CC BY
65
УДК 618.2+618.3-06+577.1+577.2
В.О. Гунько, Т.Н. Погорелова, В.А. Линде
ПРОТЕОМНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ОКОЛОПЛОДНЫХ ВОД -НОВЫЙ ПОДХОД К ПОИСКУ МАРКЕРОВ ЗАДЕРЖКИ РОСТА ПЛОДА
Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии, отдел медико-биологических проблем в акушерстве, гинекологии и педиатрии
Цель: провести протеомный анализ околоплодных вод при физиологической беременности и задержке роста плода (ЗРП).
Материалы и методы: обследованы 64 женщины, из которых 40 — с физиологической беременностью и 24 — с ЗРП. Анализ проводили с использованием высокоразрешающего двумерного электрофореза и вре-мяпролетной масс-спектрометрии.
Результаты: проведенные исследования позволили обнаружить при ЗРП отсутствие 6 белков в околоплодных водах во II и III триместрах беременности: белка-1, связывающего инсулиноподобный фактор роста (ИПФРСБ-1), эпидермального белка, связывающего жирные кислоты, ретинол-связывающего белка 4, плацентарного лактогена, гаптоглобина и пероксиредоксина-2. В то же время установлено появление 5 белков, отсутствующих при нормальной беременности: цинк-а-2-гликопротеина, ß-цепи фибриногена, фрагмента ИПФРСБ-1, CDC37-подобного белок и NKG2D лиганда 2. Проведена количественная оценка цинк-а-2-гликопротеина методом ИФА.
Заключение: установленные отличия в протеомном спектре околоплодных вод, очевидно, имеют патогенетическое значение в формировании ЗРП. Цинк-а-2-гликопротеин предложен в качестве маркера ЗРП.
Ключевые слова: протеомный анализ, околоплодные воды, задержка роста плода, цинк-а-2-гликопротеин.
V.O. Gunko, T.N. Pogorelova, V.A. Linde
PROTEOMIC STUDIES OF AMNIOTIC FLUID - NEW APPROACH TO SEARCH OF MARKERS OF FETAL GROWTH RETARDATION
Rostov Scientific-Research Institute of Obstetrics and Pediatrics, Department of Medical and Biological Problems in Obstetrics, Gynecology and Pediatrics
Purpose: to carry out the proteomic analysis of amniotic fluid in physiological pregnancy and fetal growth retardation (FGR).
Materials and methods: we examined 64 women, of which 40 are with physiological pregnancy and 24 -FGR. Analysis was performed using a high-resolution two-dimensional electrophoresis and time-of-flight mass spectrometry.
Results: the conducted researches allowed finding at FGR lack of 6 of protein in the amniotic fluid in II and III trimesters of pregnancy: insulin-like growth factor-binding protein-1 (lGFBP-1), epidermal fatty acid-binding protein, retinol-binding protein 4, placental lactogen, haptoglobin and peroxiredoxin-2. At the same time is the emergence of 5 proteins, which are absent at normal pregnancy is established: zinc-a-2-glycoprotein, p chain of fibrinogen, fragments of IGFBP-1, CDC37-like protein and NKG2D ligand 2. The quantitative assessment zinc-a-2-glycoprotein is carried out by ELISA method.
Summary: the existing differences in proteomic spectrum of amniotic fluid, obviously, have pathogenetic importance in the formation of FGR. Zinc-a-2-glycoprotein proposed as a marker of FGR.
Keywords: proteomic analysis, amniotic fluid, fetal growth retardation, zinc-a-2-glycoprotein.
Введение
Физиологическое развитие беременности и внутриутробного плода во многом обеспечивается поддержанием метаболического гомеостаза в системе мать-плацента-околоплодная среда-плод. Важным фактором формирования осложненной беременности является модификация состава и свойств белков различных звеньев этой системы, в том числе и околоплодных вод, которым принадлежит немаловажное значение в ее функционировании [1]. Динамика протеомного спектра околоплодных вод при патологической беременности является следствием реакции на негативные воздействия во время ее течения, что выражается в модификации экспрессии генов на транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях, а также в изменении секреции и активности разнообразных белков. Все эти процессы предопределяют возникновение метаболического дисбаланса в организмах матери и плода.
Значительные успехи молекулярной биологии и медицины, достигнутые с использованием современных высокотехнологичных подходов геномики и сформировавшейся в последние годы на ее основе протеомики, оценивающей совокупность белков, позволили по-новому взглянуть на причины возникновения различных патологических состояний организма, в том числе и осложненной гестации.
