CC BY
102
ISSN 1998-4812
1017
УДК 577.2.08
раздел БИОЛОГИЯ и ЭКОЛОГИЯ
ПРОТЕКАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ПРАЙМЕРАМИ «ВСТЫК» В ПРИСУТСТВИИ ИНГИБИТОРОВ
© А. А. Галимова*, А. Р. Сахабутдинова, Р. Р. Гарафутдинов
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71
Тел./факс: +7 (347) 235 60 88.
*Етай: aiz.galimova@yandex. ги
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - один из самых используемых методов медико-биологических исследований - постоянно претерпевает изменения, связанные с необходимостью решения новых задач. Для обеспечения достоверности получаемых с помощью ПЦР результатов необходимо соблюдение требований к качеству компонентов реакции, в частности, к ДНК-мишени. Нередко амплифицируемая ДНК содержит ингибиторы ПЦР. В этой работе показаны различия в эффективности амплификации ДНК в ходе ПЦР с детекцией результатов по конечной точке и ПЦР в реальном времени с использованием праймеров «встык» по сравнению с прай-мерами с традиционным расположением при наличии в ПЦР-смеси ингибирующих агентов. Обнаружено, что использование праймеров «встык» обеспечивает меньшую чувствительность ПЦР-системы к ингибиторам.
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, праймеры «встык», ингибиторы ПЦР, гем, фенольные соединения, специфичность.
Введение
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) является одним из наиболее востребованных методов молекулярной биологии [1, 2]. Однако на практике исследователям нередко приходится сталкиваться с трудностями при амплификации отдельных образцов ДНК, например, выделенной из старых биообъектов (археологические находки, захоронения и пр.), подвергнувшихся действию микроорганизмов, солнечной радиации, времени и др. Как правило, ДНК из подобных материалов загрязнена компонентами окружающей среды (гуминовые и фульвовые кислоты, по-лифенольные соединения, олигосахариды) за счет их со-экстракции при выделении нуклеиновых кислот. При выделении ДНК из биоматериалов человека в зависимости от источника выделения возможно сооса-ждение вместе с ДНК солей желчных кислот, мочевины, гема, гепарина, белков и углеводов, образующих с ДНК сложные комплексы. Все указанные соединения могут вызывать значительное снижение чувствительности и эффективности ПЦР, т.е. являются ее ингибиторами [3, 4].
Исключение ингибирования ПЦР добиваются в основном повышением качества/чистоты ДНК, для чего используют различные методики выделения, разработанные под конкретные биологические объекты [5]. Имеется большое количество коммерческих наборов для быстрой экстракции ДНК, однако они чаще применяются для выделения нуклеиновых кислот из относительно "чистых" источников. Для выделения ДНК из "сложных" образцов (биологические жидкости, продукты питания, почва, останки их захоронений, поверхностные и сточные воды и пр.) нередко прибегают к модификации методик экстракции. К сожалению, иных приемов для исключения влияния ингибиторов на ПЦР предложено не было.
Ранее было показано, что ПЦР с праймерами «встык», т.е. З'-концы которых располагаются на смежных нуклеотидах комплементарных цепей ДНК-матрицы, характеризуется высокими специфичностью и чувствительностью, что обеспечивает амплификацию разрушенной ДНК в условиях, при которых использование праймеров с традиционным расположением не приводит к положительному результату [6]. Целью данной работы стало изучение различий в эффективности амплификации ДНК с помощью ПЦР с использованием праймеров «встык» по сравнению с праймерами с традиционным расположением при наличии в ПЦР-смеси ингибирующих агентов.
