CC BY
72
оригинальные статьи Журнал фундаментальной медицины и биологии
УДК 618.36+618.3-06+616-037+577.2
Т.Н. Погорелова, И.И. Крукиер, В.В. Авруцкая, Н.А. Друккер
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЯ ПРОЦЕССОВ АНГИОГЕНЕЗА ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ, ОСЛОЖНЕННОЙ ЗАДЕРЖКОЙ РОСТА ПЛОДА
ФГУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии» Минздравсоцразвития России (отдел медико-биологических проблем в акушерстве, гинекологии и педиатрии),
Ростов-на-Дону
Цель: изучение продукции и рецепции ангиогенных факторов роста и вазоактивных компонентов при физиологической беременности и задержке роста плода (ЗРП).
Материалы и методы: 36 женщин с физиологической беременностью и 39 — с беременностью, осложнившейся ЗРП на фоне плацентарной недостаточности. Исследования проведены в сыворотке крови в I и II триместрах беременности, околоплодных водах и плаценте с использованием ЭПР-спектроскопии, иммунофер-ментных и биохимических методов.
Результаты: выявлено повышение в сыворотке крови содержания сосудисто-эндотелиального фактора роста—А (СЭФР-А), эпидермального фактора роста (ЭФР), их рецепторов, а также трансформирующего фактора роста-бета (ТФР-р), эндотелина-1, NOх и активности NO-синтазы. В плаценте уровень СЭФР-А, ЭФР и их рецепторов при ЗРП ниже, чем при неосложненной беременности. Для ТФР-р и NOх установлено увеличение плацентарной продукции. В околоплодных водах также имеют место достоверные изменения изученных показателей.
Заключение: обнаруженные изменения в продукции и рецепции факторов роста, а также вазоактивных соединений при ЗРП углубляют наши представления о механизмах нарушения процессов ангиогенеза, альтерации сосудистого тонуса, плацентарной гемодинамики и могут служить маркерами этого акушерского осложнения.
Ключевые слова: факторы роста, вазоактивные компоненты, плацентарная недостаточность, задержка роста плода.
T.N. Pogorelova, I.I. Krukier, V.V. Avrutskaya, N.A. Drukker
MOLECULAR MECHANISMS OF DISTURBANCE PROCESS OF ANGIOGENESIS DURING PREGNANCY COMPLICATED BY FETAL GROWTH RETARDATION
Rostov Scientific Research Institute of Obstetrics and Pediatrics (Department of Medical and Biological Problems in Obstetrics, Gynecology and Pediatrics), Rostov-on-Don
Purpose: To study the production and reception of angiogenic growth factors and vasoactive components during the physiological pregnancy and in pregnancy complicated by fetal growth retardation (FGR).
Materials and Methods: 36 women with physiological pregnancy and 39 with pregnancy, complicated with FGR on the background of placental insufficiency. The studies were conducted on blood serum in I and II trimesters of pregnancy, amniotic fluid and on the placenta with use of EPR-spectroscopy, immunoenzyme and biochemical methods.
Results: We detected the increase of vascular endothelial growth factor-1 (VEGF-1) in the blood serum, of epidermal growth factor (EGF), their receptors, as well as transforming growth factor-beta (TGF-p), endothelin-1, NOx and activity of NO-synthase. The level of VEGF-1, EGF and their receptors in placenta during FGR is lower than during the normal pregnancy. The increase of the placental production of TGF-p and NOx has been estimated.
Summary: The revealed changes in the production and reception of the growth factors and also of vasoactive compounds in the pregnancy complicated by FGR extends our notions about the mechanisms of disturbance process of angiogenesis, alteration of vascular tone, placental hemodynamics; these changes may serve as markers of this obstetric complication.
Key words: growth factors, vasoactive components, placental insufficiency, fetal growth retardation.
Журнал фундаментальной медицины и биологии
оригинальные статьи
Введение
Среди лидирующих акушерских причин, приводящих к детской заболеваемости и смертности, важное место занимает задержка роста плода (ЗРП), патогенетически обусловленная плацентарной недостаточностью [1,2]. Одним из первичных звеньев в цепи функциональных механизмов формирования этого осложнения беременности являются нарушения маточно-плацентарного кровотока и, как следствие, гемодинамические изменения в системе мать-плацента-плод.
Нарушения кровотока в бассейне маточных артерий, регистрируемые у беременных в различные сроки гестации, являются факторами, предопределяющими патологические процессы, происходящие в плаценте на фоне осложненного течения беременности. Причем последствия функционально-метаболических повреждений в плаценте могут обнаруживаться даже в отдаленные этапы постна-тального онтогенеза.
