CC BY
35
Є
Противовирусная активность Ингавирина®
«_» «_» U 1
при экспериментальной летальной гриппознои инфекции у белых мышеИ, вызванной вирусом гриппа В
В. В. ЗАРУБАЕВ1, А. В.ГАРШИНИНА1, Н. А. КАЛИНИНА1, А. А. ШТРО1, В. Е. НЕБОЛЬСИН2, О. И. КИСЕЛЕВ1
1 НИИ гриппа СЗО РАМН, Санкт-Петербург
2 ОАО «Валента Фарм», Москва
Antiviral Activity of Ingavirin® in Experimental Lethal Influenza Due to Influenza Virus B in Albino Mice
V. V. ZARUBAEV, A. V. GARSHININA, N. A. KALININA, A. A. SHTRO, V. E. NEBOLSIN, O. I. KISELEV
Research Institute of Influenza, North-West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, St. Petersburg JSC Valenta Pharm Co., Moscow
Изучена протективная активность Ингавирина® на модели экспериментальной гриппозной инфекции, вызванной вирусом гриппа В, по сравнению с препаратом Арбвдол®. Показано, что применение Ингавирина® приводит к достоверному снижению титров вируса в лёгочной ткани животных, нормализации весовых показателей, снижению смертности и увеличению средней продолжительности жизни. При этом активность Ингавирина® превосходила активность препарата сравнения. Приведённые данные позволяют рассматривать Ингавирин® как перспективное средство профилактики и лечения гриппозной инфекции у человека.
Ключевье слова: Ингавирин®, грипп, вирус гриппа В, противовирусная химиотерапия.
The protective activity of Ingavirin® against experimental infection caused by influenza B virus was studied on albino mice vs.
Arbidol®. Oral use of Ingavirin® was shown to decrease the infectious titers of the virus in the animal lung tissue, to normalize the /T\
body weight dynamics, to lower the mortality and to increase the average lifespan vs. the placebo-treated animals. The activity of vv
Ingavirin® was higher than that of the reference drug. The results allowed to consider Ingavirin® as a prospective agent for the treatment of influenza infection in humans.
Key words: Ingavirin®, influenza, virus B, antiviral chemotherapy.
Введение
Грипп является высокоинфекционным заболеванием и представляет угрозу здоровью, а часто и жизни людей. Типичной особенностью эпидемий гриппа последних десятилетий является одновременная циркуляция среди населения вирусов гриппа типов А и В. Появление в 2009 г. среди человеческой популяции нового подтипа вируса гриппа Н1Ш [1], вызвавшего пандемию, особенно остро поставило вопрос о необходимости разработки новых эффективных противовирусных препаратов.
Арсенал противогриппозных химиопрепаратов на сегодняшний день весьма ограничен. Производные адамантана — амантадин и риман-тадин — проявляют активность против вируса гриппа А и не эффективны против гриппа В [3]. Более того, начиная с 1990-х годов среди вирус© Коллектив авторов, 2010
Адрес для корреспонденции: 196376, Санкт-Петербург ул. проф. Попова 15/17. НИИ гриппа
ной популяции, даже среди исходно чувствительных подтипов, быстро распространились ри-мантадиноустойчивые варианты, так что к настоящему времени подавляющее большинство вирусных изолятов, в том числе 100% пандемических штаммов, не восприимчивы к этой группе препаратов. Средства второго поколения — ингибиторы вирусной нейраминидазы осельтами-вир, занамивир и перамивир — проявляют активность против всех подтипов вируса гриппа [4]. Однако и в отношении этих препаратов следует отметить появление и распространение устойчивых штаммов. Кроме того, в случае позднего начала лечения эти средства не столь эффективны, что в клинической практике может привести к развитию вирусной или вирусно-бактериальной пневмонии на сроках от 3 и более суток после инфицирования.
Таким образом, существует острая необходимость поиска и разработки новых эффективных средств лечения гриппа, обладающих широким
-е-
e
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
спектром активности с механизмом, отличным от уже применяемый в клинике средств. Ранее в 2009 году специалистами филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России — ВЦ» быша показана эффективность Ингавирина® in vitro в отношении вируса гриппа В [6].
Цель настоящего исследования состояла в изучении активности нового противовирусного препарата Ингавирин® (имидазолилэтанамида пентандиовой кислоты) в отношении экспериментальной инфекции in vivo, вызванной вирусом гриппа В.
Материал и методы
Препараты. В работе использовали препарат Ингавирин® производства ОАО «Валента Фарм», Россия. В качестве препарата сравнения использовали Арбидол® (Фармстандарт, Россия). Препараты растворяли или суспендировали в физиологическом растворе до необходимым: концентраций и использовали для перорального введения животным через желудочный зонд.
Вирусы. Вирус гриппа B/Lee/40 был получен из коллекции вирусов НИИ гриппа РАМН и пассирован в аллантоисной полости 10—12-дневныгх куриныгх эмбрионов в течение 72
4 при 34°С.
