CC BY
29
ORIGINAL RESEARCH
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ
https://doi.org/10.36233/0507-4088-148 © КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2022
Противовирусная и вирулицидная активность дезоксирибонуклеата натрия и его комплекса с железом в отношении вирусов разных царств и семейств
Носик Д.Н., Калнина Л.Б., Лобач О.А., Чатаева М.С., Бережная Е.В., Бочкова М.С., Киселева И.А., Селимова Л.М., Носик Н.Н.
Институт вирусологии имени Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, г. Москва, Россия
Введение. Актуальнейшей проблемой современной медицины является борьба с острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ), для которой необходимы лекарства широкого противовирусного спектра действия, а также средства, повышающие защитные функции иммунного ответа. Подобным эффектом обладают дезоксирибонуклеат натрия (ДНК-Na) и его комплекс с железом (ДНК-Na-Fe), созданные на основе двухнитевой ДНК природного происхождения.
Цель исследования - изучение противовирусной и вирулицидной активности ДНК-Na и ДНК-Na-Fe в отношении вирусов разных царств и семейств.
Материалы и методы. На модели культур клеток, инфицированных вирусами, изучена противовирусная и вирулицидная активность ДНК-Na и ДНК-Na-Fe.
Результаты и обсуждение. Показано, что ДНК-Na и ДНК-Na-Fe обладали противовирусной активностью в отношении аденовируса в концентрациях 250-1000 мкг/мл при профилактической и лечебной схеме введения препаратов. Противовирусный эффект не был обнаружен в случае вируса полиомиелита ни при какой схеме введения обоих препаратов. ДНК-Na и ДНК-Na-Fe обладали противовирусной активностью в отношении коронавируса при всех схемах введения. ЭК50 для ДНК-Na — 2500 мкг/мл, для ДНК-Na-Fe -~ 1000 мкг/мл. В клетках, обработанных ДНК-Na-Fe, обнаружена секреция цитокинов: провоспалительных -ИЛ-Iß, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-18, ИФН-а, ИФН-y и противовоспалительных - ИЛ-4, ИЛ-10, антагониста рецептора ИЛ-1. Очевидно, что ДНК-Na и ДНК-Na-Fe обладают противовирусным эффектом, однако механизм действия, по-видимому, не связан со специфическим воздействием на репликацию вирусов. Установлено наличие вирулицидной активности препаратов в отношении представителей семейств Coronaviridaе, Adenoviridae, Picornaviridae, Retroviridae, Herpesviridae в суспензионном тесте in vitro при концентрации 1000 мкг/мл в пределах 1,0-3,0 lg ТЦИД50.
Заключение. Наличие у ДНК-Na и ДНК-Na-Fe одновременно противовирусной и вирулицидной активности в отношении адено- и коронавирусов позволяет рассчитывать на их перспективность в профилактике и лечении ОРВИ.
Ключевые слова: противовирусная активность; вирулицидная активность; дезоксирибонуклеат натрия; Coronaviridaе; Adenoviridae; Picornaviridae; Retroviridae; Herpesviridae
Для цитирования: Носик Д.Н., Калнина Л.Б., Лобач О.А., Чатаева М.С., Бережная Е.В., Бочкова М.С., Киселева И.А., Селимова Л.М., Носик Н.Н. Противовирусная и вирулицидная активность дезоксирибонуклеата натрия и его комплекса с железом в отношении вирусов разных царств и семейств. Вопросы вирусологии. 2022; 67(6): 506-515. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-148
Для корреспонденции: Лобач Ольга Александровна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории противовирусных и дезинфекционных средств Института вирусологии имени Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ имени Н.Ф. Гамалеи», 123098, г. Москва, Россия. E-mail: victoriola@yandex.ru
Участие авторов. Все авторы сделали равный вклад в подготовку публикации.
Финансирование. Исследование выполнено за счет государственного бюджета. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Поступила 29.10.2022 Принята в печать 10.12.2022 Опубликована 30.12.2022
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ORIGINAL ARTICLE
https://doi.oig/10.36233/0507-4088-148
Antiviral and virucidal activity of sodium deoxyribonucleate and its complex with iron against viruses of different kingdoms and families
Dmitry N. Nosik, Lyudmila B. Kalnina, Olga A. Lobach, Marina S. Chataeva, Elena V. Berezhnaya, Marina S. Bochkova, Irina A. Kiseleva, Lyudmila M. Selimova, Nikolai N. Nosik
D.I. Ivanovsky Institute of Virology of National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya, 123098, Moscow, Russia
Introduction. The urgent problem of modern medicine is the fight against acute respiratory viral infections (ARVI). To combat ARVI, drugs of wide antiviral potency are needed, as well as immunomodulating drugs. Such antiviral and immunomodulatory effects has sodium deoxyribonucleate (DNA-Na) and its complex with iron (DNA-Na-Fe) developed on the basis of double-stranded DNA of natural origin.
Aim of the study: To assess antiviral and virucidal activity of DNA-Na and DNA-Na-Fe against viruses of different kingdoms and families.
Materials and methods. Antiviral and virucidal activity of DNA-Na and DNA-Na-Fe was assessed in cell cultures infected with viruses.
Results and discussion. DNA-Na and DNA-Na-Fe had antiviral activity against adenovirus at concentrations of 250-1000 mcg/ml. Antiviral effect of both drugs was not detected in case of poliovirus. DNA-Na and DNA-Na-Fe had antiviral activity against coronavirus in all administration schemes. EC50 for DNA-Na ~ 2500 mcg/ml, for DNA-Na-Fe ~ 1000 mcg/ml. In cells treated with DNA-Na-Fe, secretion of following pro-inflammatory cytokines was detected: Interleukin (IL) 1p, IL-2, IL-6, IL-18, interferon-a (IFN-a), IFN-y, as well as anti-inflammatory cytokines: IL-4, IL-10, antagonist of IL-1 receptor. Evidently, DNA-Na and DNA-Na-Fe have antiviral effect, but mechanism of action does not seem to be associated with specific effect on viral replication. Presence of virucidal activity of drugs against representatives of Coronaviridae, Adenoviridae, Picornaviridae, Retroviridae, Herpesviridae in vitro test in range of 1.0-3.0 lg TCID50 was identified.
Conclusion. Presence of simultaneous antiviral and virucidal activity of DNA-Na and DNA-Na-Fe against adeno-and coronaviruses shows their prospects for prevention and treatment of ARVI.