Наступление беременности сопряжено с важнейшим биологическим процессом — ангиогене-зом, который обусловливает нормальное развитие сосудистой сети и формирование плаценты. Изменения в становлении полноценной сосудистой системы, наряду с нарушением процессов пролиферации трофобласта, его миграции и инвазии, являются универсальными пусковыми механизмами для большинства отклонений в нормальном течении гестации. Развитие конкретной патологии, по-видимому, определяется дальнейшей спецификой клеточно-молекулярных повреждений плаценты. Современные исследования позволили установить, что среди внутриклеточных регуляторов, контролирующих рост и развитие сосудов, важное место занимают биологически активные полипептиды — факторы роста, стимулирующие или ингибирующие ангиогенез, а также другие клеточные процессы, включая митогенные эффекты. Среди достаточно большого числа факторов роста, важную роль в процессах ангиогенеза, дифференцировки, инвазии трофобласта, в контроле за последующим развитием плацентарной ткани и ее сосудистой сети играют сосудисто-эндотелиальный фактор роста (СЭФР), эпидермальный фактор роста (ЭФР), трансформирующий фактор роста-р (ТФР-р) [3,4,5].
Однако характер ангиогенеза, продукция ангио-генных факторов роста являются не единственными параметрами, определяющими состояние маточно-и фетоплацентарного кровообращения. Последние во многом зависят от свойств эндотелия и баланса эндотелиальных факторов, контролирующих тонус сосудов, нарушение которого - результат неадекватного образования вазоактивных веществ. Дисфункция эндотелия, нередко возникающая при осложненном течении беременности, как наиболее ранняя фаза повреждения сосуда связана, прежде всего, с нарушением синтеза оксида азота (N0), обладающего мощным вазодилататорным действием, и вазоконстриктора эндотелина —1 [6].
В связи с исключительной важностью вышеуказанных клеточных биорегуляторов в процессе беременности и отсутствием достаточных знаний
об их роли в формировании акушерской патологии цель настоящего исследования - изучение динамики продукции и рецепции ангиогенных факторов роста, а также вазоактивных компонентов при физиологической беременности и ЗРП.
Материалы и методы
В проспективное исследование были включены 75 женщин в возрасте 23-33 лет, из них 36 — с физиологическим течением беременности, у 39 — беременность осложнилась ЗРП (верифицированной после рождения ребенка) на фоне плацентарной недостаточности. Диагноз плацентарной недостаточности поставлен на основании комплексного динамического клинико-лабораторного обследования.
Материалом для исследования служили сыворотка крови, взятая у пациенток в первом (10—12 недель) и во втором (15—17 недель) триместрах беременности, околоплодные воды, взятые при вскрытии плодного пузыря в I периоде родов, и экстракты плаценты, полученной после срочных родов.
Содержание СЭФР-А, ЭФР и ТФР-ß определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, используя наборы «R@D system» (USA). Содержание рецепторов СЭФР (СЭФР-R^ и ЭФР (ЭФР-R) - с помощью наборов «Bender Med System» (Austria) в соответствии с протоколами исследования фирм-разработчиков. Количество эн-дотелина-1 оценивали с использованием наборов «DRG International, Inc.». Эндогенное содержание метаболитов оксида азота (NO2-, NO3-), обозначенное NOx, определяли с помощью классической реакции Грисса. Об активности NO-синтазы судили по увеличению продукции NO, используя в качестве субстрата l-аргинин и НАДФН. Количественную оценку образования NO проводили с помощью ЭПР-спектроскопии мононитрозильных комплексов с двухвалентным железом и диэтил-дитиокарбоматом, обладающих парамагнитными свойствами.
Статистическую обработку данных осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (фирма StatSoft. Inc.). Однородность дисперсий проверяли по критерию Фишера. Для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми показателями использовали критерий Стьюдента и непараметрический критерий Манна-Уитни. Достоверными считались различия при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Результаты исследования представлены в таблицах 1, 2 и 3. Как следует из таблицы 1, в сыворотке крови пациенток с физиологической беременностью содержание СЭФР-А, играющего важнейшую роль в процессах ангиогенеза, плацентации, а также в регуляции сосудистой проницаемости, на протяжении I и II триместров беременности остается стабильным. В то же время при беременности, осложненной ЗРП, уже в I триместре от-
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
мечается увеличение уровня этого фактора роста на 82% по сравнению с таковым при физиологической беременности. Во втором триместре содержание СЭФР-А продолжает возрастать и превышает аналогичную величину при неосложненной беременности в 3—4 раза. Поскольку экспрессия гена СЭФР активируется гипоксией, можно полагать, что такое значительное увеличение содер-
жания СЭФР-А уже в ранние сроки беременности обусловлено выраженной гипоксемией, в условиях которой развивается плодное яйцо и эмбрион. Продолжающееся повышение уровня СЭФР-А в сыворотке крови при ЗРП во втором триместре свидетельствует не только о сохранении гипоксе-мии, но и, очевидно, об ее прогрессировании.