Экспериментальная часть
В работе использованы реактивы: 5-(этилтио)-1Я-тетразол, амидофосфиты (dA-CE, dC-CE, dG-CE, dT-CE), носители для синтеза олигонуклеотидов (dA-CPG, dC-CPG, dG-CPG, dT-CPG) (все «Glen Research», США); абсолютные ацетонитрил и тетрагидрофуран квалификации для синтеза ДНК («Panreac», Испания); акриламид, ^№-метиленбисакриламид, Трис, персульфат аммония, динатриевая соль ^^№,№-этилен-диаминтетраукусной кислоты (EDTA), ^^№,№-тет-раметилэтилендиамин, додецилсульфат натрия (ДДС), цетилтриметиламмония бромид (ЦТАБ) (все «AppliChem,» Германия); агароза («Amresco», Россия); Taq ДНК полимераза («Fermentas», Литва), dNTP («СибЭнзим», Россия), SYBR Green I («Биотех-Инду-стрия», Россия). Для приготовления всех растворов использовали воду высшей категории качества (>18 МОм) («Millipore», США).
Олигонуклеотидные праймеры подбирали на основе нуклеотидных последовательностей, депонированных в GenBank, с использованием online-утилиты OligoAnalyzer компании «Integrated DNA Technologies». Праймеры синтезировали на автоматическом
ДНК-синтезаторе ASM-800 («Биоссет», Россия) ами-дофосфитным способом и очищали методом гель-электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле. Концентрацию всех нуклеиновых кислот определяли по оптической плотности водного раствора при 260 нм на спектрофотометре BioSpec-Mini («Shimadzu», Япония). Последовательности использованных в работе праймеров представлены в табл. 1.
В качестве ДНК-матриц использовали ДНК богомола обыкновенного (Mantis religiosa) и лиственницы Сукачева (Larix sukaczewii). ДНК богомола выделяли из мышечной ткани насекомого с помощью коммерческого набора ДНК-Экстран-2 («Синтол», Россия) строго по протоколу производителя. ДНК лиственницы получали ЦТАБ-методом [7] с небольшими изменениями [8].
Для приготовления ПЦР-ингибирующего препарата, содержащего гем, в 2 мл полипропиленовую пробирку типа eppendorf отбирали 100 мкл крови человека и сразу же приливали 100 мкл 1М хлорида натрия. Смесь выдерживали 5 мин, далее центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин. Далее суперна-тант, окрашенный в красный цвет за счет гемина, выделившегося из гемоглобина, отбирали в отдельную пробирку и определяли содержание в нем гема гемихромным методом по методике [9]. Ингибиру-ющее влияние гема на протекание ПЦР оценивали по наличию или отсутствию продуктов реакции методом гель-электрофореза.
ПЦР с детекцией результатов по конечной точке проводили в ДНК-амплификаторе Т100 («BioRad Laboratories»). Реакционные смеси имели объем 20 мкл и содержали 30 нг ДНК богомола (104 копий мишени), 0.5 мкл каждого из праймеров (1.0 О. Е./мл), 2.5 ед. акт. Taq ДНК полимеразы, 1.0 мкл смеси dNTP с концентрацией 2.5 мМ, 1 мкл буфера для Taq ДНК полимеразы (68 мМ ТрисНС1 (pH 8.8), 2.0 мМ MgCl2, 18 мМ (NH4)2SÜ4, 0.01% Твин-20). ПЦР проводили по стандартному протоколу: начальная денатурация при 95 °С (3 мин), 30 циклов - денатурация при 95 °С (15 с), отжиг при 59 °С (30 с) и элонгация при 72 °С (20 с), конечная элонгация при 72 °С (2 мин).
ПЦР в реальном времени проводили в ДНК-амплификаторе iQ5 («BioRad Laboratories»). Реакционные смеси объемом 10 мкл содержали 20 нг ДНК лиственницы Сукачева (103 копий), 0.5 мкл каждого
из праймеров с концентрацией 1.0 О. Е./мл, 2.5 ед. акт. Taq ДНК полимеразы, 1.0 мкл смеси dNTP с концентрацией 2.5 мМ, 1 мкл буфера для Taq ДНК полимеразы (67 мМ Трис-HCl (pH 8.8), 2.0 мМ MgCl2, 18 мМ (NH4)2SÜ4, 0.01% Твин-20) и 1 мкл 10-кратного раствора SYBR Green I. Каждый образец был представлен в трех повторах. Использовали программу, рекомендуемую для ПЦР в режиме реального времени с применением интеркалирующих красителей: начальная денатурация при 94 °С (3 мин), 70 циклов - денатурация при 94 °С (15 с), отжиг при 62 °С (40 с), элонгация при 72 °С (30 с), конечная элонгация при 72 °С (2 мин), 101 циклов плавления при 45| °С (30 с).