Одной из ведущих причин, приводящих к прена-тальной патологии, является задержка роста плода (ЗРП), молекулярные механизмы развития которой до настоящего времени остаются недостаточно изученными. В то же время исследования, использующие протеомный анализ околоплодных вод для изучения дисбаланса дифференциально-экспресси-рующихся белков при ЗРП, весьма малочисленны и противоречивы [2], что ограничивает возможности своевременного прогнозирования данной патологии и проведения научно-обоснованных терапевтических мероприятий.
Цель настоящей работы - протеомный анализ околоплодных вод в разные сроки физиологической беременности и беременности, осложненной ЗРП.
Материалы и методы
В проспективное исследование были включены 64 беременных в возрасте 23-33 лет (средний возраст 25,7+0,4 года), давших информированное согласие на расширенный алгоритм обследования. Контрольную группу составили 40 практически здоровых женщин с неосложненным течением беременности, закончившейся своевременными родами. Основную группу составили 24 женщины, беременность которых осложнилась ассиметрич-ной формой ЗРП на фоне субкомпенсированной плацентарной недостаточности.
Материалом для исследования служили околоплодные воды, полученные во II триместре (2324 недели) путем трансабдоминального амниоцен-теза по медицинским показаниям и при вскрытии плодного пузыря в I периоде родов (39-40 недель).
Фракционирование белков проводили методом двумерного электрофореза (2Д-ЭФ) в полиакри-ламидном геле [3]. Первое направление 2Д-ЭФ — изоэлектрофокусирование - осуществляли с использованием иммобилиновых стрипов с градиентом рН=3-10 (Ready Strip IPG Strips, «Bio-Rad», США) на приборе Protein IEF Cell («Bio-Rad», США). Второе направление электрофореза (вертикальный ДДС-№-электрофорез в градиенте ПААГ 8-16%) проводили в камере Protean II xi Multi-Cell («Bio-Rad», США) при силе тока 10 mA на гель в течение 18 часов.
Для визуализации белковых пятен в гелях (после завершения 2-го направления 2Д-ЭФ), электро-фореграммы окрашивали азотнокислым серебром с предварительной обработкой тиосульфатом и сканировали. Полученные материалы анализировали с использованием пакета программ PDQuest («BioRad», США). После вырезания белкового пятна из геля и процедуры трипсинолиза идентификацию белков проводили методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии [4]. Масс-спектры триптических пептидов получали на масс-спектрометре Autoflex II («Bruker Daltonics», Германия) и анализировали с использованием опции Peptide Fingerprint программы Mascot MS Search (Matrix Science, США) и баз данных NCBI и Swiss-Prot, принимая точность определения массы ионов равной 0,01%. Результаты идентификации белков принимались как достоверные при уровне значимости не менее 95% и показателе сиквенс-покрытия не менее 60%. Сравнительный анализ протеомных карт осуществляли по виртуальным интегрированным «мастер-гелям» двумерных электрофореграмм амниотической жидкости (программа PDQuest, «Bio-Rad», США).
Содержание цинк-а-2-гликопротеина в околоплодных водах оценивали методом иммуно-ферментного анализа, используя наборы фирмы «BioVendor» (Чехия) на микропланшетном фотометре Sunrise («Tecan», Швейцария). Определение содержания цинка в околоплодных водах проводили с помощью набора реагентов «Цинк-Витал» фирмы «Витал Девелопмент Корпорэйшн» (Россия) на спектрофотометре UV-Visible Spectrophotometer Evolution 300 (США).
Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0. фирмы StatSoft. Inc.). Для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми группами использовали критерий Стьюдента (t-критерий) и c c2 - критерий (для таблиц 2х2 — в точном решении Фишера). Достоверными считались различия при p<0,05.
Результаты и обсуждение
При сравнительном анализе протеомного профиля околоплодных вод женщин с физиологической беременностью и осложненной ЗРП выявлено отсутствие при данной акушерской патологии шести белков (независимо от срока гестации) относительно нормального спектра (с Mm в диапазоне от 14 до 32 кДа и pI от 5,3 до 6,5): эпидермального
белка, связывающего жирные кислоты, ретинол-связывающего белка 4, плацентарного лактогена, белка-1, связывающего инсулиноподобны фактор роста (ИПФР), гаптоглобина и пероксиредокси-на-2 (табл.1).
Оценив основные функции этих белков и источники их поступления в околоплодные воды, можно составить определенное представление о последствиях их отсутствия или весьма низкого количества для развивающего плода.
