами. Уменьшением чувствительности периферических рецепторов, на которые изначально действует токсикант, и увеличением активности адаптивных ферментов, усиливающих компенсаторные реакции противодействия нарушениям физиологических функций, вызываемых действием токсиканта на нервную систему членистоногих. Индуцируемые системы адаптации ферментных систем, при вызывающем стресс химическом воздействии, усиливают энергетическое обеспечение и интенсификацию обменных процессов, что способствует повышению жизнеспособности членистоногих, а также экстренному выведению из организма токсичных ксенобиотиков, в случаях их возможного попадания во внеклеточные жидкости.
Наиболее детально изучены к настоящему времени механизмы воздействия на периферические сенсорные окончания нервов пиретроидных инсектоакарицидов и авермектинов. Изменение чувствительности рецепторов к пиретроидам связывают с генетически детерминируемыми структурными перестройками аминокислотных последовательностей в натриевых каналах (Nyoni et al., 2011; Ya-ning et al., 2011).
У резистентных к авермектинам членистоногих выявляются изменения в аминокислотных структурах воротного механизма рецепторов гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), регулирующих частоту открываний ионных каналов для трансмембранного перемещения анионов хлора (Dermauw et al., 2012; Kwon et al., 2010; Zhao, Salgado, 2010).
На какие сенсорные окончания действуют галоидо-органические инсектоакарициды, к которым относится бромпропилат, литературные сведения не найдены.
Фосфорорганические инсектоакарициды изначально блокируют периферические ацетилхолиновые рецепторы. В течение всего предшествующего периода изучения механизма токсического действия и резистентности членистоногих к этим соединениям интенсивно исследовали их антихолинэстеразное действие, ориентируясь на выясненную этиологию отравления фосфорорганическими ядами теплокровных животных. При этом игнорировались основополагающие обстоятельства, исключающие возможность такой аналогии. У членистоногих нервно-мышечная медиация биоэлектрических импульсов, в отличие от теплокровных, не является холинергической и погибают членистоногие при отравлении инсектоака-рицидами этого класса не от асфиксии (Сундуков, 2012). В организме членистоногих при интоксикации фосфо-рорганическими инсектоакарицидами можно зафиксировать различную динамику ацетилхолинэстеразной активности в процессе развития патогенеза отравления, наряду с модификацией активности других ферментных
систем. Однако прямая корреляция степени резистентности членистоногих к фосфорорганическим соединениям проявляется только с уровнем карбоксилэстеразной активности в их организме.
Как подтверждено полученными экспериментальными данными, индукция карбоксилэстеразной активности является биохимическим фактором, определяющим выражение признаков резистентности к диметоату и к би-фентрину (Сундуков и др., 2014), а также к абамектину и к бромпропилату (табл. 5, 6 и рис. 1). Увеличение активности этой ферментной системы при отравлении паутинных клещей фосфорорганическими инсектоака-рицидами продемонстрировано многочисленными исследованиями. Индукция карбоксилэстеразной и моно-оксигеназной активности выявлялась также у паутинных клещей, резистентных к токсикантам других химических классов (Leeuwen et al., 2005, 2006). Повышенная активность карбоксилэстеразной и монооксигеназной ферментных систем у резистентных к инсектоакарицидам членистоногих, как можно заключить, является проявлением универсальной адаптивной реакции организма на воздействие токсиканта. Выявляемая электрофорети-чески множественная молекулярная форма карбоксилэс-теразы может служить молекулярным маркером наличия у анализируемых генотипов паутинных клещей признака резистентности к применяемым инсектоакарицидам.
Проведенный дизруптивный отбор паутинных клещей более чем на 100 поколениях инбредных линий не выявил никаких признаков инбредной депрессии или каких-либо отрицательных эффектов, связанных с гомозиготизацией рецессивных аллелей. Это свидетельствует о том, что ин-бредное скрещивание у клещей с гапло-диплоидным способом размножения является нормальным биологическим процессом. Поэтому, выявленные закономерности распределения аллелей, детерминирующих признаки резистентности к акарицидам различных химических классов в поколениях инбредных линий обыкновенного паутинного клеща, будут справедливы и для естественных популяций этого вида, а также для других видов тетраниховых клещей.
Как показал статистический анализ, даже при жестком дизруптивном отборе паутинных клещей с мутацией резистентности к инсектоакарицидам, в семьях всех дочерних поколений сохраняется более четверти, от общего количества особей, чувствительных генотипов. Это позволяет считать, что в естественной среде при прекращении воздействия химического пресса в новых генерациях клещей должно происходить быстрое восстановление (реверсия) среднего уровня чувствительности к любым инсектоакарицидам.