Результаты ПЦР анализировали методом гель-электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле в камере вертикального типа VE-10 («Хеликон») при напряжении 90-110 В с последующим окрашиванием гелей бромистым этидием и их визуализацией в приборе Gel Camera System («UVP Inc.»).
Результаты и обсуждение
Качество ДНК является фактором, определяющим надежность и воспроизводимость ПЦР. Однако на практике (судебно-медицинская экспертиза, ти-пирование ДНК из образцов с мест массовых захоронений и катастроф, анализ древней ДНК) нередко приходится сталкиваться с такими проблемами как малое количество ДНК, ее деградация, загрязнение, наличие ингибирующих агентов и фоновой ДНК. Для каждого из перечисленных случаев необходимы специфические способы преодоления ложно-негативных и/или ложно-позитивных результатов, поскольку нарушения ПЦР-амплификации вызваны разными причинами, среди которых отдельной группой выступает ингибирование ПЦР.
Очевидно, что многие ингибиторы подавляют процесс амплификации посредством механического торможения, препятствуя взаимодействию между ДНК и полимеразой, ДНК и праймерами или препятствуя полноценному росту цепи до образования полноразмерных продуктов амплификации даже в случае успешного отжига праймеров. Мы предположили, что одним из путей решения проблемы ингибирова-ния является использование максимально сближенных праймеров, 3'-концы которых расположены встык друг другу. В этом случае вероятность наработки целевых полноразмерных продуктов реакции
Таблица 1
Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе_
Организм Прай-мер Последовательность, 5'^3' Длина прай-мера, нт Длина ам-пликона, п.н. Тотж., оС Номер в GenBank
MR F TTAAGGATCGTTTCGACGGAGCATC 25 252 58.8
Mantis relig- MR R CTGTCGTCCATGCGTTCCCT 20 59.8
iosa MR aF TCCAGCTCAAACCCTACAACCC 22 46 59.2
MR aR TGACTCCTGGAGGTTTGTGATCC 23 58.5
LS F TTAGCCGCTTGCATCCTC 18 253 55.3
Larix LS R CAAGAAGATGAGCGAAACAACAAC 24 54.9
sukaczewii LS aF TTGACGGGAGAGTGGTTG 18 37 54.5
LS aR CGAACGGTTGCACATCCTG 19 56.8
FJ802922.1
EU441982.1
ISSN 1998-4812
Вестник Башкирского университета. 2017. Т. 22. №4
1019
возрастает в разы, поскольку полимераза успевает нарабатывать целевые полноразмерные продукты реакции.
Для проверки этого предположения нами были подобраны по 2 пары праймеров к ДНК лиственницы сибирской и богомола обыкновенного: одна пара - праймеры «встык» (aF-aR), вторая - «классические» (F-R) праймеры с расстоянием между праймерами более 200 нуклеотидов (рис. 1). Данные пары праймеров были использованы в ПЦР с препаратами ДНК, содержащими ингибирующие агенты.
Рис. 1. Схема расположения мест отжига «классических» прямого и обратного праймеров (F-R) и праймеров «встык» (aF-aR).
В первом случае была взята ДНК лиственницы - хвойного дерева с высоким содержанием феноль-ных и смолистых соединений. Полифенолы являются широко распространенным классом растительных компонентов, состоящих из ряда кислот и их производных, характеризующиеся высокой ПЦР-ингибирующей способностью.
Количественная амплификация с ДНК лиственницы Сукачева, выделенной ЦТАБ-методом, и прай-мерами к высококопийной последовательности внутреннего транскрибируемого спейсера 1 (ITS1) эффективно протекала только для праймеров «встык» (рис. 2). В то же время при использовании в ПЦР препарата ДНК лиственницы, выделенной с помощью коммерческого набора, ингибирование не наблюдалось (данные не приведены). При амплификации ДНК, выделенной из богомола, подобная проблема не возникала при тех же условиях реакции.