Таблица 1
Содержание факторов роста, их рецепторов, эндотелина-1, NOх и активность NO-синтазы в сыворотке крови при физиологической беременности и ЗРП
Показатель Течение беременности
Физиол. беременность ЗРП
I триместр II триместр I триместр II триместр
СЭФР-А (пкг/мл) 780,4±73,1 920,6±87,2 1420,3±97,9* 3150,1±180,2**
ЭФР (пкг/мл) 427,3±23,4 555,7±60,9 524,0±38,6* 705,9±55,4**
ТФР-Р (пкг/мл) 131,3±9,7 114,0±7,0 206,6±16,0* 183,8±11,8**
СЭФР-Rl (пкг/мл) 0,45±0,04 0,67±0,05 1,12±0,14* 2,11±0,23**
ЭФР- R (пкг/мл) 25,6±1,9 39,6±4,2 41,3±3,4* 59,4±6,3**
Эндотелин-1 (нг/мл) 1,1±0,1 4,8±0,5 3,7±0,6* 8,2±0,9**
NOx (мкмоль/л) 23,2±1,2 29,8±1,5 39,8±2,1* 37,6±2,6**
NO-синтаза (мкмоль/л) 30,2±1,6 42,6±1,9 47,5±3,2* 57,1±2,4**
Достоверность отличий между показателями при физиологической беременности и ЗРП: * - в первом триместре, ** - во втором триместре
Аналогичная, хотя и менее выраженная, направленность изменений имеет место и для ЭФР, занимающего ключевые позиции в регуляции имплантации, роста и дифференцировки плаценты. Количество ЭФР в сыворотке крови при ЗРП достоверно выше, чем при физиологической беременности в первом триместре на 22% и во втором триместре - на 27%. Если рассматривать действие факторов роста на молекулярном уровне, то, прежде всего, это экспрессия целого ряда генов. Причем реализация указанных эффектов, как известно, опосредуется его рецептором, благодаря наличию у рецепторного белка ферментативной активности, обеспечивающей действие трансдукторных механизмов. Как показали наши исследования, наряду с изменением содержания факторов роста в процессе развития гестации меняется и продукция их рецепторов. Уровень растворимых форм СЭФР^1 и ЭФР^ в сыворотке крови женщин с физиологической беременностью увеличивается к началу второго триместра по сравнению с первым на 49% и 55% соответственно. При ЗРП содержание СЭФР^1 в первом триместре превышает аналогичную нормальную величину в 2,5 раза, а во втором триместре еще более выражено - в 3,1 раза. Количество ЭФР^ на два порядка выше уровня СЭФР^1. Последнее может быть связано с тем, что ЭФР^ является рецептором не только ЭФР, но и ТФР, и его экспрессия должна обеспечивать регулирующие эффекты двух ростовых факторов. В отличие
от СЭФР^1 динамика ЭФР^ при осложненной беременности менее значима: увеличение его уровня относительно такового при физиологической беременности в первом триместре составило 61%, во втором триместре - 50%. Изменение содержания ЭФР-В. и СЭФР-В.1 при беременности осложненной ЗРП, наряду с модификацией продукции соответствующих факторов роста, увеличивает возможность повреждения различных звеньев в общей цепи ангио- и митогенных эффектов ЭФР и СЭФР.
Для ТФР-Р при осложненном течении беременности уже в первом триместре также установлено повышение его сывороточного уровня (на 57%), сохраняющееся и в дальнейшем во втором триместре (на 61%) относительно соответствующих величин при физиологической беременности. Наряду с участием ТФР-р в регуляции ангиогенеза, имплантации и дифференциации цитотрофобласта, одним из вторичных метаболических эффектов этого фактора роста, влияющих на процессы гемодинамики, является изменение метаболизма 1-аргинина в результате модификации активности МО-синтазы и аргиназы [7]. Влияние ТФР-Р на активность МО-синтазы приводит к нарушению генерации N0, а активация им аргиназы сопровождается усилением продукции пролина, способствующего структурным изменениям сосудистой стенки.
Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что кроме дисбаланса эндогенных регуляторов ангиогенеза при беременности, осложнившейся ЗРП, имеет место изменение продукции соединений, влия-
Журнал фундаментальной медицины и биологии
оригинальные статьи
ющих на тонус сосудов и состояние их эндотелия. Так, содержание эндотелина-1 в сыворотке крови при указанной патологии в первом триместре более чем в 3 раза превышает соответствующий показатель при физиологической гестации. Во II триместре увеличение составляет 70%. Причем и при физиологической, и при осложненной беременности уровень эндотелина-1 во втором триместре значительно превышает таковой в I триместре, что, очевидно, связано с увеличением объема сосудистого русла. По этой же причине, по-видимому, в процессе нормального развития гестации происходит нарастание продукции NO. При беременности, осложнившейся ЗРП, содержание NOx и активности NO-синтазы в сыворотке крови также повышается, однако в значительно меньшей степени, чем содержание эндотелина-1. Различная интенсивность, хотя и однонаправленного изменения, продукции изученных вазоактивных компонентов (с противоположным влиянием на тонус сосудов) приводит к усилению вазоконстрикторной
составляющей в их нарушенном балансе. Эта ситуация четко прослеживается при анализе коэффициента NOx/эндотелинИ. Если при физиологической беременности данный показатель составил 21 и 6,2 соответственно в I и II триместрах, то при ЗРП - 10,7 и 4,5. Полученные данные позволяют предполагать наличие при ЗРП эндотелиальной дисфункции, сопровождающейся нарушением гемодинамики и усиливающейся в результате перси-стирующей гипоксемии, в условиях которой развивается плацента и эмбрион.
Обнаруженные изменения содержания факторов роста и вазоактивных соединений в сыворотке крови женщин с ЗРП свидетельствуют о том, что развитие плаценты происходит в условиях нарушения формирования ее сосудистой системы и снижения гемодинамики. В связи с вышеизложенным представляло интерес изучить характер продукции этих компонентов непосредственно в ткани плаценты, чтобы оценить ее метаболический «потенциал» к моменту родов.
Таблица 2
Содержание факторов роста, их рецепторов, эндотелина-1, NOх и активность NO-синтазы в плаценте при физиологической беременности и ЗРП
Показатель Течение беременности
Физиологическая беременность ЗРП
СЭФР-А (нг/г) 1,77+0,12 0,98+0,09*
ЭФР (нг/г) 0,42+0,03 0,27+0,02*
ТФР-р (нг/г) 0,78+0,05 1,77+0,16*
СЭФР-RI (пкг/г) 30,52+3,21 23,13+2,02*
ЭФР- R (пкг/г) 9,24+0,82 5,54+0,42*
Эндотелин-1 (нг/г) 4,02+0,22 4,93+0,26*
NOx (мкмоль/г) 11,81+0,52 15,91+0,96*
NO-синтаза (мкмоль/г) 9,72+0,70 12,30+1,37
*- достоверность отличий между показателями при физиологической беременности и ЗРП.
Из представленных в таблице 2 данных следует, что уровень СЭФР-А, ЭФР, а также их рецепторов в плаценте, полученной после родов в срок, при ЗРП ниже аналогичных величин при физиологической беременности. Можно полагать, что в данном случае имеет место некоторое истощение синтетических возможностей плаценты, развивающейся на фоне нарушенного пластического и кислородного обеспечения. В то же время не столь выраженная степень изменений, каковую можно было ожидать, исходя из динамики показателей в сыворотке крови в двух первых триместрах, позволяет предположить наличие компенсаторных механизмов в молекулярном обеспечении функций плаценты, направленных на донашивание беременности. Этот аргумент подтверждается ранее полученными нами результатами о более значительном изменении процессов плацентарной продукции
и рецепции факторов роста при самопроизвольно прервавшейся беременности [8]. Лишь для ТФР-Р сохраняется двукратное увеличение его содержания в плаценте относительно физиологической величины.
Что касается вазоактивных компонентов - N0 и эн-дотелина, то их количество при беременности, осложнившейся ЗРП, также отличается от соответствующих плацентарных показателей при физиологической беременности. На фоне обнаруженной тенденции к повышению содержания эндотелина-1 продукция N0 в плаценте при ЗРП достоверно превышает таковую при нормальной гестации. Коэффициент N0х/эндотелин-1, составляющий в плаценте при физиологической беременности 2,9, при ЗРП повышается до 3,5. Сдвиг баланса вазотони-ков в сторону повышения вазодилататора N0, очевидно также имеет компенсаторный характер и способствует
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
поддержанию плодово-плацентарной гемодинамики за счет уменьшения спазма сосудов и усиления кровотока в условиях внутриутробной гипоксии, имеющей место при плацентарной недостаточности. Для плаценты, не обладающей иннервационным аппаратом, именно гуморальные медиаторы являются главными механизмами, регулирующими ее внутриклеточные процессы. По сравнению с другими медиаторами несомненное преимуще-
ство N0 состоит в том, что он свободно проходит через клеточные мембраны и при этом действует не только как переносчик межклеточного сигнала, но и как внутриклеточный эффектор [9]. Отклонения в физиологических соотношениях изученных биоактивных компонентов в плаценте подтверждают факт функционально-метаболических повреждений этого органа при ЗРП.
