CC BY
64
Dagurova Olga Pavlovna, candidate of biology, research scientist, Laboratory of Microbiology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, e-mail: dagur-ol@mail.ru
Garankina Valentina Petrovna, candidate of biology, senior research scientist, Laboratory of Microbiology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, e-mail: g_val_82@mail.ru
Zaitseva Svetlana Victorovna, candidate of biology, research scientist, Laboratory of Microbiology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, e-mail: svet_zait@mail.ru
Dambaev Vyacheslav Borisovich, candidate of biology, research scientist, Laboratory of Microbiology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, e-mail: slavadmb@rambler.ru
Basagaev Soil Bairovich, postgraduate student, Buryat State University, e-mail: basagaev_soil@mail.ru
УДК 551.42 © Е.Б. Эрдынеева, Е.В. Лаврентьева, А. А. Раднагуруева
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИЙ СОЛЕНЫХ ОЗЕР ПУСТЫНИ БАДАИН ЖАРАН (ВНУТРЕННЯ МОНГОЛИЯ, КИТАЙ)
Работа выполнена при поддержке грантов «Интеграционные проекты» СО РАН № 94
и ФЦП МО РФ Соглашение №8116
Количественный метод показал широкое распространение протеолитических бактерий в донных осадках и микробных матах в соленых озерах пустыни Бадаин Жаран. Обнаружена высокая внеклеточная пептидазная активность в нативных образцах, обладающих широким диапазоном значений рН и температур.
Ключевые слова: Бадаин Жаран, протеолитические бактерии, пептидазная активность.
E.B. Erdyneeva, E.V. Lavrentieva, A.A. Radnagurueva
PROTEOLYTIC ACTIVITY OF THE SALT LAKES BACTERIA OF THE BADAIN JARAN
DESERT (INNER MONGOLIA, CHINA)
Quantitative method showed widespread proteolytic bacteria in the sediments and microbial mats in salt lakes of the Badain Jaran desert. High extracellular peptidase activity of the native samples having a wide range of pH values and temperatures was determined.
Keywords: Badain Jaran, proteolytic bacteria, peptidase activity.
Соленые озера пустыни Бадаин Жаран являются экстремальными экосистемами и характеризуются высокими значениями солености до 495 г/л и рН до 10,63. Микроорганизмы, обитающие в этих экосистемах, представляют значительный интерес как для фундаментальных исследований, так и для потенциальных практических применений. Протеолитические бактерии являются первичными деструкторами органического вещества в экосистемах. Большинство протеолитиков используют в качестве источника углерода и энергии пептидов благодаря наличию внеклеточных пептидаз, активных в широких диапазонах значений рН и солености [1, 2].
Исследования выделения, идентификации и классификации ферментов протеолитической активности в последние годы проводятся особенно интенсивно, что объясняется востребованностью и многообразием протеолитических ферментов [2].
Цель работы - изучить количественный состав протеолитических бактерий и их активность в нативных образцах.
Объекты и методы
Объектами исследования являются соленые озера пустыни Бадаин Жаран, которые расположены в юго-центральной части автономного района Внутренняя Монголия, а также северной части провинции Ганьсу, расположенные на высоте около 1200 м над уровнем моря в Альхо Плато на территории пустыни Гоби. Озера встречаются в основном в южном регионе провинции пустыни Бадаин Жаран. Для исследования были отобраны пробы микробных матов, донных осадков, ила, соли, песчаного осадка в августе 2013 г. Места отбора проб характеризуются высокой концентрацией хлорида натрия (6-495 г/л) и значениями рН ( 8,99-9,87).
Е.Б. Эрдынеева, Е.В. Лаврентьева, А.А. Раднагуруева. Протеолитическая активность бактерий соленых озер пустыни Бадаин Жаран (Внутрення Монголия, Китай)_
Методы исследования
В местах отбора проб определяли рН среды потенциометрически при помощи полевого рН-метра рНер (Португалия). Значение общей минерализации определяли портативным тестер-кондуктометром TDS-4.
Учет численности и выделения аэробных галофильных протеолитических бактерий проводили методом предельных разведений на модифицированной среде Пфеннига следующего состава (г/л): NH4Cl - 0,5; KH2PO4 - 0,5; MgCl2 - 0,5; СаС12 - 0,05; дрожжевой экстракт - 5. В качестве субстрата для протеолитиков вносили пептон 5 г/л, а для учета численности вносили 250 г/л хлорид натрия. рН25 С среды доводили бикарбонатно-карбонатным буфером до 8,5-9,5, температура инкубации 30оС [3].