Keywords: antiviral activity; virucidal activity; sodium deoxyribonucleate; Coronaviridaе; Adenoviridae; Picornaviridae; Retroviridae; Herpesviridae For citation: Nosik D.N., Kalnina L.B., Lobach O.A., Chataeva M.S., Berezhnaya E.V., Bochkova M.S., Kiseleva I.A., Selimova L.M., Nosik N.N. Antiviral and virucidal activity of sodium deoxyribonucleate and its complex with iron against viruses of different kingdoms and families. Problems of Virology (Voprosy Virusologii). 2022; 67(6): 506-515 (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-148
For correspondence: Olga A. Lobach, PhD (Biol.), Senior Researcher at the Laboratory of Antivirals and
Disinfectants, D.I. Ivanovsky Institute of Virology of National Reseach Center for Epidemiology and Microbiology
named after Honorary Academician N.F. Gamaleya, 123098, Moscow, Russia. E-mail: victoriola@yandex.ru
Information about the authors:
Nosik D.N., https://orcid.org/0000-0001-5757-5671
Kalnina L.B., https://orcid.org/0000-0002-2702-8578
Lobach O.A., https://orcid.org/0000-0001-9351-6433
Chataeva M.S., https://orcid.org/0000-0002-5379-2406
Berezhnaya E.V., https://orcid.org/0000-0002-1551-718X
Bochkova M.S., https://orcid.org/0000-0001-9295-8379
Kiseleva I.A., https://orcid.org/0000-0003-3693-6081
Selimova L.M., https://orcid.org/0000-0003-3709-770X
Nosik N.N., https://orcid.org/0000-0003-1943-6536
Contribution. All authors have made an equal contribution to the preparation of the publication.
Funding. The research was funded by the state budget.
Conflict of interest. Authors declare no potential conflicts of interest.
Received 29 October 2022 Accepted 10 December 2022 Published 30 December 2022
ORIGINAL RESEARCH
Введение
Актуальнейшей проблемой современной медицины является борьба с острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ). Эта группа заболеваний, к сожалению, хорошо известна миллионам жителей нашей страны. Среди возбудителей ОРВИ - вирусы гриппа, аденовирусы, риновирусы, коронавирусы.
Представители последнего семейства -Coronaviridae - НСо^229Е, -ОС43, -Ж63 и -НКШ, НСо^229Е, круглогодично присутствуют в структуре ОРВИ. Однако печально известными в начале XXI в. стали три других вируса - SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2, вызывающие тяжёлые пневмонии, часто со смертельным исходом [1, 2].
Для борьбы с ОРВИ необходимы лекарства широкого противовирусного спектра действия, а также средства, повышающие защитные функции иммунного ответа. Подобным эффектом - противовирусным и иммуномодулирующим - обладают препарат де-зоксирибонуклеата натрия (ДНК-Ыа) и его комплекс с железом (ДНК-Ыа^е), созданные на основе двухни-тевой ДНК природного происхождения.
Показана их эффективность в отношении РНК-и ДНК-содержащих вирусов: вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусов гриппа, вирусов семейства герпеса, вируса японского энцефалита [3-5]. В то же время нами не обнаружена активность в отношении вируса энцефаломиокардита мышей, у вирио-на которого нет липидной оболочки.
Помимо антивирусных свойств, у ДНК-Ыа возможно наличие вирулицидных свойств - действие на вирусные частицы, находящиеся вне клетки. Данные об этом, а также информация о противовирусных свойствах ДНК-Ыа в отношении представителей семейств Coronaviridaе, Adenoviridae, Picomaviridae в доступной нам литературе не обнаружены. Поэтому целью исследования было изучение противовирусной активности ДНК-№ и его комплекса с железом в отношении вышеназванных семейств вирусов, а также вирулицидной эффективности в отношении этих вирусов и представителей семейств Retroviridae и Herpesviridae.
Материалы и методы
Исследования эффективности действия препаратов проводились на модели клеток, инфицированных вирусами. Для накопления вирусов использовали 50-миллилитровые культуральные флаконы. При определении инфекционных титров противовирусного и вирулицидного действия использовали 96-луночные культуральные планшеты. Каждая экспериментальная точка включала по четыре повтора.
Вирус полиомиелита типа 1, вакцинный штамм, получен из ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН. Титр вируса 6,5 ^ ТЦИД50.
Аденовирус человека, тип 5 получен из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии имени Д.И. Ивановского ФГБУ «Национальный
исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» (НИЦЭМ имени Н.Ф. Гамалеи) Минздрава России. Титр вируса 5,5 lg ТЦИД50.
Коронавирус свиней - вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (Alphacoronavirus) получен из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии имени Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Титр вируса 6,5 lg ТЦИД
ВИЧ 1-го типа (ВИЧ-1). В качестве источника ВИЧ использовали штамм ВИЧ-1899А из коллекции штаммов ВИЧ Института вирусологии имени Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Титр вируса 7,0 lg ТЦИД50.
Вирус герпеса простого (ВПГ). В качестве источника взят ВПГ типа 1 (ВПГ-1), штамм Л2, из Государственной коллекции вирусов «Института вирусологии имени Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ имени Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России. Титр вируса 5,0 lg ТЦИД50.
Клетки. Для работы с вирусом полиомиелита и ВПГ использовали культуру клеток почки зелёных мартышек Vero. Для работы с аденовирусом использовали перевиваемую линию клеток человека НЕр-2. Для работы с ВИЧ использовали лимфобластоидные клетки человека МТ-4. Для работы с коронавирусом использовали культуру клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) из коллекции культур клеток Института вирусологии имени Д.И. Ивановского» ФГБУ «НИ-ЦЭМ имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Суспензионные клетки МТ-4 культивировали в среде RPMI 1640 с 10% сыворотки эмбрионов коров (НПП «ПанЭко»), 146 мг L-глутамина (НПП «ПанЭко», 100 мкг/мл гентамицина (Shandong Weifang Pharmaceutical Factory Co., Ltd., Швейцария), а мо-нослойные культуры СПЭВ, Vero и HEp-2 - в среде DMEM (НПП «ПанЭко») с 10% сыворотки эмбрионов коров (НПП «ПанЭко»), 146 мг L-глутамина (НПП «ПанЭко», 100 мкг/мл гентамицина (Shandong Weifang Pharmaceutical Factory Co., Ltd., Швейцария). Монослойные культуры клеток пересевали с помощью смеси раствора Версена с трипсином (НПП «ПанЭко»). Клетки культивировали в 96-луночных пластиковых панелях и культуральных флаконах (SPL Lifesciences, Корея).