Таблица 1
Белки околоплодных вод, идентифицированные при физиологической беременности
и ЗРП
№ Название белка № в базе Swiss-Prot Mm, кДа pI Физ. берем. ЗРП
триместр
II III II III
1 Serotransferrin P02787 77 6,24 + + + +
2 Serum albumin P02768 69,3 5,9 + + + +
3 Alpha-1-antitrypsin P01009 46,7 5,3 + + + +
4 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain P04233 32,3 6,83 + + + +
5 Carbonyl reductase [NADPH] 3 O75828 32,3 5,57 + + + +
6 Collagen alpha-l(II) chain fragment P02458 31,7 6,40 + + + +
7 Apolipoprotein A-I P02647 30,8 5,5 + + + +
8 Hemoglobin subunit beta P68871 15,9 6,9 + + + +
9 Zinc-a-2-glycoprotein P25311 33,3 6,02 - - + * + *
10 NKG2D ligand 2 Q9BZM5 31,9 6,03 - - + * + *
11 Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor P02760 31,9 5,93 - - + * -
12 Fibrinogen beta chain P02675 31,8 7,6 - - + * + *
13 Insulin-like growth factor-binding protein-1(IGFBP-1) P08833 29,7 5,75 + +
14 Peroxiredoxin-2 P32119 28,9 5,3 + +
15 Placental lactogen P01243 28,0 5,74 + +
16 Plasma retinol-binding protein 4 P02753 25,8 6,5 + +
17 CDC37-like protein LOC390688 O75198 21,9 5,93 - - + * + *
18 Hippocalcin-like protein 1 P37235 21,5 6,15 - - + * -
19 Haptoglobin P00738 18,6 5,84 + +
20 Transthyretin P02766 17 5,38 - +
21 Fatty acid-binding protein epidermal Q01469 14,7 6,18 + +
22 Protein S100-A9 (calgranulin В) P06702 13,2 5,2 - +
23 Protein S100-A8 (calgranulin А) P05109 12,9 6,61 - +
24 IGFBP-1 fragments P08833 16,0 5,93 - - + * + *
Примечание: * - появление или отсутствие белков при ЗРП относительно физиологической беременности статистически значимо (р<0,001); р1 - изоэлектрическая точка, Мт-молекулярная масса, «+» - присутствие белка, «-» - отсутствие белка.
Идентифицированный нами функционально важный эпидермальный белок, связывающий жирные кислоты (fatty acid-binding protein epidermal, E-FABP) относится к семейству цитозольных белков, осуществляющих транспорт жирных кислот (ЖК), а также ретиноидов и эйкозаноидов. Помимо регуляции уровня ЖК, E-FABP вовлечен в ЖК-опосредованные процессы, такие как контроль клеточного роста, сигнализация и регуляция экспрессии генов. E-FABP доставляет липофильные молекулы прямо к ядерному рецептору PPARp/5, что способствует увеличению активности последнего, являющегося регулятором транскрипции многих генов, вовлеченных в метаболизм липидов, рост и выживаемость клеток. Продукция E-FABP обнаружена в амниотическом эпителии пуповины, фетальных микрососудах и плаценте, в которой происходит синтез и оксиление ЖК [5].
Отсутствие в околоплодных водах E-FABP, поступающего в основном из плаценты и участвующего в депонировании и освобождении ЖК, может способствовать нарушению трофики плода, что является основным патогенетическим звеном развития ЗРП.
Отсутствующий при ЗРП белок-1, связывающий ИПФР (ИПФРСБ-1, insulin-like growth factor-binding protein-1), специфически связывает и модулирует биологическую активность ИПФР I и II, как стимулируя, так и ингибируя их эффекты. ИПФР и связывающие их белки являются ключевыми регуляторами роста и развития плода, оказывая влияние на клеточную пролиферацию, дифференци-ровку, миграцию.
В гестационных тканях ИПФРСБ-1 синтезируется в основном децидуальной оболочкой, а также печенью и почками плода. Этот белок секретиру-ется преимущественно в околоплодные воды и в меньшей степени в кровь. Его уровень в околоплодных водах определяется темпами синтеза в децидуализированном эндометрии и диффузией через амнион и хорион, которые являются полупроницаемыми и ограничивают его прохождение в амниотическую полость. При физиологической беременности концентрация ИПФРСБ-1 в амниоти-ческой жидкости постепенно возрастает, достигая максимума к 18-21-й недели гестации, после чего до 32-й недели снижается, а впоследствии вновь начинает повышаться, коррелируя с уровнями ИПФР I и II. Концентрация ИПФРСБ-1 в амниотической жидкости на 3 порядка больше, чем в материнской сыворотке. Значительное снижение уровня ИПФР в амниотической жидкости было обнаружено при рождении детей с малым весом [6].
Уменьшение содержания ИПФРСБ-1 в околоплодных водах при ЗРП, очевидно, объясняется усилением протеолиза под действием децидуаль-ных матриксных металлопротеиназ, о чем свидетельствует обнаруженное нами появление в этой биологической жидкости фрагментов ИПФРСБ-1 с молекулярной массой 16 кДа. Протеолиз ИПФРСБ-1 представляет собой механизм, направленный на увеличение биодоступности ИПФР, что носит компенсаторный характер в условиях развития данной патологии.