Животные. Работа проведена на белыгх беспородных мышах (самки) массой 18—22 г, которые быши получены из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.) и содержались на стандартном рационе в регламентированныгх условиях вивария НИИ гриппа РАМН. Подбор животных в группы опыта проводили методом случайной выборки. До начала испытаний животные находились под наблюдением 2 недели.
Экспериментальная гриппозная инфекция. Перед экспериментом 5 мышей были заражены вируссодержащей аллантоисной жидкостью. На 3 сутки после заражения лёгкие заражённый мышей были изолированы, гомогенизированы в 10-кратном объёме стерильного физиологического раствора, после чего инфекционная активность вируса в гомогенате была определена в отдельном эксперименте при помощи титрования по летальности на животных. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча [5].
Исследуемые препараты вводили животным перорально в следующих дозах: Ингавирин® — 15 мг/кг, Арбидол® — 130 мг/кг массы. Препараты вводили в объёме 0,2 мл по лечебной схеме (через 24, 48, 72, 96 и 120 ч после заражения). В качестве плацебо контрольной группе животных вводили физиологический фосфатный буфер.
Животных интраназально под лёгким эфирным наркозом инфицировали вирусом гриппа В в дозе 5 LD50. В каждую группу наблюдения брали по 15 мышей. Параллельно формировали такие же группы животных, включающие по
5 мышей, для контроля вирусной репликации в лёгких. На 3-й день после заражения животных из этих групп умерщвляли, вскрывали и изолировали лёгкие для выделения вируса. Лёгкие хранили при -20°С до постановки соответствующих экспериментов.
Наблюдение за оставшимися животными осуществляли в течение 14 дней, то есть срока, в течение которого при экспериментальном гриппе отмечается смертность животных. Фиксировали массу и ежедневную смертность животныгх в контрольных и опыггныгх группах. На основании полученных показателей смертности в каждой группе рассчитывали процент смертности (M, отношение числа павших за 14 дней животныгх к общему числу заражённый: животныгх в группе), индекс защиты (IP, отношение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту смертности в контрольной группе) и среднюю продолжительность жизни
животных (MDD) из расчёта 14 дней наблюдения в соответствии со следующими формулами:
MDD=(END)/Nt,
где N — количество животныгх, проживших D дней, Nt — общее число животныгх в группе.
M=M/Nt,
где M — число животныгх в группе, павших в течение 14 дней после заражения.
IP=((Mc—Me)/Mc)X100%,
где Mc и Me — смертность в процентах в контрольной и опытной группах соответственно.
Титрование вируса в лёгочной ткани. Для определения инфекционного титра вируса гриппа в лёгочной ткани животныгх лёгкие мышей, извлечённые на 3 сутки после инфицирования, гомогенизировали в десятикратном объёме стерильного физиологического фосфатного буфера и готовили из гомогенатов серию десятикратныгх разведений на том же буфере. Полученными разведениями инфицировали клетки MDCK в 96-луночныгх планшетах и культивировали в течение 48 часов при 36°С в атмосфере 5% CO2.
Иммуноферментный анализ. По окончании срока инкубации клетки промывали два раза нейтральным фосфатным буфером, фиксировали 10 мин при +4°С 80% ацетоном, промывали 5 мин дистиллированной водой и высушивали на воздухе.
Первичные типоспецифические антитела против вирусов гриппа (OOO ППДП, Санкт- Петербург), распознающие вирусный гемагглютинин, растворяли в фосфатном буфере с добавлением 5% обезжиренного сухого молока (для блокирования сайтов неспецифического связывания антител с белковыми детерминантами) до концентрации 5 мкг/мл и инкубировали с фиксированными клетками в течение 1 ч при 37°С (0,1 мл на лунку). Клетки промывали 3 раза по 0,1 мл/лунку фосфатного буфера и инкубировали с раствором ан-тимышиного иммуноглобулина, меченного пероксидазой (Sigma, Cat.# A2304), в разведении 1:10000 (0,1 мл на лунку) в течение 1 ч при 37°С. Несвязавшиеся антитела отмывали 3 раза по 0,1 мл/лунку фосфатного буфера и проводили цветную реакцию с раствором 3,3, 5,5-тетраметилбензидина с добавлением 0,03% перекиси водорода в ацетатном буфере рН 5,0 (0,1 мл на лунку). Реакцию останавливали 2N серной кислотой (0,1 мл на лунку) и измеряли оптическую плотность в ячейках при длине волны 450 нм на микропланшетном ридере Victor 1420 (Wallac, Финляндия). Реакцию считали положительной, если оптическая плотность в ячейках превышала фоновые значения для интактных клеток вдвое и более.
За инфекционный титр вируса принимали величину, противоположную десятичному логарифму максимального разведения исходного гомогената, способного вызвать положительную реакцию на присутствие вирусных антигенов. О вирусингибирующем действии соединений судили по снижению титра вируса в лёгких.