Препараты: ДНК-Na и ДНК-Na-Fe производства ООО «ФЗ Иммуннолекс» в виде коммерческого раствора. Активной субстанцией препарата является биологически активная натриевая соль нативной вы-сокоочищенной низкополимерной дезоксирибону-клеиновой кислоты из молок осетровых рыб, относящейся к классу полимерных соединений с молярной массой 270-500 кД, гиперхромным эффектом свыше 37%, модифицированная ионами железа [3].
Исследование цитотоксического действия. Клетки рассевали на 96-луночные планшеты и добавляли исследуемое средство в различных концентрациях. Инкубировали клетки при 37 °C в атмосфере с 5% СО2 и 98% влажности. Через 3 дня определяли жизнеспо-
ВОПРОСЫ ВИРУСОЛОГИИ. 2022; 67(6)
https://doi.org/10.36233/0507-4088-148 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
собность с использованием 0,4% раствора трипано-вого синего и тетразолиевого красителя (метод МТТ) [6, 7]. В случае оценки жизнеспособности и подсчёта количества клеток с использованием трипанового синего клеточную суспензию и краситель смешивали в соотношении 1 : 1, через 5 мин помещали в камеру Горяева и определяли количество живых и мёртвых клеток под световым микроскопом. Процент живых клеток определяли путём умножения на 100 отношения количества живых клеток в 1 мл суспензии к общему количеству клеток в 1 мл суспензии. В опытах, в которых использовали МТТ бромида 3-(4,5-диме-тилтиазол)-2,5-дифенилтетразолия (Sigma-Aldrich, St. Louis, США), через определённое время для оценки жизнеспособности к каждой лунке добавляли 10 мкл 5 мг/мл MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, США). После инкубации 2-4 ч при 37 °C вносили в каждую лунку 100 мкл раствора диметилсульфокси-да, содержащего 10% додецилсульфата натрия. Затем определяли оптическую плотность (ОП) при 490 нм. Выживаемость клеток рассчитывали по формуле (1): (ОП опытных лунок - ОП среды) / (ОП контр. лунок - ОП среды) х 100%. (1)
Исследование противовирусного действия. К культуре клеток добавляли исследуемое средство по разным схемам: за 1 и 2 ч до инфицирования, одновременно с вирусом, через 1 ч после инфицирования клеток. Множественность инфекции - 10-3 ТЦИД50/клетка. Инкубировали культуры клеток при 37 °C в атмосфере с 5% СО2 и 98% влажности 3-4 дня. Учёт результатов: определение подавления репродукции вируса в клетках с помощью световой микроскопии: исследование цитопатического эффекта вируса (ЦПЭ) [6, 8], как описано выше.
Степень защиты клеток от цитодеструктивного действия вируса определяли по формуле (2):
А - B
% защиты =-х100,
(2)
K - B
где А - число жизнеспособных клеток в опытной группе; В - то же в инфицированной культуре (контроль вируса); К - то же в неинфицированной культуре (контроль клеток).
В качестве препаратов сравнения использовали антиретровирусные препараты: ингибитор обратной транскриптазы ВИЧ ретровир (азидотимидин) (GlaxoSmithKline, Великобритания) и ингибитор про-теазы ВИЧ криксиван (индинавир) (Merck Sharp & Dohme B.V., Нидерланды).
Исследование вирулицидного действия проводили методом смешивания вирусной суспензии и исследуемого средства (тест in vitro) при температуре 20 ± 2 °C, а также на тест-объекте - искусственной коже, где создавали вирусную пленку [8, 9]. В тесте in vitro смешивали тест-вирус (в соотношении 1 : 9) с исследуемым средством, инкубировали (согласно схеме исследования), готовили 10-кратные разведения смеси вируса и средства (10-1-10-8), а затем вносили в планшеты с культурой неинфицированных клеток. Планшеты инкубировали в СО-термостате при опти-
мальной для данного вируса температуре (34-37 °C) до развития 100% ЦПЭ (3-6 дней). Репродукцию вируса в клетках оценивали методом световой микроскопии по вирусиндуцированному ЦПЭ и окрашиванием клеток с помощью 0,4% раствора трипанового синего и тетразолиевого красителя [6-8], как описано выше.
При испытании на тест-объекте суспензию тест-вируса в объёме 0,2 мл наносили на поверхность тест-объекта и высушивали при температуре 20 ± 2 °C в течение 20-30 мин. Контаминированный вирусом тест-объект протирали тампоном, смоченным исследуемым средством, и оставляли на заданное время для обеззараживания. Контроль - проба, взятая с кон-таминированной вирусом поверхности, протёртая тампоном, смоченным водой. После истечения времени контакта вируса со средством контаминированную поверхность протирали тампоном, смоченным питательной средой. Аналогичную процедуру проводили с контролем (обработка поверхности без исследуемого средства). Затем проводили титрование тест-вируса на культурах клеток, как описано выше.
Индукция цитокинов. Клетки МТ-4 (концентрация 106/мл) инкубировали с ДНК-Na-Fe в концентрации 1000 мкг/мл в культуральной среде RPMI 1640 в течение 1 ч, отмывали (центрифугирование 5 мин при 800 оборотов/мин), добавляли свежую среду RPMI 1640 и инкубировали 12 ч при 37 °C.
Определение цитокинов. Определение цитокинов в культуральной жидкости проводили методом им-муноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов «ИФА-Бест» («Вектор-Бест», Россия) согласно инструкции изготовителя. Результаты учитывали с помощью фотометра Stat Fax-3200 (США) при длине волны 450/630 нм.
Методы статистической обработки результатов. Статистический анализ данных описательной статистики и определения коэффициента Стьюдента проводили с помощью программы BioStat 2009, версия 5 (AnalystSoft Inc., США). Уровень значимости а был равен 0,05.
Результаты
Полученные данные (табл. 1—3) показали, что ДНК-Na и ДНК-Na-Fe в дозах 250-2500 мкг/мл не оказывали цитотоксического действия на клетки Vero, НЕр-2 и СПЭВ.
Исследование противовирусного действия ДНК-Na и ДНК-Na-Fe показало (табл. 1), что они обладали противовирусной активностью в отношении аденовируса при всех схемах введения (до инфицирования клеток, одновременно с вирусом) при всех исследованных концентрациях - 250-1000 мкг/мл. Однако ЭК50 (50% эффективная концентрация) была достигнута только в случае дозы 1000 мкг/мл при применении ДНК-Na-Fe за 2 ч до инфицирования клеток. Индекс селективности (ИС) равен 10.
Противовирусный эффект не был обнаружен в случае вируса полиомиелита ни при какой схеме введения обоих препаратов (табл. 2).
