CC BY
70
Противовоспалительное действие ацетилсалициловой кислоты у пациентов с различными вариантами сочетания генотипов тромбоцитарного рецептора фибриногена (ПШ3) и метионинсинтетазредуктазы (MTRR)
И.И. Чукаева1, А.И. Хачирова1, Ф.Д. Ахматова1, Л.В. Ганковская2, М.В. Хорева2
Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, Москва 1 Кафедра поликлинической терапии № 2 Лечебного факультета 2Кафедра иммунологии Медико-биологического факультета
Реакция у пациентов с одной и той же болезнью на одно и то же лекарство различается в зависимости от генотипа больного. Нами было проведено исследование реакции у пациентов на терапию ацетилсалициловой кислотой в течение 6 мес при различных сочетаниях диких и мутантных аллелей генов тромбоцитарного рецептора фибриногена (ITGB3) и метионинсинтетазредуктазы (МТЯЯ).
Ключевые слова: аспиринорезистентность, персонализированная медицина, ITGB3, МТЯЯ.
В последнее время стало очевидным, что реакция у пациентов с одной и той же болезнью на одно и то же лекарство различается в зависимости от генотипа больного. Возможности персонализированной медицины распространяются на препараты, которые когда-то считались универсальными средствами лечения конкретных болезней. К списку этих лекарств относится и ацетилсалициловая кислота (АСК). Этот препарат известен своим жаропонижающим, противовоспалительным и анальгезирующим действием, а также способностью уменьшать агрегацию тромбоцитов. Известно, что последнее в большей степени свойственно малым дозам АСК, которые назначают пациентам с сердечнососудистыми заболеваниями (ССЗ). Однако
Контактная информация: Хачирова Асият Исмаи-ловна, asiyat-h@mail.ru
реакция у пациента на АСК не всегда бывает однозначной.
В крупных проспективных исследованиях было доказано положительное действие АСК при профилактике сердечно-сосудистых катастроф. Однако судить об индивидуальных различиях реакции на препарат в этих исследованиях не представляется возможным. Существование проблемы аспиринорезистентности описывается авторами в 1—61% случаев. И хотя имеются данные о том, что наличие аспи-ринорезистентности связано с низкой приверженностью пациентов к лечению, некоторые авторы предполагают ее генетическую этиологию.
По данным немногочисленных исследований, существенную роль в развитии аспиринорезистентности играют мутации генов свертывающей системы крови, в
Результаты исследований
частности гена тромбоцитарного рецептора фибриногена ITGB3. Также известно, что генетические дефекты в системе свертывания крови и ферментах фолатного цикла оказывают синергетическое действие. Мутации в генах фолатного цикла приводят к нарушению синтеза ДНК и регуляции различных процессов в организме человека, а сочетание этих мутаций усугубляет ответ на терапию АСК.
Целью исследования явилось определение противовоспалительного ответа, который оценивали по уровням С-реактивного белка (СРБ), противовоспалительного цитокина интерлейкина-10 (ИЛ-10) и про-воспалительных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-18, ИЛ-33, на терапию АСК у пациентов с высоким суммарным сердечно-сосудистым риском при различных сочетаниях генотипов генов свертывающей системы крови и генов фолатного цикла.
Материал и методы
Обследовано 70 женщин в возрасте от 50 до 68 лет (средний возраст 59,43 (56—62) года), страдающих артериальной гипертонией, без ишемической болезни сердца, с суммарным сердечно-сосудистым риском по шкале SCORE (Systematic Coronary Risk Evaluation — Систематическая оценка коронарного риска) от 5 до 9% (данные представлены в виде: медиана (25-75-й процентиль)). В связи с глубокой проработкой материала и моделированием исследования до 2011 г. с целью первичной профилактики CC3 всем пациентам к стандартной антигипертензивной терапии был добавлен препарат АСК 75 мг. В национальных рекомендациях 2011 г. было оговорено, что АСК с целью первичной профилактики ССЗ возможно назначать пациентам с риском по SCORE более 10%, тогда как в рекомендациях 2004 г. — с риском более 5%.
Для сравнительного анализа часто -ты встречаемости аллелей полиморфных генов в группе пациентов использовали базу данных лаборатории клинической
генетики (Научно-клинический центр геронтологии Российского национального исследовательского медицинского университета (РНИМУ), и.о. зав. лабораторией — И.В. Костомарова). Группа здоровых доноров состояла из 35 человек (6 мужчин (17%) и 29 женщин (83%)) в возрасте от 29 до 55 лет, средний возраст 42 (37—49) года (данные представлены в виде: медиана (25-75-й процентиль)).