Плацентарный лактоген (ПЛ, placental lactogen) является гормоном гликопротеиновой природы, синтезируемым плацентой, децидуальной оболочкой и амнионом. Основная его часть (90%) поступает в материнский кровоток, только 10% - в амниотическую жидкость и к плоду. Известно, что низкий в начале беременности уровень ПЛ в околоплодных водах (в 8-10 раз ниже, чем в крови матери) постепенно повышается прямо пропорционально сроку гестации. Основной функцией ПЛ является обеспечение трофики и роста плода. Он стимулирует синтез ИПФР-1, что, по-видимому, является одним из наиболее важных механизмов соматотропного действия ПЛ на плод [7].
Обнаруженное нами нарушение секреции ПЛ в амниотическую жидкость, являющуюся взаимосвязующим звеном в гормональном обмене между организмами матери и плода, может расцениваться как показатель неблагополучия плода.
Гаптоглобин (haptoglobin) — тетрамерный се-кретируемый гликопротеин, который связывает с высокой аффинностью гемоглобин, поддерживая тем самым резерв железа и защищая клетки от окислительного повреждения. Кроме сыворотки крови матери, где его уровень растет, имея два пика во II и III триместрах беременности, гаптоглобин обнаруживается в плаценте, децидуальной оболочке и околоплодных водах. Гаптоглобин обладает иммуносупрессивными свойствами, а также может взаимодействовать с децидуальными NK-клетками. Следовательно, этот белок может участвовать в иммунных механизмах, необходимых для пролонгирования беременности [8].
Важные регуляторные функции гаптоглобина позволяют полагать, что его отсутствие в околоплодных водах при ЗРП, отражающее метаболические нарушения в биологической системе мать-плацента-плод, имеет большое значение в механизмах развития рассматриваемой патологии.
Еще один белок, не обнаруживающийся в околоплодных водах при ЗРП, - пероксиредоксин-2 (peroxiredoxin-2) — цитоплазматический и ядерный белок, принадлежащий к семейству перокси-даз, использующий в качестве донора электронов тиоредоксин. Пероксиредоксин-2 модулирует активность транскрипционных факторов (таких как NF-kB, Nrf2, АР-1), процессы пролиферации и апоптоза клеток, участвует в различных сигнальных каскадах и обладает шаперонной активностью, он также вовлечен в процессы репарации ДНК. Нарушение синтеза пероксиредоксина-2 приводит к усилению окислительных процессов, блокирует клеточный цикл и ингибирует активность транскрипционного фактора NF-kB вследствие накопления перекиси водорода [9].
Можно полагать, что снижение продукции этого антиоксиданта вносит определенный вклад в усиление внутриутробной гипоксии и развитие окислительного стресса, имеющих место при ЗРП.
Идентифицированный нами ретинол-связы-вающий белок 4 (РСБ4, retinol-binding protein 4) является низкомолекулярным липокалином, специфически связывающим три физиологически важ-
ных ретиноида (ретинол, ретиналь и ретиноевую кислоту) и осуществляющим свою транспортную функцию в тесном взаимодействии с транстирети-ном. РСБ4 недавно был отнесен к семейству ади-покинов. Он усиливает глюконеогенез в печени за счет увеличения экспрессии фосфоенолпируват-карбоксикиназы. РСБ4 был обнаружен в плаценте, децидуальной оболочке и околоплодных водах при нормальной беременности, где его уровень коррелирует с концентрацией ретинола [10]. РСБ, присутствующий в амниотической жидкости и кровотоке плода, может быть как плацентарного, так и материнского происхождения.
Синтез и секреция РСБ регулируются ретинолом, при дефиците которого секреция РСБ блокируется. Очевидно, обнаруженное нами отсутствие данного белка при ЗРП связано прежде всего с недостатком ретинола, который необходим для нормального развития плода и благополучия беременности.
По мере течения гестации изменения в про-теомном спектре околоплодных вод в целом сохраняются, хотя к моменту родов появляются определенные отличия (табл.1). В амниотической жидкости, взятой в III триместре беременности при ЗРП, количество отсутствующих белков относительно белкового спектра при физиологической беременности превышает таковое во II триместре. Кроме вышеуказанных белков отличия, к их числу относятся: транстиретин, кальгранулины А и B.