ORIGINAL RESEARCH
Таблица 1. Исследование противовирусной активности дезоксирибонуклеата натрия и его комплекса с железом в отношении аденовируса
Table 1. Study of antiviral activity of sodium deoxyribonucleate and its complex with iron against adenovirus
Препарат Концентрация, мкг/мл Токсичность*, % Защита клеток**, % Cell protection**, %
Agent Concentration, ^g/ml Toxicity*, % за 2 ч до инфицирования 2 h before infection за 1 ч до инфицирования 1 h before infection одновременно с инфицированием Simultaneously with infection
ДНК-Na DNA-Na 1000 500 250 79,7 ± 0,03 83,0 ± 0,04 87,4 ± 0,04 40,6 ± 0,04 36,1 ± 0,03 32,9 ± 0,05 38,2 ± 0,03 33.8 ± 0,05 25.9 ± 0,06 31.2 ± 0,05 28.3 ± 0,05 23,0 ± 0,06
ДНК-Na-Fe DNA-Na-Fe 1000 500 82,0 ± 0,03 86,5 ± 0,04 51,0 ± 0,07 42,0 ± 0,04 42,9 ± 0,03 34,1 ± 0,04 37,9 ± 0,04 35,3 ± 0,07
250 91,4 ± 0,05 33,2 ± 0,04 28,3 ± 0,05 25,9 ± 0,03
Примечание. *По отношению к интактному контролю клеток. "Показатель защиты действия препарата от вируса, выраженный в %, ± стандартное отклонение (по формуле Рида-Менча).
Note. *In relation to intact cell control. **The indicator of drug-induced protection from the virus, expressed in %, ± standard deviation (according to the Reed-Mench formula).
Таблица 2. Исследование противовирусной активности дезоксирибонуклеата натрия и его комплекса с железом в отношении поли-овируса
Table 2. Study of antiviral activity of sodium deoxyribonucleate and its complex with iron against poliovirus
Препарат Концентрация, мкг/мл Токсичность* % Защита клеток**, % Cell protection**, %
Agent Concentration, ^g/ml Toxicity*, % за 2 ч до инфицирования 2 h before infection за 1 ч до инфицирования 1 h before infection одновременно с инфицированием simultaneously with infection
1000 81,0 ± 0,03 0 0 0
ДНК-Na DNA-Na 500 81,4 ± 0,04 0 0 0
250 92,5 ± 0,05 0 0 0
ДНК-Na-Fe 1000 84,2 ± 0,03 0 0 0
DNA-Na-Fe 500 90,7 ± 0,04 0 0 0
250 91,0 ± 0,05 0 0 0
Примечание. *По отношению к интактному контролю клеток. "Показатель защиты действия препарата от вируса, выраженный в %, ± стандартное отклонение (по формуле Рида-Менча).
Note. *In relation to intact cell control. **The indicator of drug-induced protection from the virus, expressed in %, ± standard deviation (according to the Reed-Mench formula).
Исследование противовирусного действия препаратов показало (табл. 3), что оба препарата обладали противовирусной активностью в отношении корона-вируса при всех схемах введения (до инфицирования клеток, одновременно с вирусом, после инфицирования клеток) при всех исследованных концентрациях - 100-2500 мкг/мл. ЭК50 для ДНК-Ыа составила ~2500 мкг/мл, для ДНК-Ыа^е —1000 мкг/мл. Уровень противовирусной защиты был практически одинаковым при всех схемах введения - и профилактической, и лечебной. ИС равен 4,6 и 10 соответственно.
С целью изучения механизма противовирусного действия препаратов исследовали секрецию цитоки-нов клетками МТ-4 после обработки ДНК-Ыа^е.
После инкубации с препаратом методом ИФА обнаружены провоспалительные цитокины - интерлей-кин (ИЛ) 1р (70 ± 0,014 пкг/мл), ИЛ-2 (2 ± 0,012 пкг/ мл), ИЛ-6 (6 ± 0,017 пкг/мл), ИЛ-18 (11 ± 0,021 пкг/ мл), интерферон (ИФН) а (37 ± 0,009 пкг/мл), ИФН-у (24 ± 0,017 пкг/мл) и противовоспалительные цитоки-
ны - ИЛ-4 (2 ± 0,012 пкг/мл), ИЛ-10 (34 ± 0,011 пкг/ мл), антагонист рецептора ИЛ-1 (12 ± 0,016 пкг/мл). В культуральной жидкости клеток, не обработанных препаратом, цитокины не обнаружены.
Исследование вирулицидной активности препаратов (табл. 4) показало наличие определенного эффекта в случае всех пяти вирусов при исследовании в суспензионном тесте in vitro при концентрации 1000 мкг/мл в пределах 1,0-3,0 lg ТЦИД50. Наибольшая вирусная редукция обнаружена в случае коронавируса при времени обеззараживания 60 мин - 3,0 lg ТЦИД50.
При уменьшении концентрации препаратов до 500 мкг/мл уровень редукции коронавируса оставался на прежнем уровне, но снижался при уменьшении концентрации до 250 мкг/мл или уменьшении времени обеззараживания до 15 мин (табл. 5). В случае применения способа обеззараживания методом протирания отмечено снижение исходного титра вируса на 4,0-5,0 lg ТЦИД50. Согласно нормативным документам (Р 4.2.3676-20), снижение титра тест-ви-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Таблица 3. Исследование противовирусной активности дезоксирибонуклеата натрия и его комплекса с железом в отношении коронавируса
Table 3. Study of antiviral activity of sodium deoxyribonucleate and its complex with iron against coronavirus
Защита клеток**, %
Концентрация, мкг/мл Concentration, Cell protection**, %
Препарат Токсичность* % одновременно
Agent ^g/ml Toxicity*, % за 2 ч до инфицирования за 1 ч до инфицирования с инфицированием
2 h before infection 1 h before infection simultaneously with infection
2500 85,3 ± 0,04 60,2 ± 0,07 57,0 ± 0,06 56,2 ± 0,08
1000 86,5 ± 0,02 43,2 ± 0,05 40,9 ± 0,07 40,0 ± 0,03
ДНК-Na DNA-Na 500 87,8 ± 0,03 40,7 ± 0,03 37,9 ± 0,03 37,9 ± 0,02
250 96,0 ± 0,07 36,9 ± 0,02 36,1 ± 0,03 35,6 ± 0,04
100 97,6 ± 0,05 34,0 ± 0,04 33,5 ± 0,03 33,1 ± 0,06
ДНК-Na-Fe 1000 92,0 ± 0,03 57,4 ± 0,03 55,3 ± 0,05 53,7 ± 0,05
DNA-Na-Fe 500 97,5 ± 0,04 44,2 ± 0,05 43,0 ± 0,04 37,3 ± 0,03
250 98,4 ± 0,08 41,5 ± 0,06 39,8 ± 0,02 33,3 ± 0,06
100 99,5 ± 0,02 40,7 ± 0,04 39,4 ± 0,05 32,9 ± 0,07
Ретровир 2,5 84,0 ± 0,03 Н.и. / N.i. 26,8 ± 0,05 Н.и. / N.i.
