CC BY
163УДК 577.131.044
ПРОТИВОГРИБКОВЫЕ ПОАИЕНОВЫЕ АНТИБИОТИКИ И ИХ АКТИВНОСТЬ В КЛЕТОЧНЫХ И ЛИПИДНЫХ МЕМБРАНАХ
Самедова А.А. (ведущий научный сотрудник)*
Институт Ботаники Национальной Академии Наук Азербайджана, Баку, Азербайджан
© Самедова А А., 2010
В настоящем обзоре освещены биохимические, биофизические и молекулярно-биологические аспекты механизма действия фунгицидных полиеновых антибиотиков в мембранах клеток.
Показано взаимодействие различных представителей дан-ного класса веществ со стериновым компонентом клеточных мембран, что приводит к формированию ионных каналов в мембранах, проницаемых для ряда ионов и низкомолекулярных органических соединений.
Ключевые слова: бислойные липидные мембраны, ионные каналы, полиеновые антибиотики, проводимость
ANTIFUNGAL POLYENE ANTIBIOTICS AND THEIR ACTIVITY IN CELL AND LIPID MEMBRANES
Samedova A.A. (leading scientific researcher)
Institute of Botany, Azerbaijan National Academy of Sciences, Baku, Azerbaijan
© Samedova A.A., 2010
Biochemical, biophysical and molecular biological aspects of mechanism of action of fungicidal polyene antibiotics are reflected in this review.
There are shown the interaction between different representatives of this type substances and sterol compounds of the cell membranes that will form ionic channels in cell membranes, penetrating for some ions and small-size molecules of organic substances.
Key words: polyene antibiotics, conductance, ionic channels, bilayer lipid membranes.
* Контактное лицо: Самедова Арифа Али Гасановна
Тел.: +994557782662
ВВЕДЕНИЕ
Все явления, свойственные живым организмам, в той или иной степени связаны с клеточными мембранами. Значение мембран в жизнедеятельности клетки и организма, в целом, трудно переоценить. Мембраны участвуют в процессах адгезии и узнавании клеток друг другом, генерируют электрические импульсы, участвуют в сокращении и расслаблении мышц. Мембраны сетчатки глаза трансформируют световую энергию в энергию электрического импульса. Мембраны хлоропластов зеленых растений и митохондрий используют солнечную энергию для фотосинтеза. В основе всех вышеперечисленных процессов лежит изменение ионной проницаемости клеточных мембран.
Основным компонентом всех клеточных мембран является бимолекулярный слой липидов. Методом реконструкции липидов клеточных мембран удалось выяснить основные механизмы транспорта ионов через мембраны. Для изучения электрических характеристик и транспортных процессов мембран удобно использовать ламеллярные структуры в виде плоских бимолекулярных мембран. При сравнительном анализе электрических характеристик клеточных и бислойных липидных мембран (БАМ) показано, что по многим параметрам характеристики клеточных мембран совпадают с бислойными мембранами: по электрической емкости, толщине, напряжению разрыва, коэффициенту поверхностного натяжения, проницаемости для воды, потенциалу покоя и показателю преломления. Однако сопротивление бислойных мембран на много порядков - в 105-106 раз превышает сопротивление клеточных мембран. И благодаря именно этому свойству бислойных мембран удалось в дальнейшем выявить основные механизмы ионного транспорта через мембраны.
Прогресс, достигнутый в изучении механизма мембранного транспорта, связан в значительной степени с антибиотиками. В середине 70-х и в начале 80-х годов ХХ-го столетия был обнаружен класс каналообразующих соединений - полиеновые антибиотики (ПА) (ЕггшяЫап Ь.М, е1 а1, 1977; Каяитоу КЬ.,е1а1., 1979, 1981).