Отсутствие в околоплодных водах транстире-тина (transthyretin, тироксин-связывающий пре-альбумин) в конце беременности, осложненной ЗРП, имеет немаловажное значение, особенно на фоне однонаправленной динамики с РСБ4 в этом же периоде, еще в большей степени усиливая метаболические нарушения, связанные с дефицитом транспортирующих ретинол белков. Транстиретин обеспечивает также транспорт тиреоидных гормонов, которые играют важную роль в обеспечении нормального роста и развития плода, дифференциации его органов и тканей, особенно ЦНС, регуляции метаболических процессов, формировании адаптивных реакций. Изменение продукции этого белка, которое может происходить на фоне нарушенного плодово-плацентарного кровообращения и хронической гипоксии, в значительной степени влияет на процессы полноценного функционального созревания гипоталомо-гипофизарно-тирео-идной системы плода, обусловливая развитие ЗРП [11].
Кальгранулины А и В (calgranulin A and B), относящиеся к кальций- и цинк-связывающим белкам, участвуют в процессах пролиферации и дифферен-цировки, а также в регуляции каскада арахидоно-вой кислоты, являющейся исходным субстратом для синтеза простагландинов [12]. Комплекс каль-гранулинов А и В (кальпротектин) может служить промежуточным внутриклеточным резервуаром для арахидоновой кислоты, модулируя, таким образом, активность ферментов, вовлеченных в ее метаболизм. Отсутствие этих белков в околоплодных водах, связанное, очевидно, с нарушением их секреции, может приводить к дисфункции сокра-
тительнои деятельности матки, которая нередко встречается при ЗРП.
Не менее значимую роль играют и белки, продукция которых отсутствует при нормальной гестации. Как показали наши исследования, в протеомном спектре околоплодных вод во II и III триместрах беременности, осложнившейся ЗРП (независимо от срока гестации), выявлено появление пяти белков отличия (с молекулярными массами в диапазоне от 22 до 34 кДа и изоэлектрическими точками от 5,8 до 7,6), из которых идентифицировано четыре: CDC37-подобный белок и NKG2D лиганд 2, ß-цепь фибриногена, фрагмент ИПФРСБ-1, цинк-a-2-гликопротеин.
CDC37-подобный белок (CDC37-like protein) — цитоплазматический мономерный фосфопроте-ин, являющийся молекулярным ко-шапероном для Hsp90. CDC37-подобный белок способствует ассоциации и пролонгированию взаимодействия между Hsp90 и его белками-клиентами — проте-инкиназами, вовлеченными в различные клеточные процессы, включая синтез белка и ДНК, регуляцию клеточного цикла, сигнальную трансдукцию. Гиперпродукция CDC37-подобного белка индуцирует экспрессию циклин-зависимой киназы 4, усиливая процессы пролиферации, в то время как подавление его экспрессии приводит к подавлению роста и апоптозу [13].
Появление CDC37-подобного белка в околоплодных водах женщин с ЗРП принимая во внимание его функции, по-видимому, можно рассматривать как компенсаторный процесс, направленный на поддержание стабильности, корректного фол-динга и сигнальных функций различных протеин-киназ в условиях окислительного стресса, характерного для ЗРП.
Не обнаруженный в околоплодных водах при физиологической беременности и появляющийся в них при ЗРП гликопротеин NKG2D лиганд 2 (NKG2D ligand 2) является членом суперсемейства I класса главного комплекса гистосовмести-мости. Этот белок служит лигандом для NKG2D-рецепторов, активирующих NK-клетки. Продукция NKG2D лиганда 2 индуцируется в ответ на стрессовые воздействия, такие как повреждения ДНК, гипоксия, ацидоз, тепловой шок, воспаление. Экспрессия NKG2D лиганда 2 на клеточной поверхности синцитиотрофобласта является потенциальной угрозой для жизнедеятельности плода. Было показано, что NKG2D лиганд 2 может высвобождаться из мембран трофобласта под действием металло-протеаз через экзосомы, в результате чего происходит образование растворимой биологически активной формы этого лиганда [14].
Появление стресс-индуцируемого NKG2D ли-ганда 2 в околоплодных водах, по-видимому, в результате экзосомной секреции плацентой, является иммуносупрессивным механизмом, обеспечивающим выживание плода в неблагоприятных условиях.
Обнаруженный в амниотической жидкости при ЗРП цинк-а-2-гликопротеин (zinc-а -2-glycopro-tein) участвует в регуляции многих важных клеточных процессов. Этот секретируемый гликопроте-
ин, так же как и предыдущий белок, относится к семейству 1 класса главного комплекса гистосов-местимости. Являясь адипокином, он действует как липид-мобилизующий фактор, стимулирует липолиз и снижает продукцию ферментов липоге-неза. Цинк-а-2-гликопротеин способен непосредственно влиять на экспрессию митохондриальных разобщающих белков, которые вовлечены в регуляцию энергетического баланса. Кроме того, цинк-a-2-гликопротеин ингибирует циклин-зависимую киназу 2, отвечающую за прохождение стадии, лимитирующей скорость клеточного цикла (G2-M переход), тем самым, подавляя пролиферацию. Цинк-а-2-гликопротеин непосредственно участвует в регуляции массы тела, причем известно, что гиперпродукция этого белка приводит к снижению веса и даже к кахексии. Цинк-а-2-гликопротеин синтезируется эпителиальными клетками и секре-тируется в различные жидкости организма, в том числе и амниотическую, где его концентрация составляет 1/10 от концентрации в сыворотке крови матери. Причем уровень этого белка в околоплодных водах и в сыворотке крови плода увеличивается в процессе развития беременности, достигая наиболее высоких значений в конце второго триместра [15].