Таблица 3
Содержание факторов роста, эндотелин-1а, NOх и активность NO-синтазы в околоплодных водах при физиологической беременности и ЗРП
Показатель Течение беременности
Физиологическая беременность ЗРП
СЭФР (пкг/мл) 650,3+44,7 879,5+66,3*
ЭФР (пкг/мл) 336,5+27,1 254,3+19,6*
ТФР-ß (пкг/мл) 116,4+9,7 187,5+21,3*
Эндотелин-1 (нг/мл) 2,4+0,1 1,6+0,1*
NOx (мкмоль/л) 14,3+0,9 19,3+1,8*
NO-синтаза (мкмоль/л) 10,1+0,7 14,4+1,2*
*- достоверность отличий между показателями при физиологической беременности и ЗРП.
В функционировании системы мать-плацента-плод существенную роль играют также околоплодные воды — сложная биологически активная среда, обеспечивающая наряду с другими компонентами этой системы нормальную жизнедеятельность плода [10]. По нашим данным, содержание изученных факторов роста и вазоактивных соединений в околоплодных водах при ЗРП отличается от этих показателей при нормальной гестации (табл. 3). Так содержание СЭФР-А и ТФР-р увеличено на 35% и 61% соответственно, а уровень ЭФР, напротив, снижен на 30%. Уровень эндотелина-1 в околоплодных водах при ЗРП выше физиологической величины на 34%, а N0х, как и активность N0-синтазы, снижены в среднем на 40 %, что приводит к значительному изменению их соот-
ношения. Модификация баланса факторов роста и вазоактивных соединений в околоплодных водах и сыворотке крови, наряду с отклонениями в плацентарной продукции этих биоактивных регуляторов, является еще одним подтверждением не только локальных, но и системных метаболических нарушений при ЗРП.
Резюмируя вышеизложенное можно заключить, что установленная нами модификация продукции ангиогенных факторов роста и вазоактивных компонентов углубляет наши представления о механизмах нарушения процессов ангиогенеза и гемодинамики при ЗРП. Поскольку изменения содержания изученных показателей выявляются еще на доклинической стадии этого акушерского осложнения, они могут служить его маркерами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Стрижаков А.Н., Мусаев З.М., Наумчик Б.И. и др. Резервы снижения перинатальной и младенческой заболеваемости. Мат. IV Российского форума «Мать и дитя». Москва. 2002: 577-578.
2. Сидельникова В.М., Шмаров Р.Г. Механизмы адаптации и дезадаптации гемостаза при беременности. М. 2004; 256 с.
3. Hofmann G.E., Drews M.R., Scott R.T. et al. Epidermal growth factor and its receptor in human implantation trophoblast: immunohistochemical evidence for autocrine/paracrine function. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1992; 74 (5): 981-988.
4. Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in regulation of physiological angiogenesis. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2001; 280: 1358-1366.
5. Hennessy A., Orange S., Willis N. et al. Transforming growth factor-beta 1 does not relate to hypertension in pre-eclampsia. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2002; 29(11): 968-971.
6. Зинчук В.В., Максимович Н.А., Козловский В.И и др. Дисфункция эндотелия: фундаментальные и клинические аспекты. Международный симпозиум «Активные формы кислорода, азота и хлора в регуляции клеточных функций в норме и при патологии». Гродно, 2006: 183.
7. Shearer J.D., Richards J.R., Mills C.D. et al. Differential regulation of macrophage arginine metabolism: a proposed role in wound healing. Am. J. Physiol. 1997; 272 (2): 181-190.
8. Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Орлов В.И. Продукция и рецепция факторов роста в плаценте при физиологической беременности и осложненной гестозом. Биомед. химия. 2007; 53 (3): 8-11.
9. Северина И.С. NO - новый взгляд на механизм действия старых лекарств. Биомед. химия. 2005; 51 (1): 19-29.
10. Орлов В.И., Погорелова Т.Н., Крукиер И.И. и др. Околоплодные воды. Химический состав и биологические функции. РнД. 2009: 224 с.