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили при помощи программы Microsoft Excel. Достоверность отличий между показателями контрольный: и опыггаыгх групп оценивали при помощи двухвыборочного t-теста с разными дисперсиями (Сервис — Анализ данных — Двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями) при p<0,05.
Результаты и обсуждение
В эксперименте не было отмечено неспецифической смертности в контрольной группе интактных животных. Клинические признаки заболевания были типичными для гриппозной инфекции и включали затруднённое дыхание, атаксию, тремор, а также снижение потребления корма и воды.
-Q-
Є
Таблица 1. Активность химиопрепаратов в отношении вируса гриппа ВДее/40, выделяемого из лёгких животных на 3 сутки после заражения, по результатам иммуноферментного анализа
Группы животных
Титры вируса в ткани лёгких ЕГО50/20 мг ткани, М±8Е)
на 3 сутки после инфицирования
Ингавирин®
Арбидол®
Контроль
І,90+0,06* 2,4З+0,ІЗ* 3,40+0,І2
Примечание. * - отличия от контроля без препарата достоверны при р<0,05.
Таблица 2. Смертность в ходе патологического процесса при экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых мышей, вызванной вирусом гриппа ВДее/40 в условиях применения химиопрепаратов
Группы
животных
Количество животных в группе, n
Смертность по дням, n
1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14
СПЖ, сут. Смертность, Индекс (M±SE) % защиты, %
Ингавирин®
Арбидол®
Контроль
ІЗ
ІЗ
ІЗ
І
2
І
ІЗ,І+0,7*
І2,З+0,4
І0,7+0,З
40,0
З3,3
86,7
ЗЗ,8
З8,З
Примечание. * - отличия от контроля достоверны при р<0,05. СПЖ - средняя продолжительность жизни.
Таблица 3. Влияние химиопрепаратов на динамику массы тела животных при экспериментальной летальной гриппозной инфекции, вызванной вирусом гриппа ВДее/40
Группы животных
Масса живо тных, г (M±SE) на срок после заражения, сут.
0
5
7
8
10
13
Ингавирин® Арбидол® Контроль вируса
І8,7+0,4
І8,7+0,4
І7,8+0,4
І8,2+0,З*
І7,4+0,З*
І6,І+0,З
І7,0+0,З*
І6,0+0,3
ІЗ,І+0,4
І6,2+0,4*
ІЗ,І+0,З
І4,4+0,3
І4,8+0,4*
І4,4+0,З*
ІЗ,З+0,З
І4,І+0,З*
ІЗ,З+0,З*
І2,4+0,З
І4,4+0,З
ІЗ,9+0,2
ІЗ,2+0,4
Примечание. * - отличия от контроля без препаратов достоверны при р<0,05.
Данные по действию исследованных препаратов на инфекционный титр вируса гриппа в лёгких животных представлены в табл. 1. Как видно из табл. 1, Ингавирин® статистически достоверно снижал вирусную активность на 1,5 порядка (в 13 раз). При этом активность Арбидола® проявлялась в меньшей степени и также достигала достоверных отличий от контрольных показателей.
Использованный вирус гриппа В вызывал у мышей патологический процесс, заканчивающийся к 15 суткам эксперимента гибелью 80—87% животных. Эффективность Ингавирина® превосходила эффективность Арбидола® (54 против 39% у Арбидола®) (табл. 2, рисунок).
Полученные данные в целом коррелировали с результатами изучения динамики веса животных в ходе патологического процесса (табл. 3).
На основании проведённого исследования следует отметить наличие у Ингавирина® противовирусной активности в отношении вируса гриппа В, против которого не эффективны традиционные препараты адамантанового ряда. Применение Ингавирина® при экспериментальной инфекции приводит к достоверному снижению титров вируса в лёгочной ткани животных, нормализации весовых показателей животных, снижению смертности и увеличению средней про-
должительности жизни. Результаты настоящего исследования коррелируют с результатами, полученными in vitro [6].
Таким образом, приведённые данные позволяют рассматривать Ингавирин® как перспективное средство профилактики и лечения гриппозной инфекции у человека.
Динамика смертности животных в ходе патологического процесса при экспериментальной летальной гриппозной инфекции, вызванной вирусом гриппа ВДее, в условиях применения химиопрепаратов.
-Є
І
І
e
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЛИТЕРАТУРА
1. http://www.who.int/csr/don/2009_11_13/en/index.html
2. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65: 55—63.
3. Scholtissek C, Quack G., Klenk H. D., Webster R. G. How to overcome resistance of influenza A viruses against adamantane derivatives. Antiviral Res 1998; 37: 83—95.
4. Woodhead M., Lavanchy D., Johnston S. et al. Neuraminidase inhibitors: progress in the management of influenza. Int J Clin Pract 2000; 54: 9: 604—610.
5. Reed L. J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg 1938; 27: 493—497.
6. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Семенова И. А. и др. Изучение эффективности Ингавирина® in vitro в отношении возбудителя гриппа В. Антибиотики и химиотер 2009; 7—8: 13—15.