Retrovir 0,3 91,5 ± 0,05 Н.и. / N.i. 23,1 ± 0,04 Н.и. / N.i.
Криксиван 2,5 80,2 ± 0,06 Н.и. / N.i. 27,7 ± 0,06 Н.и. / N.i.
Crixivan 0,6 85,7 ± 0,04 Н.и. / N.i. 23,7 ± 0,02 Н.и. / N.i.
Примечание. Н.и. - не исследовали. *По отношению к интактному контролю клеток. "Показатель защиты действия препарата от вируса, выраженный в %, ± стандартное отклонение (по формуле Рида-Менча).
Note. N.i. - not investigated. *In relation to intact cell control. **The indicator of drug-induced protection from the virus, expressed in %, ± standard deviation (according to the Reed-Mench formula).
Таблица 4. Исследование вирулицидной активности препаратов в концентрации 1000 мкг/мл в отношении аденовируса, полиовируса, коронавируса, вируса иммунодефицита человека, вируса простого герпеса в суспензионном опыте (смешивание вируса и средства 1 : 9) in vitro
Table 4. Study of the virucidal activity of drugs in concentration 1000 ^g/ml against adenovirus, poliovirus, coronavirus, human immunodeficiency virus, herpes simplex virus in suspension (virus and agent mixed 1 : 9) in vitro
Препарат Время обеззараживания, Степень ингибирования, lg ТЦИД50* Degree of inhibition, lg TCID50*
Agent мин Decontamination time, min аденовирус Adenovirus полиовирус Poliovirus коронавирус Coronavirus ВИЧ-1 HIV-1 ВПГ-1 HSV-1
ДНК-Na 60 1,3 ± 0,04 1,6 ± 0,06 3,0 ± 0,03 1,3 ± 0,06 2,0 ± 0,03
DNA-Na 15 1,0 ± 0,05 1,0 ± 0,05 2,0 ± 0,06 1,0 ± 0,04 1,7 ± 0,06
ДНК-Na-Fe 60 2,0 ± 0,05 2,3 ± 0,04 2,0 ± 0,04 1,0 ± 0,06 1,7 ± 0,04
DNA-Na-Fe 15 1,5 ± 0,03 2,0 ± 0,03 1,9 ± 0,05 1,0 ± 0,05 1,7 ± 0,05
Примечание. *Степень ингибирования вируса, выраженная в lg ТЦИД50, ± стандартное отклонение (по формуле Рида-Менча). Note. *The degree of inhibition of the virus, expressed in lg TCID50, ± standard deviation (according to the Reed-Mench formula).
руса на 4,0 ^ ТЦИД50 и более позволяет считать средство обладающим вирулицидной активностью [9].
Обсуждение
Более 80% всех инфекционных заболеваний человека приходится на вирусные инфекции, многие из которых носят эпидемический характер. Поэтому человечество всегда стремилось воздействовать на болезнетворного возбудителя, даже не зная его природу.
Принципиально способы воздействия веществ на вирусы можно условно разделить на действие вне клетки и внутри клетки. Препараты, действующие
на вирус вне клетки, называют вирулицидными, а действующие внутри клетки, - противовирусными. Средства, обладающие одновременно и противовирусной, и вирулицидной активностью, естественно, представляют особый интерес.
В качестве объекта исследования были выбраны препараты ДНК-Na и ДНК-Na-Fe, ранее показавшие свою эффективность в отношении РНК- и ДНК-со-держащих вирусов [3, 4].
Обнаружена противовирусная активность ДНК-Na и ДНК-Na-Fe в отношении аденовируса. Полученные результаты позволяют отметить, что степень
ORIGINAL RESEARCH
Таблица 5. Исследование вирулицидной активности препаратов при обработке тест-объектов, инфицированных коронавирусом Table 5. Study of the virucidal activity of drugs in the treatment of test objects infected with coronavirus
Способ применения Method of application
Препарат Agent Концентрация, смешивание вируса и средства 1 : 9 in vitro Virus and agent mixed 1 : 9 in vitro протирание искусственной кожи Wiping an artificial leather
Concentration, ^g/ml время обеззараживания, мин decontamination степень ингибирования, lg ТЦИД50 degree of inhibition, lg TCID50 время обеззараживания, мин decontamination time, степень ингибирования, lg ТЦИД50* degree of inhibition, lg TCID50*
time, min min
ДНК-Na 500 60 3,0 ± 0,03 15 5,0 ± 0,02
DNA-Na 250 2,3 ± 0,02 5,0 ± 0,05
500 15 1,9 ± 0,06 5 4,3 ± 0,03
250 1,9 ± 0,04 4,0 ± 0,04
ДНК-Na-Fe 500 60 3,0 ± 0,06 15 5,0 ± 0,05
DNA-Na-Fe 250 2,1 ± 0,04 5,0 ± 0,02
500 15 2,3 ± 0,02 5 5,0 ± 0,03
250 2,0 ± 0,03 4,0 ± 0,05
Примечание. *Степень ингибирования вируса, выраженная в lg ТЦИД50, ± стандартное отклонение (по формуле Рида-Менча). Note. *The degree of inhibition of the virus, expressed in lg TCID50, ± standard deviation (according to the Reed-Mench formula).
защиты при воздействии ДНК-№ колебалась в пределах 25-40%. При этом наблюдалась зависимость эффективности от дозы и времени применения средства. Несмотря на небольшой разброс данных, можно отметить, что профилактическое применение за 1-2 ч до заражения было эффективнее, чем одновременное введение препарата с инфицированием клеток.
Однако в отношении полиовируса антивирусный эффект ДНК-Ыа и ДНК-Ыа^е не был обнаружен ни в одной из схем введения.
В цикле репродукции коронавируса есть этапы, связанные с функционированием фермента вируса полимеразы и использованием вирусом протеаз клетки TMPRSS2 и З^рго. Поэтому китайские специалисты, первые столкнувшиеся с эпидемией, попробовали применить различные ингибиторы вирусных ферментов [10]. В частности, было предложено использовать средства, которые применяют при лечении ВИЧ-инфекции, - препараты, ингибирующие ферменты ВИЧ.