Концентрацию цитокинов в сыворотке периферической крови пациентов определяли с помощью иммуноферментного анализа. Для определения ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18 использовали коммерческие наборы для иммуноферментного анализа фирмы "Вектор-Бест" (Россия), для определения концентрации ИЛ-33 — наборы фирмы eBiosciences (США). Обследование пациентов проводилось двукратно, с перерывом в 6 мес. Исследование проводили совместно с сотрудниками кафедры иммунологии Медико-биологического факультета РНИМУ им Н.И. Пирогова (зав. кафедрой — проф. Л.В. Ганковская).
Также всем пациентам проводился мо-лекулярно-генетический анализ образцов крови с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, использовали комплект реагентов для выделения ДНК "Проба-ГС-Генетика" и тест-системы "Кардиогенетика Тромбо-филия", "Генетика Метаболизма Фола-тов" (ООО "ДНК-технология", Россия). Исследование выполнено в лаборатории клинической генетики (Научно-клинический центр геронтологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова). Был изучен полиморфизм генов свертывающей системы крови: протромбина (F2), факторов F5, F7, F13, Р-фибриногена (FGB), тромбоцитарного рецептора к коллагену (ITGA2), тромбоцитарного рецептора фибриногена (ITGB3), антагониста тканевого активатора плазминогена (PAI-1); генов фолатного цикла: метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), метионинсинтазы (MTR), ме-тионинсинтетазредуктазы (MTRR).
Результаты исследования обработаны с использованием комплексной системы анализа данных Statistica 8.0. Данные представлены в виде: медиана (25-75-й процен-тиль). Для оценки достоверности различий между двумя группами использовали критерии Манна—Уитни. Различия считались достоверными при p < 0,05.
Данные сравнительного анализа распределения аллелей и генотипов изучаемых генов оценивали с помощью такого показателя, как отношение шансов (ОШ), характеризующего риск заболевания. Его вычисляли путем сравнения частот двух показателей (М1 и М2) у пациентов (с — "случай") и у здоровых добровольцев (к — "контроль"): ОШ = (Мс х М2к)/(М2с х Мк). Для расчетов использовали онлайн-калькулятор на сайте (medstatistic.ru). Ассоциацию полиморфного варианта с риском заболевания оценивали следующим образом: при ОШ <1,0 — нет риска, 1,1—1,5 — низкий риск, 1,5—2,0 — средний риск, 2,0—2,5 — повышенный риск, >2,5 — высокий риск.
Результаты
В результате изучения полиморфизмов генов свертывающей системы крови FGB, F2, F5, F7, F13, ITGB2, ITGB3, PAI-1 у пациентов в сравнении со здоровыми донорами было выявлено, что для полиморфизма Т1565С гена ITGB3 ОШ составляет 3,0, т.е. пациенты с наличием в генотипе полиморфного аллеля С гена ITGB3 имеют высокий риск заболеваемости ССЗ. Для генов F2, F5, F7, F13 наличие полиморфизма не увеличивало риск заболеваемости ССЗ (ОШ <1). Для полиморфизмов C807TITGA2 и 5G6754GPAI1 наличие полиморфного варианта генотипа ассоциировалось с низким риском заболеваемости ССЗ (ОШ 1,1-1,5).
При расчете ОШ сердечно-сосудистой заболеваемости для полиморфизма A66G гена MTRR этот показатель составил 1,7 (1,5-2,0), что свидетельствовало о среднем риске заболеваемости. Для полиморфиз-
мов А1298GMTHFR и А2756GMTR наличие полиморфного аллеля в генотипе пациента не увеличивало риск заболеваемости ССЗ (ОШ <1,0).
Частота встречаемости полиморфных аллелей у обследованных пациентов представлена в табл. 1.