ЛИТЕРАТУРА
1. Беленький М. Л. (1959) Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Рига: АН Латв. ССР.
2. Маурер Г. (1971) Диск-электрофорез. М.: Мир.
3. Сингер М., Берг П. (1998) Гены и геномы. М.: Мир, Т. 2.
4. Сундуков О. В. (2012) Этиология острой токсичности инсектоакарицидов и физиологические факторы, определяющие избирательность их действия на членистоногих. СПб.: Наука.
5. Сундуков О. В., Тулаева И. А., Зубанов Е. А. (2014) Наследование признаков резистентности к акарици-дам в инбредных линиях обыкновенного паутинного клеща. Экол. генетика. Т. 12 (3): С. 43—51.
6. Урбах В. Ю. (1964) Биометрические методы. М.: Наука.
7. Bass Ch., Field L. M. (2011) Gene amplification and insecticide resistance. Pest Manag. Sci. V. 67 (8): P. 886-890.
8. Dermauw W, Ilias A., Riga M. et al. (2012) The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetrany-chus urticae: Implications for acaricide toxicology and novel mutation associaned with abamectin resistance. Insect Biochem. Mol. Biol. V. 42: P. 455-465.
9. Karnovsky M. J., Roots L. (1964) A "direct-coloring" thiocholine method for cholinesterases. J. Histochem. Cytochem. V.12: P. 219-221.
10. Kwon D. H., Yoon K. S., Clark J. M., Lee S. H. (2010) A point mutation in a glutamate-gated chloride channel confers abamectin resistance in the two-spotted spider mite, Tetranychus urticae Koch. Insect Mol. Biol. V. 19: P. 583-591.
11. Leeuwen T. van, Pottelberge S. van, Tirri L. (2005) Comparative acaricide susceptibility and detoxifying enzyme activities in field-collected resistant and susceptible strains of Tetranychus urticae. Pest Manag. Sci. V. 61 (5): P. 499-507.
12. Leeuwen T. van, Pottelberge S. van, Tirry L. (2006) Biochemical analysis of chlorfenapyr-selected resistant strain of Tetranychus urticae Koch. Pest Manag. Sci. V. 62 (5): P. 425-433.
13. Leeuwen T. van, Tirri L. (2007) Esterase-mediated bifenthrin resistance in a multiresistant strain of the two-spotted spider mite, Tetranychus urticae. Pest Manag. Sci. V. 63 (2): P. 150-156.
14. Nyoni B. N., Gorman K., MzilahowaT., et al. (2011) Pyre-throid resistance in the tomato spider mite, Tetranychus evansi, is associated with mutation of the para-type sodium channel. Pest Manag. Sci. V 67 (8): P 891-897.
15. Ya-ning F., Shu Zh., Wei S., et al. (2011) The sodium channel gene in Tetranychus cinnabarinus (Boisdu-val): identification and expression analysis of a mutation associated with pyrethroid resistance. Pest Manag. Sci. V. 67 (8): P. 904-912.
16. Zhao X., Salgado V. L. (2010) The role of GABA and glutamate receptors in susceptibility and resistance to chloride channel blocker insecticides. Pest. Biochem. Physiol. V. 97: P. 153-160.
manifestations of resistance to acaricides in inbred lines of two-spotted spider mite in the process of disruptive selection
Sundukov O. V., Tulaeva I. A., Zubanov E. A.
C sUMMARY: Background: Information about genetic and biochemical mechanisms of arthropods resistance to pesticide obtained with resistant and susceptible genotypes is more correct than that of population-based samples. Materials and methods: The disruptively selection of two-spotted spider mites was carried out on the basis of the presence or absence of resistance to four acaricides — dimethoate, bifenthrin, abamectin and bromopropylate. A possible resistance mechanisms of mite to abamectin and bromopropylate was detected when testing the diagnostic" concentrations of acaricides which toxic action is known. Synergetic effect of resistant genotypes treated with monooxygenase inhibitor piperonyl butoxide (PBO) was studied. Carboxy-lesterase isoenzymes were determined with use of poliacrylamide gel electrophoresis in individual genotypes of spider mite. Results: Statistical analysis of genotypes selection results demonstrated 30 % of females with no traits of resistance to the toxicant in all resistant lines of each generation. The reason this is arrhenotokous reproduction spider mites and dominant status of alleles determining the traits of resistance. Abamectin and bromopropylate resistant mites were synergized by PBO. Resistance was positively correlated with increased carboxylesterase activity in resistant genotypes. Conclusion: Reduced sensitivity to pesticides in resistant arthropods was found in alteration recordings sensory receptivity and through elevated levels of carboxy-lesterase and monooxygenase activity. This is universal adaptive response of the arthropods organism to intoxication by any pesticides.