В связи с этим нами были использованы в качестве референс-препаратов антиретровирусные средства ретровир и криксиван. Полученные результаты показали незначительную активность данных средств, что свидетельствует не в пользу их перспективности для ингибирования коронавируса.
Напротив, исследованные препараты ДНК-Ш и ДНК-№^е, созданные на основе двухспиральной ДНК природного происхождения, обладают противовирусной активностью в отношении представителя семейства Coronaviridae - вируса трансмиссивного гастроэнтерита. ДНК-Ыа^е более эффективен, чем ДНК-Ыа. В отличие от аденовируса, не наблюдается разницы в применении средства за 2 или 1 ч до инфицирования, одновременно или на 1 ч позд-
нее. Следует отметить, что и при внесении препарата через 1 ч после инфекции сохранялась противовирусная активность.
Исследование вирулицидной активности препаратов на модели РНК- и ДНК-содержащих вирусов, оболочечных и безоболочечных, выявило вирулицид-ную активность препаратов. Наблюдается ингибиро-вание инфекционности на 1-2 lg ТЦИД50. Наиболее чувствительным к действию препаратов оказался ко-ронавирус. Речь идет о тесте in vitro. При обработке поверхности, контаминированной вирусом, степень ингибирования достигала 4-5 lg ТЦИД50, что говорит о вирулицидной активности препаратов.
Данные вирусы принадлежат к разным вирусным семействам: Coronaviridae, Adenoviridae, Picornaviridae, и по классификации Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV) общий у них только один раздел - группа. По остальным градациям - надцарство (realm), царство, (kingdom), тип, класс, порядок и семейство - они не совпадают.
Ключевым параметром для разделения вирусов на таксоны является тип их генетического материала -нуклеиновая кислота (НК): РНК- и ДНК-содержащие вирусы. Другая важная характеристика - наличие ли-пидной оболочки у вириона, а также количество цепочек (нитей) НК.
Два из исследованных на наличие противовирусной активности вирусов являются однонитчатыми РНК-содержащими - вирус полиомиелита и корона-вирус. Аденовирус - ДНК-содержащий вирус с двумя цепями НК. Полио- и аденовирус объединяет отсутствие липидной оболочки у вирусной частицы. Самый мелкий из них - полиовирус - 25-30 нм. Коро-навирус и аденовирус крупнее - 70-90 и 120-160 нм соответственно.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Таблица 6. Противовирусная активность комплекса дезоксирибонуклеата натрия с железом в отношении вирусов разных семейств Table 6. Antiviral activity of the complex of sodium deoxyribonucleate with iron against viruses of different families
Вирус Virus
Вирус герпеса простого Herpes simplex virus
Цитомегаловирус Cytomegalovirus
Вирус гриппа Influenza virus
Вирус японского энцефалита Japanese encephalitis
Вирус иммунодефицита человека
Human immunodeficiency virus
Вирус
энцефаломиокардита Encephalomyocarditis
Аденовирус Adenovirus
Полиовирус Poliovirus
Коронавирус Coronavirus
Строение вириона Virion structure
Сферическая форма, линейная ДНК (2 цепочки) Spherical shape, linear DNA (double-stranded)
Сферическая форма, линейная ДНК (2 цепочки) Spherical shape, linear DNA (double-stranded)
Сферическая форма, РНК (1 цепочка), минус-нить, сегментированный Spherical shape, RNA (single-stranded), minus-strand, segmented
РНК (1 цепочка), плюс-нить, несегмен-тированный RNA (single-stranded), plus-strand, unsegmented
Сферическая форма, 2 молекулы РНК (1 цепочка), плюс-нить, обратная
транскрипция Spherical shape, 2 RNA molecules (single-stranded), plus-strand, reverse transcription
Икосаэдрическая форма, РНК (1 цепочка), плюс-нить, несегментированный Icosahedral shape, RNA (single-stranded), plus-strand unsegmented
Икосаэдрическая форма, линейная ДНК (2 цепочки) Icosahedral shape, linear DNA (double-stranded)
Сферическая форма, РНК (1 цепочка), плюс-нить Spherical shape, RNA (single-stranded), plus-strand
Сферическая форма, РНК (1 цепочка), плюс-нить Spherical shape, RNA (single-stranded), plus-strand
Наличие оболочки The presence of the envelope
Оболочка липопротеидная Lipoprotein envelope
Оболочка липопротеидная Lipoprotein envelope
Оболочка липопроте-
идная Lipoprotein envelope
Оболочка липопротеидная Lipoprotein envelope
Оболочка липопротеидная Lipoprotein envelope
Нет оболочки No envelope
Нет оболочки No envelope
Нет оболочки No envelope
Оболочка липопротеидная Lipoprotein envelope
Pазмер вириона, нм
Virion size, nm
120-200
120-200
Противовирусная
активность* Antiviral activity*
Есть Yes
Есть Yes
100
40-70
S0-120
З0
70-90
2З-З0
120-160
Есть Yes
Есть Yes
Есть Yes
Шт No
Есть Yes
Шт No
Есть Yes
Ранее нами была установлена противовирусная активность ДНК-Ыа^е в отношении ВИЧ, ВПГ, ци-томегаловируса, вирусов гриппа человека и птиц, вируса японского энцефалита [3, 4]. Однако не было обнаружено ингибирования репродукции вируса эн-цефаломиокардита мышей, который так же, как и по-лиовирус, является мелким безоболочечным вирусом из семейства Picomaviridae (табл. 6).
Пока остаётся неясным, почему исследуемые препараты избирательно не обладают противовирусным действием в отношении вируса полиомиелита и вируса энцефаломиокардита мышей, относящихся к семейству Picomaviridae. При этом их вирулицидное действие такое же, как и на другие исследуемые вирусы. Сам факт заслуживает дальнейшего внимания и исследования.
В поисках механизма противовирусного действия ДНК-Na ранее мы обнаружили индукцию в клетках продуктов амплификации ИЛ-1а, фактора некроза опухоли-а и в, а также низкомолекулярных факторов (< 3 кДа) в ответ на воздействие ДнК-Na-Fe [11]. В настоящем исследовании установили секрецию ци-токинов: провоспалительных - ИЛ-1Р, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-18, ИФН-а и -у и противовоспалительных - ИЛ-4, ИЛ-10, антагониста рецептора ИЛ-1.
Секреция цитокинов также обнаружена A.M. Ha-randi и соавт. [12] при применении синтетических ДНК-олигонуклеотидов с высоким содержанием CpG (CpG - сокращение для цитозина и гуанина, разделённых фосфатом, связывающим эти два ну-клеотида в структуре ДНК) для защиты от ВПГ-2 при вагинальной герпесвирусной инфекции у мышей.