При оценке воспалительного статуса у пациентов до и через 6 мес лечения АСК было выявлено достоверное снижение уровня СРБ - с 1,80 (1,00-3,75) до 1,00 (0,50-1,30) мг/л и ИЛ-33 - с 3,11 (1,85-6,23) до 0 (0-2,18) пг/мл. По уровню остальных изученных маркеров воспаления достоверных различий до и после лечения обнаружено не было. Уровень ИЛ-6 недостоверно снизился с 2,12 (1,38-3,12) до 1,85 (1,04-2,3) пг/мл, уровень ИЛ-10 увеличился с абсолютного 0 до 0 (0-4,555) пг/мл, уровень ИЛ-18 - со 108,55 (85,58-123,87) до 135,76 (79,40-215,17) пг/мл. Известно, что уровни СРБ и ИЛ-33 находятся в прямом соотношении с активностью воспаления в организме, но они не являются специфическими маркерами внутрисосудистого воспаления. Динамику этих показателей, вероятно, можно связать с противовоспалительным действием АСК.
Для дальнейшего исследования противовоспалительного ответа на терапию АСК у женщин с высоким суммарным сердечнососудистым риском была изучена динамика уровней СРБ, противовоспалительного ИЛ-10 и провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-18, ИЛ-33 при различных сочетаниях генотипов генов тромбоцитарного рецептора фибриногена (ITGB3) и метио-нинсинтетазредуктазы (MTRR). Все пациенты были разделены на 7 групп с разным сочетанием диких и мутантных генотипов исследуемых генов. Статистическому анализу подверглись данные групп пациентов с 4 вариантами генотипов: ТТ ITGB3 + + АА MTRR (дикий тип ITGB3 + дикий тип MTRR), ТТ ТОВ3 + AG MTRR (дикий тип ГГСВ3 + мутантный гетерозиготный тип MTRR), ТС ТОВ3 + AG MTRR (мутантный гетерозиготный тип ITGB3 + мутантный
Результаты исследований
Таблица 1. Частота встречаемости полиморфных аллелей генов свертывающей системы крови и генов фолатного цикла у обследованных (абс. (%))
Полиморфизм гена Генотип/ аллель Пациенты (n = 70) Здоровые доноры (п = 35) ОШ (95% ДИ) Полиморфизм гена Генотип/ аллель Пациенты (n = 70) Здоровые доноры (п = 35) ОШ (95% ДИ)
FGB AA 11(16) 0 1,34 ITGB3 СС 1 (2) 0 3,00
G455A GA 27 (38) 20 (57) (0,70-2,50) Т1565С ТС 33 (46) 7 (20) (1,20-7,10)
GG 32 (46) 15 (43) ТТ 36 (52) 28 (80)
A 49 (35) 20 (28) С 35 (25) 7 (10)
G 91(65) 50 (72) Т 105 (75) 63 (90)
F2 AA 0 0 0 PAI-1 4G4G 24 (34) 10 (29) 1,10
G20210A GA 1 (2) 0 5G6754G 5G4G 35 (50) 19 (54) (0,60-2,00)
GG 69 (98) 35 (100) 5G5G 11 (16) 6 (17)
A 1 (1) 0 4G 83 (59) 39 (56)
G 139 (99) 70 (100) 5G 57 (41) 31 (44)
F5 AA 0 0 0 MTHFR ТТ 7 (10) 2 (6) 1,00
G1691A GA 0 2 (6) С677Т СТ 28 (40) 17 (49) (0,50-1,80)
GG 70(100) 33 (94) СС 35 (50) 16 (45)
A 0 2 (3) Т 42 (30) 21 (30)
G 140 (100) 68 (97) С 98 (70) 49 (70)
F7 AA 1 (2) 2 (6) 0,43 MTHFR GG 7 (10) 2 (6) 0,82
G10976A GA 6 (8) 5 (14) (0,15-1,10) A1298G AG 28 (40) 20 (57) (0,40-1,50)
GG 63 (90) 28 (80) AA 35 (50) 13 (37)
A 8 (6) 9 (13) G 42 (30) 24 (34)
G 132 (94) 61 (87) A 98 (70) 46 (66)
F13 ТТ 7 (10) 5 (14) 0,84 MTR GG 3 (4) 6 (17) 0,57
G163T GT 27 (38) 13 (37) (0,45-1,50) A2756G AG 24 (34) 10 (29) (0,20-1,00)
GG 36 (52) 17 (49) AA 43 (62) 19 (54)
Т 41 (29) 23 (33) G 29 (21) 22 (31)
A 99 (71) 47 (67) A 111 (79) 48 (69)
ITGA2 ТТ 10 (14) 4 (11) 1,10 MTRR GG 17 (24) 17 (20) 1,70
С807Т СТ 29 (42) 15(43) (0,49-2,00) A66G AG 39 (56) 13 (37) (0,90-3,10)
СС 31 (44) 16 (46) AA 14 (20) 15 (43)
Т 49 (35) 23 (33) G 73 (52) 27 (39)
С 91 (65) 47 (67) A 67 (48) 43 (61)
Обозначения: ДИ - доверительный интервал.