Усиление продукции и, как следствие, секреции в околоплодные воды при ЗРП этого белка, в значительной степени ответственного за регуляцию массы тела, очевидно, играет важную роль в механизмах развития данной патологии. По-видимому, и другие, регулируемые им реакции, вносят определенный вклад в изменение метаболических и функциональных процессов при ЗРП в отличие от таковых при физиологически протекающей беременности.
Помимо вышеуказанных дополнительных белков, выявлено еще два белка, появляющихся в околоплодных водах в 23-24 недели беременности, осложненной ЗРП: гипокальцин-подобный белок 1 и белок-предшественник альфа-1-микроглобулина и бикунина. В 39-40 недель при данной акушерской патологии они отсутствуют.
Гипокальцин-подобный белок 1 (hippocalcin-like protein 1) — кальций-связывающий белок, относящийся к семейству нейрональных кальциевых сенсоров. Он влияет на нейрональную дифферен-цировку и сигнализацию, а также выполняет роль нейропротектора, ингибируя апоптоз. Гипокаль-цин-подобный белок 1 модулирует проницаемость ионных каналов и регулирует многие клеточные процессы: экспрессию генов, дифференцировку, апоптоз. В отличие от гипокальцина, который экс-прессируется только в мозге, гипокальцин-подоб-ный белок 1 помимо нейронов, обнаруживается в различных типах клеток. Продукция этого белка увеличивается в течение эмбрионального развития, что отражает его важные функции в формировании органов [16].
Усиление продукции гипокальцин-подобного белка 1, особенно в условиях внутриутробной гипоксии, способствует защите нейронов от кальций-индуцированого апоптоза, что имеет большое значение во II триместре гестации, в течение которого
продолжается интенсивное развитие головного мозга плода. В течение беременности необходимость в нейропротекторной функции гипокальцин-подобного белка 1 снижается в связи с тем, что к концу внутриутробного периода в основном заканчивается формирование важнейших отделов центральной и периферической нервной системы плода (хотя их функциональная зрелость достигается после рождения), которые становятся менее уязвимыми для действия повреждающих факторов.
Второй белок, отсутствующий при физиологически протекающей гестации и обнаруженный при ЗРП во II триместре, — предшественник альфа-1-микроглобулина/бикунина (alpha-1-microglobulin/ bikunin precursor, AMBP) является продуктом гена, который кодирует два гликопротеина: альфа-1-микроглобулин и бикунин, образующихся из общего полипептидного предшественника [17]. Интересным представляется тот факт, что белок-предшественник альфа-1-микроглобулина и бику-нина, синтезируемый в плаценте, секретируется в околоплодные воды при ЗРП без предварительного расщепления, причины отсутствия которого не ясны. С одной стороны, это может быть связано с тем, что его протеолиз происходит уже в околоплодных водах, обеспечивая локальное образование альфа-1-микроглобулина и бикунина для выполнения их функций по мере необходимости. С другой — может отражать нарушения в механизмах пострансляционного протеолиза, в результате чего не образуются функциональные продукты. Поэтому повышение уровня белка AMBP во II триместре беременности, осложненной ЗРП, по-видимому, может играть как компенсаторную, так и патогенетическую роль.
Наряду с протеомным анализом околоплодных вод нами проведена количественная оценка методом ИФА цинк-а-2-гликопротеина, являющегося наиболее перспективным и информативным для использования в качестве маркера ЗРП.
Полученным данные (табл.2) свидетельствуют о том, что содержание цинк-а-2-гликопротеина, равное во II триместре физиологической беременности 25,05+1,2 мкг/мл, уменьшается к ее концу на 15% и составляет 21,35+1,0 мкг/мл (р<0,02). Подобная динамика характерна для этого белка и при беременности, осложненной ЗРП: в 23-24 недели его уровень составил 61,38+3,1 мкг/мл, в 3940 недель он снизился на 13% — до 53,25+2,2 мкг/ мл (р<0,02). В амниотической жидкости при ЗРП содержание цинк-а-2-гликопротеина было повышено во II и III триместрах на 53% (р<0,01) и 60% (р<0,01) соответственно по сравнению с аналогичной величиной при нормальной гестации.