ORIGINAL RESEARCH
Авторы объясняют 80% защиту животных от смертельной инфекции именно продукцией ИФН-у, ИЛ-12, ИЛ-18 и хемокина RANTES клетками слизистой половых путей мышей под воздействием ДНК-оли-гонуклеотидов.
Наличие в клетках Toll-подобных рецепторов (TLR), и в особенности TLR9, указывает на возможность лиганд-рецепторного взаимодействия TLR9 [13, 14] и ДНК-Na. В основе этого взаимодействия лежит сложный сигнальный путь, в конечном счёте приводящий к активации нескольких транскрипционных факторов, включая NF-kB, АР-1, IRF-7, что, в свою очередь, активирует продукцию провоспалительных цитокинов [5, 15].
При изучении иммуномодулирующей активности ДНК-Na-Fe в системе in vitro при использовании в качестве модели неопластической клеточной линии МТ-4, представляющей собой CD4+ Т-лимфоциты человека, трансформированные Т-лимфотропным вирусом человека 1-го типа, обнаружено снижение количества клеток, содержащих такие маркеры активации, как CD28, CD38, CD62L, CD69 и HLA-DR [16].
Белок CD62L, известный также как L-селектин, участвует в инфильтрации активированных T-лимфо-цитов в различные органы и ткани, где с их участием возможно развитие многих биологических процессов, в том числе и патологических. Вероятно, благодаря такому действию ДНК-Na-Fe снижается распространение клеток, содержащих интегрированный патогенетический материал, по органам и тканям, что приводит к замедлению генерализации инфекционного процесса. В то же время ДНК-Na-Fe не влиял на экспрессию интегринов P1 (CD29), а4 (CD49d) и рецептора интегринов ICAM-1 (CD54) [17].
Очевидно, что ДНК-Na и ДНК-Na-Fe обладают противовирусным эффектом, однако механизм действия, по-видимому, не связан со специфическим воздействием на репликацию вирусов. Также оба препарата обладают иммуномодулирующим действием и способны снижать активацию клеток. Это свойство может быть особенно полезно при лечении цитоки-нового шторма, характерного для COVID-19, а также нормализации иммунного ответа при ВИЧ-инфекции. Снижение уровня активации клеток иммунной системы к тому же снижает риск развития оппортунистических инфекций.
Исследование непосредственного действия (вне клетки) ДНК-Na и ДНК-Na-Fe на все исследованные вирусы (полиовирус, аденовирус, коронавирус, ВИЧ-1, ВПГ-1) показало наличие определённого вирулицид-ного эффекта. Особенно это интересно в случае вируса полиомиелита, у которого не обнаружен противовирусный эффект.
Таким образом, можно предположить, что при непосредственном контакте как ДНК-Na, так и ДНК-Na-Fe и вируса происходит некое воздействие на ви-рионы, приводящее к снижению их инфекционной активности.
Подобный вирулицидный эффект обнаружен в отношении ВПГ при использовании олигонуклеотида
ISIS 5652 в микромолярных количествах (1-2 мкМ) при 37 °C [18]. Авторы предполагают, что GT-олиго-нуклеотид индуцирует конформационные изменения в гликопротеине В ВПГ, который играет важную роль в прикреплении вируса к клетке и проникновении в неё. Отмечено исчезновение вирулицидного эффекта при 4 °C.
Следует отметить, что вирулицидный эффект в 2-3 lg ТЦИД50 на практике означает снижение урожая вируса в 100-1000 раз.
Наличие у ДНК-Na и ДНК-Na-Fe одновременно и противовирусной, и вирулицидной активности в отношении адено- и коронавирусов позволяет рассчитывать на их перспективность в профилактическом и лечебном применении. Нанесённый на слизистые оболочки препарат будет воздействовать на разные стадии вирусного цикла, начиная с этапа их прикрепления к клеткам организма-хозяина.
Помимо корона- и аденовирусов, препараты ДНК-Na и ДНК-Na-Fe обладают, как нами было показано ранее, противовирусным действием в отношении вирусов гриппа человека и птиц [3, 4]. Поэтому можно предположить, что данные средства будут эффективны в отношении всех основных возбудителей ОРВИ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Львов Д.К., ред. Руководство по вирусологии: Вирусы и вирусные инфекции человека и животных. М.: МИА; 2013.
2. Временные методические рекомендации. Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19). Версия 15; 2022. Available at: https://static-0. minzdrav.gov.ru/system/attachments/attaches/000/059/392/origi-nal/ВМР_COVID-19_V15.pdf
3. Носик Д.Н., Каплина Э.Н. Ферровир. Опыт применения в экспериментальной и лечебной практике. М.: Научная книга; 2005.
4. Носик Д.Н., Носик Н.Н., Каплина Э.Н., Калнина Л.Б., Киселева И.А., Кондрашина Н.Г. и др. Активность препарата «Ферровир» в отношении РНК- и ДНК-вирусов. Вопросы вирусологии. 2002; 47(3): 21-3.
5. БеседноваН.Н.,МакаренковаИ.Д.,ФедянинаЛ.Н.,АвдееваЖ.И., Крыжановский С.П., Кузнецова Т.А. и др. Дезоксирибонукле-иновая кислота про- и эукариот в профилактике и терапии инфекционных болезней. Антибиотики и химиотерапия. 2018; 63(5-6): 52-67.
6. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.; 2012.
7. Mosmann T. Rapid Colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 1983; 65(1-2): 55-63. https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4
8. Носик Д.Н., Носик Н.Н. Борьба с вирусами. Дезинфекция. М.: МИА; 2018.
9. Р 4.2.3676-20. Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности. М.; 2020.
10. Handbook of COVID-19 Prevention and Treatment. The First Affiliated Hospital, Zhejlang University School of Medicine; 2020. Available at: https://globalce.org/downloads/Handbook_of_ COVID_19_Prevention_en_Mobile.pdf
11. Nosik D., Kaplina E., Nosik N., Kalnina L., Tsutsumi R., Miura Y., et al. A Fe3+/DNA Complex induces an anti-human immunodeficiency virus factor(s) in CD4+ lymphocyte cell lines. Acta Virol. 1999; 43(1): 25-30.