Морфологию, размеры, подвижность клеток изучали микроскопированием образцов с помощью светового микроскопа AxioStar Plus (Karl Zeiss) в фазовом контрасте. Готовились препараты живых и фиксированных окрашенных клеток. В качестве источника секретируемых пептидаз использовали белковый экстракт из натив-ных проб. Белковый экстракт получали путем перетирания 1 см2 микробного мата или донных осадков с добавлением 1 мл фосфатного буфера рН 7 в ступке. Биомассу отделяли от нее методом центрифугирования (20 тыс. g в течение 25-30 мин). В пробы добавляли 0,0025% азида натрия, препятствующего развитию микроорганизмов. Хранение осуществляли при 4оС. Внеклеточную протеазную активность определяли по методу Эрлангера
[4], используя синтетические n-нитроанилидные субстраты (спектрофотометр CECIL 1021). N-нитроанилидные субстраты содержат аналог пептидной связи, которая расщепляется под действием пептидазных ферментов. В результате расщепления выделяется n-нитроанилин, окрашивающий реакционную смесь в желтый цвет. Все n-нитроанилидные субстраты растворяли в диметилформамиде. Растворы GlpFApNA, GlpFpNA и BAPA готовили с концентрацией 0,02 М; GlpAALpNA и субстраты для аминопептидаз - 0,1 М. Для определения пептидазной активности смешивали 700 мкл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,0), 10 мкл раствора субстрата и 50 мкл пробы. Проводили измерение поглощения в нулевой момент, после реакционную смесь инкубировали в термостате при 37оС в течение 1 ч. Интенсивность окраски определяли спектрофотометрически при длине волны 410 нм
[5].
Результаты и исследования
Были изучены образцы проб (микробные маты, донные осадки, ил, соли, песчаные осадки) соленых озер пустыни Бадаин Жаран, где значения рН и солености варьировались. Наибольшие концентрации хлорида натрия обнаружены в точках Bj-02, Bj-03A, Bj-05 (до 495 г/л) и наибольшие значения рН - в точках Bj-04, Bj-07 (до 9,87). Максимальная численность протеолитических бактерий достигала 10-6 кл/см3 в микробных матах (табл. 1). Численность протеолитиков в изучаемых озерах колеблется от 1 до 6 млн кл/см3. Максимальные значения обнаружены в микробных матах точек Bj-03A, Bj-04, Bj-07, Bj-08, Bj-09, а минимальное значение - в песчаном мате точки Bj-11.
Внеклеточная протеолитическая активность в нативных пробах. Все образцы проб показали активность на субтилизинподобных, трипсинподобных, химотрипсиноподобных, цистеиновых и аминопептидазных субстратах (рис. 1). Максимальная пептидазная активность в нативных образцах по субстрату, Phe-pNa была зафиксирована в точке Bj-07, которая составляет 2,728 ед.
Таблица 1
Физико-химическая характеристика проб и численность протеолитических бактерий в илах и микробных матах
Станция Озеро Проба Соленость, г/л рН Численность, млн кл/ см3
Bj-01 Badain west Ил 277 9,57 3
Bj-02 Badain west (лагуна) Микробный мат 495 9,76 4
Bj-03A Nuoertu Колоночный мат 495 9,76 6
Bj-03B Nuoertu Рыхлый мат 108 9,75 5
Bj-04 Huhejilin Микробный мат 113 9,87 6
Bj-05 Yindeertu (лагуна) Соль 410 9,23 2
Bj-06 Yindeertu Микробный мат 243 9,71 5
Bj-07 Sumujilin Микробный мат 197 9,83 6
Bj-08 Barun Jaran Микробный мат 145 9,73 6
Bj-09 Yiher west Микробный мат 210 9,59 6
Bj-10 Yiher east Микробный мат 220 9,65 5
Bj-11 Badain east Песчаный мат 6 8,99 1
л
В
о s
£ w
н
3
Станция
Рис. 1. Внеклеточная протеолитическая активность
В целом отмечено, что наибольшая внеклеточная протеолитическая активность по всем субстратам обнаружена в песчаном мате точки Bj-02 и микробных матах точек Bj-07 и Bj-08.
Впервые проведенные исследования распространения и количественной оценки протеолитических бактерий в озерах пустыни Бадаин Жаран показали, что протеолитические бактерии являются активным компонентом микробного сообщества в этих экстремальных условиях
Литература
1. Klingeberg M., Galunsky B., Sjoholm C. Purification and properties of high thermostable, sodium dodecyl sulphate-resistant and stereospecific proteinase from extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri // Appl. Environ. Microbiol. - 1995. -V.61. - P. 3098-3104.
2. Ward D.E., Shockley K.R., Chang L.S. Proteolysis in hyperthermophilic microorganisms // Archaea. - 2002. - V. 1. - P. 63-74.
3. Нетрусов А.И., Егоров М.А. Практикум по микробиологии. - М.: Академия, 2005. - 608 с.
4. Erlanger B.F., Kokowsky N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophis. - 1961. - V. 95. - P. 271-278.
5. Раднагуруева А.А. и др. Биохимическая характеристика культуры Um-09 m / А.А. Раднагуруева, Е.В. Лаврентьева, Б.Б. Намсараев, Я.Е. Дунаевский // Вестник Бурятского госуниверситета. - 2011. - Вып. 3. - С. 94-97.
Эрдынеева Елена Базыровна, аспирант, лаборатория микробиологии, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, e-mail: licenok-12@mail.ru
Лаврентьева Елена Владимировна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатория микробиологии, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, e-mail: lena_l@mil.ru
Раднагуруева Арюна Арсалановна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник, лаборатория микробиологии институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, e-mail: aryuna_rg@mail.ru
Erdyneeva Elena Bazurovna, postgraduate student, Laboratory of Microbiology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, e-mail: licenok-12@mail.ru
Lavrentieva Elena Vladimirovna, candidate of biological science, researcher, Laboratory of Microbiology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, e-mail: lena_l@mil.ru
Radnagurueva Aryuna Arsalanovna, candidate of biological science, junior researcher, Laboratory of Microbiology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, e-mail: aryuna_rg@mail.ru