Многофункциональный белок цинк-а-2-глико-протеин связывает цинк, имеющий особенно большое значение для развития плода, что обусловило проведение оценки содержания этого микроэлемента в амниотической жидкости при физиологической беременности и ЗРП. Кроме того, в литературе имеются данные о взаимосвязи недостатка цинка с уровнем ИПФРСБ-1 и дефицитом витами-
на А. Последнее может объясняться тем, что рети- плодных водах при ЗРП, является цинк-зависимым нол-связывающий белок, отсутствующий в около- белком [18].
Таблица 2
Содержание цинк-а-2-гликопротеина и цинка в околоплодных водах при физиологической
беременности и ЗРП
Течение беременности Срок беременности Показатели
Цинк-а-2-гликопротеин, мкг/мл Zn 2+, мг/мл
Физиологическая беременность II триместр (23-24 нед.) 25,05+1,2 8,36+0,51
III триместр (39-40 нед.) 21,35+1,01* 9,88+0,52*
ЗРП II триместр (23-24 нед.) 60,38+3,11*** 5,25+0,39***
III триместр (39-40 нед.) 51,25+2,21**/*** 6,16+0,42***
Достоверные отличия между: * - II и III триместрами физиологической беременности, ** - II и III триместрами беременности, осложненной ЗРП, *** - физиологической беременностью и ЗРП.
Цинк играет важную роль во всех видах обмена, включая обмен нуклеиновых кислот, белков и углеводов. Он необходим для роста и размножения клеток, функционирования иммунной системы, защиты от окислительного стресса, стабилизации мембран, участвует в биосинтезе белка, регуляции экспрессии генов, процессах апоптоза. Многообразие функций цинка объясняется тем, что он входит в состав более чем 200 цинк-содержащих протеинов, в том числе таких ферментов как супе-роксиддисмутаза, некоторые дегидрогеназы, аль-долаза, ДНК- и РНК-полимеразы, металлопроте-иназы, фосфатаза, циклическая фосфодиэстераза, щелочная фосфатаза и др. [19].
Результаты наших исследований показали, что содержание цинка в околоплодных водах возрастает по мере развития физиологической беременности (табл.2). Так, если в 23-24 недели гестации уровень Zn2+ составляет 8,36+0,51 мг/мл, то в 39-40 недель эта величина равна 9,88+0,53 мг/ мл, что на 18% выше соответствующих показателей во II триместре (р<0,05). Увеличение уровня этого микроэлемента в околоплодных водах по мере прогрессирования беременности, по нашим данным и результатам исследований других авторов, очевидно, отражает повышение потребности в нем для обеспечения процессов роста и развития плода. Следует также отметить, что концентрация цинка в крови матери в течение гестации, существенно снижается, особенно в III триместре, а в крови плода его содержание становится выше, чем в сыворотке крови матери, уже во II триместре беременности[20]. Это объясняется поглощением цинка из крови матери для передачи к плоду, которое происходит в ворсинках синцитиотрофобла-ста, где обнаружены специальные транспортеры для этого микроэлемента.
Содержание Zn2+ в околоплодных водах женщин, беременность которых осложнилась ЗРП, во II и III триместрах составляет 5,25+0,39 мг/ мл и 6,16+0,42 мг/мл соответственно. Сравнение этих данных с аналогичными при физиологической
беременности выявило снижение уровня Zn2+ во II и III триместрах в среднем на 37-38% (р<0,01), что согласуется с результатами ряда авторов, в которых показана корреляция между содержанием цинка в амниотической жидкости и ростом плода. Кроме того, уменьшение при ЗРП уровня Zn2+ наблюдается также в сыворотке крови матери и пла-центе[20].
Недостаток цинка у плода приводит к последующим нарушениям в его росте, созревании иммунной, эндокринной, центральной нервной систем, ухудшению снабжения тканей плода кислородом. Снижение содержания цинка во время гестации может привести к таким неблагоприятным последствиям для матери и ребенка, как внутриутробная смерть плода, самопроизвольный выкидыш, пороки развития, преждевременные роды, а также к нарушениям родовой деятельности. Последнее можно объяснить действием цинка на метаболизм андрогенов, эстрогенов, прогестерона и проста-гландинов, поскольку он входит в состав домена «цинковые пальцы» в ряде белков, регулирующих действие стероидных гормонов. Между уровнем цинка в околоплодных водах и содержанием цинк-a-2-гликопротеина выявлена тесная обратная пропорциональная корреляция, подтверждающая их взаимосвязь и взаимозависимость.