c key words: Tetranychus urticae; acaricide; resistance; inheritance; genotype; carboxylesterase.
c references (transliterated)
1. Belenkiy M. L. (1959) Elementy kolichestvennoy ocenki farmacologicheskogo effekta [Elements of
quantitative estimate of pharmacological action] Riga: N-L.
2. Sundukov O. V. (2012) Aetiologija ostroj toxichnos-ty insectoakaricidov i physiologicheskie factory, opre-deljajuschie izbiratelnost ich dejstvija na chlenistonog-ich [Aetiology of sharp toxic action and physiological factors of selective insecticidal activity on arthropods]. St. Petersburg: N-L.
3. Urbah V. Yu. (1964) Biometricheskie metody [Biomet-rical methods]. Moskva: N-L.
4. Maurer H. R. (1971) Disk-Elektrophorese. Moskva: Mir.
5. Singer M., Berg P. (1998) Genes and Genomes. Moskva: Mir, V. 2.
6. Sundukov O. V., Tulaeva I. A., Zubanov Ye. A. (2014) Ecol. Genetics. T. 12 (3): C. 43-51.
7. Bass Ch., Field L. M. (2011) Pest Manag. Sci. V. 67 (8): P. 886-890.
8. Dermauw W., Ilias A., Riga M. et al. (2012) Insect Bio-chem. Mol. Biol. V. 42: P. 455-465.
9. Kwon D. H., Yoon K. S., Clark J. M., Lee S. H. (2010) Insect Mol. Biol. V. 19: P. 583-591.
10. Karnovsky M. J., Roots L. (1964) A J. Histochem. Cy-tochem. V. 12: P. 219-221.
11. Leeuwen T. van, Pottelberge S. van, Tirri L. (2005) Pest Manag. Sci. V 61 (5): P. 499-507.
12. Leeuwen T. van, Pottelberge S. van, Tirry L. (2006) Pest Manag. Sci. V. 62 (5): P. 425-433.
13. Leeuwen T. van, Tirri L. (2007) Pest Manag. Sci. V. 63 (2): P. 150-156.
14. Nyoni B. N., Gorman K., MzilahowaT., et al. (2011) Pest Manag. Sci. V 67 (8): P. 891-897.
15. Ya-ning F., Shu Zh., Wei S., et al. (2011) Pest Manag. Sci. V. 67 (8): P. 904-912.
16. Zhao X., Salgado V. L. (2010) Pest. Biochem. Physiol. V. 97: P. 153-160.
C Информация об авторах
сундуков олег Вениаминович — к. б. н., старший научный сотрудник, лаборатория экотоксикологии. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений». 196608, Санкт- Петербург, Пушкин-8, ш. Подбельского, д. 3. E-mail: Sunduckov.oleg @ yandex ru.
тулаева ирина Анатольевна — к. б. н., научный сотрудник, лаборатория экотоксикологии. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений». 196608, Санкт- Петербург, Пушкин-8, ш. Подбельского, д. 3. E-mail: zubanov 63 @ yandex. ru.
Зубанов Евгений александрович — научный сотрудник, лаборатория экотоксикологии. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений». 196608, Санкт- Петербург, Пуш-кин-8, ш. Подбельского, д. 3. E-mail: zubanov 63 @ rambler. ru.
sundukov oleg Veniaminovich — PhD, Senior scientist, Laboratory ecotoxicology. All-Russian Institute of Plant Protection. 196608, Saint Petersburg, Pushikin-8, shosse Podbelskogo, 3, Russia. E-mail: Sunduckov.oleg @ yandex ru.
Tulaeva Irina Anatolievna — PhD, scientist, Laboratory ecotoxicology. All-Russian Institute of Plant Protection. 196608, Saint Petersburg, Pushikin-8, shosse Podbelskogo, 3, Russia. E-mail: zubanov 63 @ yandex. ru.
Zubanov Evgeniy aieksandrovich — PhD, scientist, Laboratory ecotoxicology. All-Russian Institute of Plant Protection. 196608, Saint Petersburg, Pushikin-8, shosse Podbelskogo, 3, Russia. E-mail: zubanov 63 @ rambler. ru.