гетерозиготный тип МТЯЯ) и ТС ITGB3 + + GG МТЯЯ (мутантный гетерозиготный тип ITGB3 + мутантный гомозиготный тип МТЯЯ). Данные остальных трех групп пациентов не подвергались статистическому анализу в связи с их малочисленностью.
Оценивали динамику исследуемых показателей до и через 6 мес лечения. У па-
циентов с сочетанием диких генотипов (ТТ ГГСВЗ + АА МТЯЯ) было выявлено достоверное снижение уровней СРБ и ИЛ-33 и достоверное повышение уровней ИЛ-10 и ИЛ-18 (табл. 2). У пациентов с вариантами генотипа ТТ ITGB3 + AG МТЯЯ и ТС ГГСВ3 + AG МТЯЯ было выявлено достоверное снижение уровней СРБ и
Таблица 2. Динамика уровней СРБ, противовоспалительного ИЛ-10 и провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-18, ИЛ-33 в группе с генотипом ТТ ГГОВ3 + АА МТЯЯ
Таблица 3. Динамика СРБ, противовоспалительного ИЛ-10 и провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-18, ИЛ-33 в группе с генотипом ТТ ГГОВ3 + AG МТЯЯ
Показатель До лечения После лечения
СРБ, мг/л 6,55 (1,75-10,60) 1,75 (0,75-2,80)*
ИЛ-6, пг/мл 1,35 (0,80-2,47) 1,78 (1,35-2,12)
ИЛ-10, пг/мл 0 4,37 (2,10-5,70)*
ИЛ-18, пг/мл 109,10 223,20
(80,10-123,10) (195,50-237,20)*
ИЛ-33, пг/мл 1,22 (0,18-2,29) 0*
Примечание. Здесь и в табл. 3-5: * -(Р < 0,05). различия достоверны
Показатель До лечения После лечения
СРБ, мг/л 1,70 0,80
(1,00-3,50) (0,50-1,00)*
ИЛ-6, пг/мл 2,30 1,93
(1,67-3,54) (1,54-2,44)
ИЛ-10, пг/мл 0 0 (0-4,84)*
ИЛ-18, пг/мл 113,80 119,60
(81,80-132,10) (82,20-229,20)
ИЛ-33, пг/мл 5,15 (2,15-6,54) 0,07 (0-3,46)*
Таблица 4. Динамика СРБ, противовоспалительного ИЛ-10 и провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-18, ИЛ-33 в группе с генотипом ТС ГГОВ3 + AG МТЯЯ
Таблица 5. Динамика СРБ, противовоспалительного ИЛ-10 и провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-18, ИЛ-33 в группе с генотипом ТС ГГОВ3 + GG МТЯЯ
Показатель До лечения После лечения
СРБ, мг/л 2,60 (1,60-5,10) 1,10 (1,00-1,20)*
ИЛ-6, пг/мл 2,10 (1,73-2,30) 2,10 (0,83-2,30)
ИЛ-10, пг/мл 0 0 (0-2,81)*
ИЛ-18, пг/мл 94,60 119,90
(85,20-108,00) (97,80-184,00)
ИЛ-33, пг/мл 2,90 (1,60-10,70) 0 (0-3,23)*
Показатель До лечения После лечения
СРБ, мг/л 1,05 (0,70-1,60) 0,55 (0,40-1,00)
ИЛ-6, пг/мл 1,44 (1,28-1,99) 1,83 (0,90-2,40)
ИЛ-10, пг/мл 0 0
ИЛ-18, пг/мл 114,70 121,60
(100,00-122,00) (72,70-204,40)
ИЛ-33, пг/мл 3,38 (2,84-4,31) 0,50 (0-1,15)*
ИЛ-33 и достоверное повышение уровня ИЛ-10 (табл. 3, 4). У пациентов с вариантом генотипа ТС ТОВ3 + GG МТЯЯ было выявлено достоверное снижение содержания ИЛ-33 (табл. 5).
Обсуждение результатов
Наиболее важным плейотропным эффектом малых доз АСК является влияние на воспаление. У больных с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений изменен воспалительный статус, что выражается в повышении уровня СРБ и преобладании провоспалительных цитокинов над противовоспалительными. Выраженность провоспалительного статуса отражает состояние сердечно-сосудистой системы, предрасположенность к развитию атеросклероза и атеротромбоза.