Основными представителями этого класса соединений являются амфотерицин В, нистатин, мико-гептин и леворин. ПА являются одними из самых эффективных препаратов для лечения грибковых инфекций, глубоких системных микозов и широко используются в клинической медицине уже много десятилетий. Макролидные антибиотики представляют собой большую группу природных соединений, которые обладают высокой биологической активностью и используются в клинической практике как антибактериальные, противогрибковые, антипара-зитарные и имуннодепрессивные препараты [1]. ПА активны в отношении дрожжей, различных грибов и других эукариотов, но не действуют на бактерии (за исключением микоплазм, выращиваемых в присут-
ствии стеринов) и на сине-зеленые водоросли. Было установлено, что ПА увеличивают проницаемость мембран, содержащих в своем составе холестерин, для одновалентных анионов и катионов щелочных металлов по механизму образования ионных каналов. Оказалось, что полиеновые ионные каналы находятся в проводящем состоянии больше одной минуты. При исследованиях выявили, что молекулы ПА оказались доступными к химической модификации. Имея ряд производных полиеновых молекул, модифицированных в различных частях лактон-ного кольца, можно изучить роль отдельных функциональных группировок в полиеновой молекуле и установить взаимосвязь между структурой молекул и их функцией в липидных мембранах. Это позволяет создать теоретически обоснованную рекомендацию к синтезу новых антибиотиков с заданными свойствами, внести значительный вклад в изучение молекулярного механизма ионной избирательности биологических мембран и принципов функционирования ионных каналов в клеточных мембранах.
Классификация, общая формула и химическое строение ПА
ПА представляют собой большой класс природных соединений, продуцируемых микроорганизмами рода ^1гер1отусеа. Современный перечень ПА содержит более 200 антибиотиков. Полиены относят к числу макролидных соединений; они характеризуются тем, что в состав их молекул входит лактонное макроциклическое кольцо, содержащее определенное число двойных связей. В химической структуре всех ПА имеется макролидное кольцо, содержащее то или иное число сопряженных двойных связей, которые определяют хромофорные свойства данного вещества. Отсюда их общее название
- «полиены». Лактонное кольцо образовано, с одной стороны, цепью из сопряженных двойных связей (тетраены-октаены), а с другой стороны - цепочкой с гидрофильными радикалами, в основном, гидроксильными и карбонильными группами. На одном конце молекул содержатся две заряженные группы: карбоксильная и аминосахар (микозамин), которые придают молекулам амфотерные свойства. Длина лактонного кольца молекул ПА составляет примерно 2,8 нм. Макролидное кольцо молекул ПА содержит жесткую гидрофобную область (сопряженные двойные связи хромофора) и гидрофильную область с различным числом группировок как полярных, так и неполярных, которые обусловливают некоторые специфические свойства полиенов. Некоторые ПА могут содержать аминосахар, карбоксильную, алифатическую или ароматическую боковые группы в определенных положениях. ПА содержат гидрок-силированный участок и систему ненасыщенных конъюгированных двойных связей, имеющих исключительно тра не- к о н ф и г у р а ц и к). В молекулах ПА имеется гидрофобная цепь, в состав которой входят сопряженные двойные связи хромофора, и гидро-
фильная цепь, составленная гидроксильными и карбонильными группами. В химической структуре ПА находятся от 20-44 атомов углерода, а также от 3 до 8 сопряженных конъюгированных двойных связей.
Согласно классификации ПА амфотерицин В, кандицидин, трихомицин и леворин относятся к подгруппе гептаеновых антибиотиков, в то время как пимарицин и нистатин представляют подгруппу те-траенов. Нистатин относят к тетраеновой группе по той причине, что одна насыщенная связь разделяет хромофорную цепочку на диеновый и тетраеновый участки. В остальном нистатин структурно аналогичен амфотерицину В. В структуре макролактонно-го кольца ПА имеются водорастворимые полярные группировки, обладающие высокой биологической активностью. Хромофорная система с определенным числом двойных связей, входящая в структуру молекул полиенов, определяет конформационную жесткость всего макролактонного кольца [2, 3]. В структуре молекул ПА имеется гемикетальное кольцо, содержащее 8 углеродных атомов, соединенное гликозидной связью с макролактонным кольцом. Атом углерода при положении С19 соединяется гликозидной связью с аминосахаром. Из всех полиенов в биологическом аспекте наиболее подробно изучен амфотерицин В. На биологическую активность ПА оказывает влияние ряд функциональных групп, входящих в структуру молекул. Аминосахар у большинства гликозилированных молекул ПА представлен в виде микозамина, в то время как другие полиены вместо микозамина содержат перозамин. Карбоксильная функциональная группа в молекулах большинства ПА связана с углеродным атомом при положении С16. Установлено, что химическая модификация аминной и карбоксильной группы влияет на физико-химические свойства и биологическую активность молекул ПА [4].