Выводы
Резюмируя полученные данные, можно заключить, что модификация продукции белков в фето-плацентраной системе, которая находит отражение в протеомном спектре околоплодных вод, является одним из начальных повреждений, приводящих к дальнейшим метаболическим и функциональным нарушениям в организмах матери и плода, и, как следствие, к развитию акушерской патологии. Идентифицированный с помощью масс-спектрометрии и оцененный количественно методом ИФА цинк-а-2-гликопротеин может быть рекомендован в качестве информативного маркера ЗРП.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Журнал фундаментальной медицины и биологии ЛИТЕРАТУРА
1. Погорелова Т.Н., Крукиер И.И., Линде В.А. Биохимия амни-отической жидкости. LAP LAMBERT Academic Publishing, 2012. 132 с.
2. Cecconi D., Lonardoni F., Favretto D. et al. Changes in amniotic fluid and umbilical cord serum proteomic profiles of foetuses with intrauterine growth retardation // Electrophoresis. 2011. Vol.32. №24. P.3630-3637.
3. Gorg A., Boguth G., Obermaier C. et al. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis with immobilized pH gradients in the first dimension (IPG-Dalt): the state of the art and the controversy of vertical versus horizontal systems // Electrophoresis. 1995. Vol.16. P.1079-1086.
4. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O. et al. Mass spectrometric sequencing of proteins from silver stained polyacrylamide gels // Anal. Chem. 1996. Vol.68. P.850-858.
5. Chmurzynska A. The multigene family of fatty acid-binding proteins (FABPs): function, structure and polymorphism // J. Appl. Genet. 2006. Vol.47. №1. P.39-48.
6. Tisi D.K., Liu X.J., Wykes L.J. et al. Insulin-like growth factor II and binding proteins 1 and 3 from second trimester human amniotic fluid are associated with infant birth weight // J. Nutr. 2005. Vol.135. №7. P.1667-1672.
7. Дуда В.И., Дуда В.И., Дуда И.В. Плацентарный лактоген в диагностике акушерской патологии // Охрана материнства и детства. 2010. № 2. С.4-7.
8. Berkova N., Lemay A., Dresser D.W. et al. Haptoglobin is present in human endometrium and shows elevated levels in the decidua during pregnancy // Mol. Hum. Reprod. 2001.Vol.7. №8. P.747-754.
9. Калинина Е.В., Чернов Н.Н., Саприн А.Н. Участие тио-, пе-рокси- и глутаредоксинов в клеточных редокс-зависимых процессах // Успехи биологической химии. 2008. Т. 48. С. 319-358.
10. Ueland T., Dalsoren T., Voldner N. et al. Retinol-binding protein-4 is not strongly associated with insulin sensitivity in normal pregnancies // Eur. J. Endocrinol. 2008. Vol.159. №1. P.49-54.
11. Casey B.M., Dash J.S., Wells C. et al. Subclinical hypothyroidism and pregnancy outcomes // Obst. Gyn. 2005. Vol. 105. P. 239244.
12. Donato R. Intracellular and extracellular roles of S100 proteins // Microsc. Res. Tech. 2003. Vol.60. P.540-551.
13. MacLean M., Picard D. Cdc37 goes beyond Hsp90 and kinases // Cell Stress Chaperones. 2003. Vol.8. №2. P.114-119.
14. Hedlund M., Stenqvist A.C., Nagaeva O. et al. Human placenta expresses and secretes NKG2D ligands via exosomes that down-modulate the cognate receptor expression: evidence for immunosuppressive function // J. Immunol. 2009. Vol.183. №1. P.340-351.
15. Hassan M.I., Waheed A., Yadav S. et al. Zinc alpha 2-glycoprotein: a multidisciplinary protein // Mol. Cancer Res. 2008. Vol.6. № 6. P.892-906.
16. Braunewell K.H., Klein-Szanto A.J. Visinin-like proteins (VSNLs): interaction partners and emerging functions in signal transduction of a subfamily of neuronal Ca2+ -sensor proteins // Cell Tissue Res. 2009. Vol.335. №2. P.301-316.
17. Grewal J.S., Tsai J.Y., Khan S.R. Oxalate-inducible AMBP gene and its regulatory mechanism in renal tubular epithelial cells // Biochem. J. 2005. Vol.387. Pt 3. P.609-616.
18. Hanna L.A., Clegg M.S., Ellis-Hutchings R.G. et al. The influence of gestational zinc deficiency on the fetal insulin-like growth factor axis in the rat // Exp. Biol. Med. 2010. Vol.235. №2. P.206-214.
19. King J.C. Zinc: an essential but elusive nutrient // Am. J. Clin. Nutr. 2011. Vol.94. №2. P.679-684.
20. Ruz M. Zinc supplementation and growth // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 2006. Vol.9. №6. P.757-762.