Хорошо известно, что противовоспалительное и антиагрегантное действие АСК
реализуется через механизм ингибирова-ния выработки простагландинов и тром-боксанов. Образующиеся при активации воспаления простациклины и тромбо-ксаны увеличивают сосудистую проницаемость и повышают агрегацию тромбоцитов. Под влиянием АСК уменьшается активность тромбоксанов, снижается концентрация медиаторов воспаления и подавляется агрегация тромбоцитов. Таким образом, противовоспалительный ответ и антиагрегантный эффект АСК взаимосвязаны и осуществляются через единый механизм регуляции.
В группе с сочетанием мутантных генотипов — гетерозиготный ТА ITGB3 тром-боцитарного рецептора фибриногена + + гомозиготный GG МТЯЯ метионинсин-тетазредуктазы — противовоспалительное действие АСК было минимальным. У этих больных не выявлено достоверных изменений в концентрации исследуемых факторов
Результаты исследований
воспаления. Содержание ИЛ-33 под влиянием лечения АСК снизилось значимо, однако не достигло тех значений, которые наблюдались в других группах, и оставалось повышенным. У больных этой группы отмечалась минимальная эффективность противовоспалительного действия малых доз АСК. Таким образом, можно предположить, что у этих больных антиагрегантный эффект АСК окажется недостаточно выраженным и необходимо будет искать пути преодоления аспиринорезистентности.
В группе больных с "диким" генотипом ТТ ТОВ3 + АА МТЯЯ прием АСК привел к значимому снижению уровней провос-палительных маркеров СРБ, ИЛ-33 и повышению уровня противовоспалительного ИЛ-10. Тем не менее у этих больных была отмечена такая особенность, как повышение содержания ИЛ-18 после лечения АСК, несмотря на достоверное снижение других провоспалительных маркеров. Интерлей-кин-18 - провоспалительный цитокин, для которого характерна конститутивная экспрессия многими типами клеток и который обладает достаточно широким спектром биологических эффектов. Ген ИЛ-18 содержит 7 экзонов, 2 промоторные области, которые находятся в 1-м и 2-м экзонах, причем конститутивная экспрессия гена зависит от активности промотора во 2-м эк-зоне, тогда как активизация промотора 1-го экзона происходит при стимуляции макрофагов и Т-лимфоцитов. Таким образом, экспрессия гена ИЛ-18 регулируется, в зависимости от ситуации, путем активизации
двух разных промоторных областей. Интер-лейкин-18 обладает плейотропными эффектами в отношении многих типов клеток и влияет на секрецию различных по своей функциональной направленности медиаторов. Есть данные как о провоспалитель-ной, так и о противовоспалительной активности ИЛ-18. Он стимулирует продукцию не только провоспалительных цитокинов, таких как у-интерферон, фактор некроза опухолей а, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, но и противовоспалительных - ИЛ-4, ИЛ-13.
Выводы
Полученные данные свидетельствуют о том, что у больного артериальной гипертонией с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений при сочетании диких полиморфизмов ТТ ITGB3 гена тромбо-цитарного рецептора фибриногена и АА МТЯЯ гена метионинсинтетазредуктазы действие малых доз АСК будет наиболее выраженным. У пациентов с сочетанием мутантного гетерозиготного полиморфизма ТС ITGB3 с мутантным гомозиготным полиморфизмом GG МТЯЯ действие АСК будет наименее выраженным. Полученные данные позволяют предположить роль генетических мутаций генов ITGB3 и МТЯЯ в развитии аспиринорезистентности, однако нуждаются в подтверждении в более крупных и масштабных исследованиях.
Срекомендуемой литературой вы можете ознакомиться на нашем сайте www.atmosphere-ph.ru
Anti-Inflammatory Effect of Acetylsalicylic Acid in Patients with Various Combinations of ITGB3 and MTRR Genes I.I. Chukaeva, A.I. Khachirova, F.D. Akhmatova, L.V. Gankovskaya, and M.V. Khoreva
Patients with the same disease respond to the same medication differently depending on their genotypes. We studied the effect of 6-month acetylsalicylic acid therapy in patients with different combinations of wild-type and mutant alleles of ITGB3 and MTRR genes.
Key words: aspirin resistance, personalized medicine, ITGB3 gene, MTRR gene.