ПА разделяют на две подгруппы. К первой подгруппе относят антибиотики, не содержащие ароматическую группировку (амфотерицин В, нистатин, кандидин, микогептин). В состав молекул неароматических полиеновых соединений входят карбоксильная и аминосахарная группы. Аминосахар относится к микозамину или перозамину. Ко второй подгруппе относят антибиотики, содержащие в своем составе, кроме аминосахара (микозамина), дополнительную ароматическую группировку: леворин, кандицидин, гамицин, аскозин, перимицин (Вого\те1а Е., е1 а1., 1971).
Полиены классифицируют как п-ены, где п равно числу конъюгированных двойных связей. В зависимости от числа двойных связей в хромофоре полиенов, ПА разделяют на несколько групп - триены, тетраены, пентаены, гексаены, гептаены, октаены (КоЙег-Вга^Ьигд е1 а1., 1979).
Физико-химические и биологические свойства ПА
Полиеновые макролидные антибиотики являют-
ся классическими структурными каналоформерами. В присутствии ПА удается получить полную зависимость проводимости мембран от концентрации антибиотиков. Исследование свойств ионных каналов, образуемых ПА и их производными с известной структурой молекул, представляет собой реальный путь к выяснению механизмов работы и управления систем проницаемости на молекулярном уровне. Исследуя кинетику проводимости бислойных липидных мембран (БАМ) в зависимости от структуры каналоформирующих молекул, можно судить не только о молекулярных перестройках ионного канала, вызывающих изменение проводимости мембран, но и о физико-химических процессах, протекающих внутри самой мембраны. Как отмечено выше, биологическая активность ПА зависит от таких функциональных групп, как карбоксильная, гидроксильная, аминная и метильная, которые присоединяются к макролактонному кольцу в процессе его синтеза. С целью выяснения механизма формирования ионпро-водящих полиеновых структур в мембранах необходимо, прежде всего, исследовать на молекулярном уровне характерные особенности взаимодействия липидных компонентов мембран с ПА как модификаторов мембранной проницаемости. Было показано образование двух типов пор, проницаемых для ионов и воды, соответственно. При обработке липосом низкими концентрациями антибиотика в мембранах формируется первый тип пор, имеющий характер «ионных». При больших концентрациях антибиотика формируется второй тип пор - водных.
Выяснить механизм ионной проницаемости мембран, модифицированных полиенами, можно только при учете взаимодействия всех структурных компонентов мембраны: антибиотиков, стеринов и фосфолипидов. В этом аспекте мы изучали связь структуры антибиотиков (производные амфотерицина В) с биологической активностью на клетках и липидных мембранах в зависимости от содержания в бислоях холестерина и других стеринов. Изучение молекулярного механизма действия ПА непосредственно на клетках сопряжено с большими трудностями вследствие взаимосвязи процессов клеточного метаболизма. В этом отношении использование бислойных липидных мембран является новым этапом в исследовании механизма действия полиенов. По сравнению с монослоями и липосомами, БАМ - более совершенная модель, на которой воспроизводятся важные функциональные и структурные особенности клеточных мембран. Исследуя действие различных производных молекул амфотерицина В, химически модифицированных в различных частях лактонного кольца, с бислойными мембранами можно установить взаимосвязь между химическим строением и биологическими свойствами молекул ПА. Исследованные антибиотики по-разному эффективны в увеличении проводимости мембран. Разрыв двойных связей и лактонного кольца, а также потеря положительного заряда в молекулах антибиотиков
резко снижает их эффект. Показано, что мембраны в присутствии нистатина, амфотерицина В и микогеп-тина избирательно проницаемы для одновалентных анионов. Однако при исследовании ароматических антибиотиков было обнаружено, что леворин А2, трихомицин и кандицидин, которые также содержат аминосахар, вызывают избирательную проницаемость не для анионов, а для катионов щелочных металлов. Эти антибиотики отличаются от нистатина, амфотерицина В и микогептина наличием в молекулах дополнительной ароматической группировки
- р-аминоацетофенона, в которой содержится положительно заряженный азот. С нашей точки зрения, избирательная проницаемость для катионов связана не с образованием в мембранах, содержащих холестерин, отрицательно заряженных пор, а с переносом катионов через границу мембраны комплексом «ион - антибиотик - холестерин». Исследования зависимости проводимости мембран от концентрации ароматических антибиотиков и холестерина привели к предположению о наличии в мембранах многомолекулярных комплексов антибиотик - холестерин, индуцирующих ионную проницаемость (Касумов Х.М., Либерман Е.А., 1973).