12. Harandi A.M., Eriksson K., Holmgren J. A protective role of locally administered immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide in a mouse model of genital herpes infection. J. Virol. 2003; 77(2): 953-62. https://doi.org/10.1128/jvi.77.2.953-962.2003
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
13. Iwasaki A., Medzhitov R. Toll-like receptor control of the adaptive 6. immune responses. Nat. Immunol. J. 2004; 5(10): 987-95. https:// doi.org/10.1038/ni1112
14. Kumagai Y., Takeuchi O., Akira S. Pathogen recognition by innate receptors. J. Infect. Chemother. 2008; 14(2): 86-92. https://doi. 7. org/10.1007/s10156-008-0596-1
15. Sauter M.M., Gauger J.J., Brandt C.R. Oligonucleotides designed to inhibit TLR9 block Herpes simplex virus type 1 infection at multiple steps. Antiviral. Res. 2014; 109: 83-96. https://doi.org/10.1016/j. 8. antiviral.2014.06.015
16. Селимова Л.М., Калнина Л.Б., Каплина Э.Н., Носик Д.Н. Вли- 9. яние ферровира на экспрессию поверхностных маркёров активации клетками неопластической линии МТ-4. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62(6): 355-9. https://doi. 10. org/10.18821/0869-2084-2017-62-6-355-359
17. Калнина Л.Б., Селимова Л.М., Каплина Э.Н., Носик Д.Н. Экспрессия интегринов Р1, а4 и молекулы клеточной адгезии ICAM-1 в присутствии дезоксирибонуклеата натрия с железом 11. комплекса (ДНК-Na-Fe) клетками МТ-4, трансформированными Т-лимфотропным вирусом человека 1 типа (Retroviridae: Orthoretrovirinae: Deltaretrovirus: Human T-lymphotropic virus
type 1). Вопросы вирусологии. 2021; 66(3): 227-32. https://doi. 12. org/10.36233/0507-4088-57
18. Shogan B., Kruse L., Mulamba G., Hu A., Coen D. Virucidal activity of a GT-Rich oligonucleotide against herpes simplex virus mediated by glycoprotein B. J. Virol. 2006; 80(10): 4740-7. https://doi. 13. org/10.1128/jvi.80.10.4740-4747.2006
REFERENCES 14.
1. L'vov D.K., ed. Guidance to Virology: Viruses and Viral Infections
of Humans and Animals [Rukovodstvo po virusologii: Virusy i 15. virusnye infektsii cheloveka i zhivotnykh]. Moscow: MIA; 2013. (in Russian)
2. Temporary guidelines. Prevention, diagnosis, and treatment of novel coronavirus infection (COVID-19). Version 15; 2022. 16. Available at: https://static-0.minzdrav.gov.ru/system/attachments/ attaches/000/059/392/original/BMP_C0VID-19_V15.pdf (in Russian)
3. Nosik D.N., Kaplina E.N. Ferrovir. Experience of Application in Experimental and Medical Practice [Ferrovir. Opyt primeneniya 17. v eksperimental'noy i lechebnoy praktike]. Moscow: Nauchnaya kniga; 2005. (in Russian)
4. Nosik D.N., Nosik N.N., Kaplina E.N., Kalnina L.B., Kiseleva I.A., Kondrashina N.G., et al. Activity of «Ferrovir» preparation towards RNA and DNA viruses. Voprosy virusologii. 2002; 47(3): 21-3. (in Russian)
5. Besednova N.N., Makarenkova I.D., Fedyanina L.N., Avdeeva 18. Zh.I., Kryzhanovskiy S.P., Kuznetsova T.A., et al. Prokaryotic and eukaryotic DNA in prevention and treatment of infectious diseases. Antibiotiki i khimioterapiya. 2018; 63(5-6): 52-67. (in Russian)
Mironov A.N., Bunatyan N.D. Guidelines for Conducting Preclinical Studies of Medicinal Products [Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskikh issledovaniy lekarstvennykh sredstv]. Moscow; 2012. (in Russian)
Mosmann T. Rapid Colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 1983; 65(1-2): 55-63. https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4
Nosik D.N., Nosik N.N. Fight against viruses. Disinfection [Bor 'ba s virusami. Dezinfektsiya]. Moscow: MIA; 2018. (In Russian) Guidelines R 4.2.3676-20. Methods of laboratory research and testing of disinfectants to evaluate their effectiveness and security. Moscow; 2020. (in Russian)
Handbook of COVID-19 Prevention and Treatment. The First Affiliated Hospital, Zhejlang University School of Medicine; 2020. Available at: https://globalce.org/downloads/Handbook_of_ COVID_19_Prevention_en_Mobile.pdf
Nosik D., Kaplina E., Nosik N., Kalnina L., Tsutsumi R., Miura Y., et al. A Fe3+/DNA Complex induces an anti-human immunodeficiency virus factor(s) in CD4+ lymphocyte cell lines. Acta Virol. 1999; 43(1): 25-30.
Harandi A.M., Eriksson K., Holmgren J. A protective role of locally administered immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide in a mouse model of genital herpes infection. J. Virol. 2003; 77(2): 953-62. https://doi.org/10.1128/jvi.77.2.953-962.2003 Iwasaki A., Medzhitov R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. J. 2004; 5(10): 987-95. https:// doi.org/10.1038/ni1112
Kumagai Y., Takeuchi O., Akira S. Pathogen recognition by innate receptors. J. Infect. Chemother. 2008; 14(2): 86-92. https://doi. org/10.1007/s10156-008-0596-1
Sauter M.M., Gauger J.J., Brandt C.R. Oligonucleotides designed to inhibit TLR9 block Herpes simplex virus type 1 infection at multiple steps. Antiviral. Res. 2014; 109: 83-96. https://doi.org/10.1016/j. antiviral.2014.06.015
Selimova L.M., Kalnina L.B., Kaplina E.N., Nosik D.N. The effect of Ferrovir on to expression of surface markers of activation by cells neoplastic line MT-4. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2017; 62(6): 355-9. https://doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-6-355-359 (in Russian)
Kalnina L.B., Selimova L.M., Kaplina E.N., Nosik D.N. Expression of integrins P1, a4 and cell adhesion molecule ICAM-1 in the presence of sodium deoxyribonucleate with Ferrum complex (DNA-NA-FE) by MT-4 cells transformed by human T-lymphotropic virus type 1 (Retroviridae: orthoretrovirinae: deltaretrovirus: human T-lymphotropic virus type 1). Voprosy virusologii. 2021; 66(3): 227-32. https://doi.org/10.36233/0507-4088-57 (in Russian) Shogan B., Kruse L., Mulamba G., Hu A., Coen D. Virucidal activity of a GT-Rich oligonucleotide against herpes simplex virus mediated by glycoprotein B. J. Virol. 2006; 80(10): 4740-7. https:// doi.org/10.1128/jvi.80.10.4740-4747.2006