Было обнаружено, что леворин, трихомицин и кандицидин, в отличие от неароматических антибиотиков, резко понижают сопротивление мембран из фосфолипидов мозга в том случае, если они вводятся в водный раствор с одной стороны мембраны. Проводимость при этом только в 50-100 раз ниже, чем в случае, когда антибиотики в одинаковых концентрациях находятся с обеих сторон мембраны. Предполагалось, что такое отличие от неароматических антибиотиков нистатина и амфотерицина В было связано с менее крутой зависимостью проводимости от концентрации антибиотиков с ароматической группой и с лучшей проницаемостью мембран для этих антибиотиков. Мембраны, в составе которых имеются молекулы стерина с Зр-ОН группой и неповрежденным циклопентанфенантреновым кольцом, обладают высокой чувствительностью к ароматическим и неароматическим антибиотикам. Одной из основных предпосылок, позволившей приблизиться к пониманию молекулярного механизма действия полиенов на бислой, было обнаружение повышения проницаемости БАМ в присутствии амфотерицина В и нистатина для воды и неэлектролитов (Но1/ К.ХХ', БткеЫет А., 1970).
Оказалось, что проницаемость БАМ для воды и неэлектролитов возрастает пропорционально электрической проводимости мембран, независимо от крутизны зависимости проводимости от концентрации антибиотиков. Это позволило предположить, что ионы и неэлектролиты проходят через одни и те же участки в присутствии амфотерицина В и нистатина. Проницаемость для неэлектролитов (мочевины, этиленгликоля, глицерина, глюкозы) уменьшалась с размером проникающей молекулы. Глицерин проникает примерно в 100 раз хуже, чем вода. Глюкоза с
размером молекулы около 0,8 нм проникает слабее. На основании этих данных можно сделать вывод, что амфотерицин В и нистатин образуют в липидной мембране с холестерином поры, проницаемые для одновалентных ионов, воды и неэлектролитов, у которых размер поры меньше 0,8 нм.
Одной из фундаментальных задач при изучении функционирования ионных каналов в клеточных и модельных мембранах является исследование механизма их сборки и разборки. Решение этой задачи представляется возможным при изучении свойств одиночных ионных каналов и кинетики интегральной проводимости БАМ в присутствии каналообразующих соединений с известной структурой молекул. Исследуя свойства одиночных каналов и кинетику интегральной проводимости мембран в присутствии ПА, можно выяснить механизм молекулярной перестройки канального комплекса за время его существования в мембране.
Каналы, формируемые в мембранах полиенами, представляют собой молекулярную структуру, которая состоит из нескольких молекул антибиотика и стерина. Исходя из химической структуры ПА, очевидно, что молекулы антибиотиков, попадая в водную фазу, стремятся занять энергетически выгодное состояние и образуют комплексы с минимумом свободной энергией. Причем эти комплексы формируются таким образом, что гидрофильные цепи молекул обращены в водную фазу, а гидрофобные цепи молекул разворачиваются внутрь молекулярного комплекса. В такой форме комплексы диффундируют к мембране и при взаимодействии с ней выворачиваются наизнанку, входят в мембрану и образуют канал, во внутренней полости которого оказываются гидрофильные цепи молекул. В то же самое время гидрофобные цепи, взаимодействуя с молекулами холестерина, обращаются в сторону липидной фазы. В мономолекулярной форме полиены не способны формировать проводящие для ионов и субстратов каналы в мембранах [5].
«Стериновая гипотеза» и ионные каналы
Данные о действии амфотерицина В и нистатина с одной и с двух сторон мембран позволили Кассу и Финкельштейну, а позже Касумову и Либерману, выдвинуть предположение о том, что эти антибиотики, взаимодействуя с холестерином, образуют на обеих сторонах мембраны полупоры определенного размера. Две полупоры, располагаясь вдоль их общей оси поперек мембраны, могут образовывать водную пору («трубу»), которая пронизывает мембрану насквозь. Такая пора может индуцировать в мембранах проницаемость для воды, ионов и неэлектролитов. Уменьшение проницаемости для неэлектролитов с возрастающим размером молекул и резкое уменьшение проницаемости для сахарозы, по-видимому, говорит тот факт, что эффективный радиус водной поры составляет ~ 4А. Поры, образованные в мембране полиенами, обладают определенной стабиль-
ностью во времени, в связи с чем, например, при отмывании антибиотика из раствора, окружающего мембрану, ее проводимость уменьшается в два раза за 2 ч для амфотерицина В и за 20 мин - для нистатина при 25 °С. Время полуспада проводимости резко уменьшается при увеличении температуры в присутствии нистатина.
Финкельштейн, Хольц (1973), Андреоли (1974) и Де Круифф (1974), основываясь на экспериментальных данных и независимо друг от друга, разработали гипотетическую молекулярную модель такой поры-канала, которая образуется в бимолекулярной мембране в результате взаимодействия ПА с холестерином. Молекулы амфотерицина В и фосфолипида имеют приблизительно одинаковую длину (около 24 А). Общая длина молекулы холестерина составляет 19 А. Молекулы амфотерицина В, взаимодействуя со стеринами, также могут располагаться параллельно «жирным хвостам» липидов. Можно предположить, что для образования полупоры необходимо взаимодействие равных количеств молекул амфотерицина В и холестерина (стехиометрия такова, что одна молекула амфотерицина В может взаимодействовать с одной молекулой холестерина). Заряженные аминная и карбоксильная группы в молекулах амфотерицина В располагаются на мембрано-водной поверхности. Из предложенной модели следует, что гидрофобная сторона молекулы амфотерицина В связывается с холестерином и образует комплекс амфотерицин В - холестерин, а гидроксильные группы в сегменте СГС15 выстилают водную пору внутри мембраны. Гидроксильная группа в молекуле амфотерицина В при положении углеродного атома С15 располагается у входа в пору. Гидроксильная группа при С35 взаимодействует с соответствующей гидроксильной группой молекулы амфотерицина В, расположенного с противоположной стороны мембраны (Рис.1). Поскольку амфотерицин В, нистатин и микогептин эффективны при наличии их только с двух сторон мембраны, то очевидно, что такие симметричные структуры могут образовывать полную проводящую пору-канал в мембране.
Наиболее упакованной структурой в этом случае является полый цилиндр (полупора), состоящая из 8 молекул амфотерицина В и 8 молекул холестерина. Молекула холестерина связывается с двумя молекулами антибиотика. Радиальный угол сегмента амфотерицин В -холестерин составляет 23°, а радиальный угол между двумя молекулами амфотерицина В (амфотерицин В - холестерин - амфотерицин В) составляет 45°. Полупора с каждой стороны мембраны образуется из 8 молекул амфотерицина В и 8 молекул холестерина. Образование поры-канала в такой стехиометрии приводит к тому, что все гидрофильные стороны молекул амфотерицина В располагаются внутри поры. Данная структура имеет внутренний диаметр 8 А. Две такие полупоры собираются по разные стороны мембраны. Гидроксильные группы при С35 одной полупоры образуют водородные свя-
Э І» [ ш Ц - г льн і 1И о р 11
зи с соответствующими группами другой полупоры, формируя полную проводящую пору через всю гидрофобную часть мембраны.
амфотернцон В \
а
ПОРА
фосфолипид
с
20
гептаенов&я
' 23 ДСІШЧКЕІ
холестерин
б
Г 7
Рис.1. Взаимодействие амфотерицина В с холестерином. Схематическая модель полупоры: а - поперечный срез комплекса (полупоры) амфотерицин В - холестерин [АпсІгеоІІ, 1973,1974], б - стехиометрия и расположение молекул амфотерицина В с холестерином в комплексе.
А - антибиотик; С - стерин [Ое Кгиуґґ, ОетеІ, 1974]
Видимо, такая проводящая структура пора-канал может индуцировать в мембранах проницаемость для воды, ионов и неэлектролитов. Аналогичная пора может быть сконструирована и для других ПА: нистатина, микогептина, этрускомицина, филипина, леворина А2.
Молекулярная модель канала была предложена, исходя из структуры молекулы и данных по проницаемости и интегральной проводимости мембран в присутствии ПА.
В настоящее время общеизвестно, что стерины
- важные структурные компоненты клеточных мембран.
Биологическая роль стеринов в клеточных мембранах не совсем ясна. Предполагают, что стерины могут играть роль опорных элементов в цитоплазматической мембране (Ьашреп, 1966). Поэтому дальнейшие исследования были связаны с изучением взаимодействия ПА со стеринами, содержащимися в клеточных мембранах.
Способность взаимодействовать с полиенами характерна для целого ряда стеринов. Поэтому согласно «стериновой гипотезе», объясняющей специфичность токсического действия полиенов, можно предположить, что и другие микроорганизмы, которые содержат стерины, должны быть чувствительными к действию ПА.
Практическое значение ПА
Использование ПА в медицинской практике базируется на детальном изучении молекулярнобиологических механизмов их взаимодействия с клеткой. Установлено, что ПА обладают мембра-нотропным действием и взаимодействуют со стеринами, связанными с цитоплазматическими мембранами клеток, образуя в них поры (каналы), через которые клетки начинают терять жизненно важные метаболиты, что приводит их к гибели. Более того, Г1А взаимодействуют со свободными стеринами, находящимися в крови, биологических жидкостях и тканях, образуя гидрофильные высокомолекулярные комплексы, быстро выводящие холестерин из организма.
В последние годы было выяснено, что антибиотики полиеновой структуры обладают еще одним очень важным свойством - инактивировать некоторые инфекционные и онкогенные вирусы, препятствовать проникновению их в клетку и ингибировать их репродукцию. Более того, водорастворимые производные амфотерицина В, леворина и микогептина, при совместном введении с инактивированными противовирусными вакцинами, способны стимулировать специфический иммуногенез [1].
Однако следует отметить, что токсичность ПА для организма человека резко ограничивает их применение и требует создания новых лекарственных форм. В результате исследований, проводимых в указанном направлении, можно получить лечебные препараты со значительно улучшенными фармакологическими свойствами и эффективно использовать их в борьбе с грибковыми, гнойными и вирусными инфекциями, а также со злокачественными и доброкачественными образованиями. Эти исследования в дальнейшем будут способствовать расширению сферы использования новых ПА в лечебных целях.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Несмотря на то, что ПА, хотя и были обнаружены более 50 лет тому назад, и сегодня остаются одними из самых эффективных соединений в борьбе с грибковыми инфекциями. Исследуя свойства одиночных ионных каналов на бислойных мембранах в присутствии ПА, удается внести вклад в установление связи между структурой и функцией молекул полиенов и тем самым конкретизировать пути подходов к целенаправленному синтезу новых производных с заданными свойствами. Для многих ПА установлена химическая структура, разработаны методы направленной химической модификации молекул и синтезирован широкий спектр их производных. Исследование действия ПА на бислои позволяет установить взаимосвязь между структурой молекул ПА и свойств, образуемых ими ионных каналов, и расшифровать механизм их функционирования, а также способствовать созданию теоретической основы для получения новых соединений с определенными антимикробными свойствами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Zotchev S.B. Polyene macrolide antibiotics and their applications in human therapy // Curr. Med. Chem. - 2003. - Vol.10.-P. 211-223.
2. Ostrosky-Zeichner L., Bazemore S., Paetznick V.L., et al. Differential antifungal activity of isomeric forms of nystatin // Antimicrob. Agents Chemother. - 2001. - Vol.45. - P. 2781-2786.
3. Volpon L., Lancelin J. Solution NMR structure of five representative glycosylated polyene macrolide antibiotics with a sterol-dependent antifungal activity // Eur. J. Biochem. - 2002. - Vol.269.- P.4533-4541.
4. Курбанов О.Г., Касумов X.M. Гептаеновый ароматический антибиотик леворин и его производные при мышечной деятельности //Антибиотики и химиотерапия. - 2004. - Т. 49. - С. 40-46.
5. Kasumov Kh., Bolard J. Transient permeability induced by cationic derivatives of amphotericin В in lipid Membranes // Pol. J. Chem. - 2004. - Vol.78.- P.1057-1065.
Поступила в редакцию журнала 02.04.10
Рецензент: Г.А. Бабенко