ПЦР с классической парой праймеров (LS F -LS R) полностью ингибируется, подъем флуоресценции отсутствовал даже к 60 циклу реакции. Не наблюдалось накопления даже неспецифических продуктов реакции. Полное отсутствие ПЦР продуктов для традиционных праймеров свидетельствовало об ингибировании реакции. Учитывая высокую копийность последовательности ITS1, полученные данные демонстрируют очень низкую эффективность ПЦР с классическими праймерами.
Во втором случае, при постановке ПЦР с ДНК богомола обыкновенного в реакционную среду добавляли различное количество плазмы человеческой крови, содержащей 1.2 мкМ гема в ПЦР-смеси и оценивали ее влияние на протекание реакции (рис. 3).
праймеры классические
«встык» праймеры
Рис. 3. Электрофореграмма результатов амплификации с добавлением в ПЦР-смесь плазмы крови человека, содержащей гем (12 мкМ): 1 - контроль без ДНК и без плазмы, 2 - контроль без плазмы, 3-0.1% плазмы (об.), 4-1%, 5-10%.
Гем - продукт распада гемоглобина, приводит к уменьшению скорости ПЦР [10], при этом добавление Taq-полимеразы не уменьшает ингибирова-ние гемом, а добавление магния увеличивает его [11]. При содержании плазмы 0.1% ингибирования амплификации не наблюдалось ни для праймеров
О 10 20 30 40 50 60 45 55 65 75 85 95
cycles Т, °С
Рис. 2. Ингибирование ПЦР с ДНК лиственницы Сукачева (Ь. sukaczewii) (каждый образец представлен в трех повторах): кривые 1-3, 7-9 - опытные образцы; кривые 4-6, 10-12 - отрицательные контроли; кривые 1-6 - праймеры «встык» (LS aF-LS аЯ); кривые 7-12 - классические праймеры (LS F-LS R). A - профили амплификации; Б - кривые плавления ампликонов.
«встык», ни для «классических» праймеров, при содержании плазмы 10% происходит полное ингиби-рование реакции для обоих пар праймеров. В случае 1%-го содержания плазмы выявлено ингибирование только для стандартных праймеров, тогда как для праймеров «встык» наблюдалась успешная наработка целевых продуктов амплификации.
Таким образом, нами были сконструированы по две модельные пары праймеров («встык» aF-aR и традиционные F-R) к ДНК лиственницы и ДНК богомола обыкновенного. Все пары праймеров были использованы в ПЦР с препаратами ДНК, содержащими инги-бирующие агенты: полифенолы и смолистые соединения (ДНК лиственницы) и плазму крови человека (ДНК богомола обыкновенного). Было показано, что праймеры "встык" обеспечивают уверенную амплификацию ДНК в условиях, при которых праймеры с традиционным расположением не приводят к положительному результату, что объясняется меньшей чувствительностью ПЦР-системы к ингибиторам.
Работа выполнена на оборудовании ЦКП «Био-мика» и УНУ «КОДИНК».
ЛИТЕРАТУРЫ
1. Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions // Biotechnology. 1993. V. 11. P. 1026-1030.
2. Gingeras T. R., Higuchi R., Kricka L. J., Lo Y. M., Wittwer C. T. Fifty years of molecular (DNA/RNA) diagnostics // Clin. Chem. 2005. V. 51. P. 661-671.
3. Kontanis E. J., Reed F. A. Evaluation of real-time PCR amplification efficiencies to detect PCR inhibitors // J. Forens. Sci. 2006. V. 51. P. 795-804.
4. Чемерис А. В., Чемерис Д. А., Магданов Э. Г., Гарафутди-нов Р. Р., Нагаев Н. Р., Вахитов В. А. Причины ложно-негативной ПЦР и недопущение некоторых из них // Биомика. 2012. Т. 4. С. 31-47.
5. Hofreiter M., Shapiro B. Ancient DNA: Methods and Protocols // Humana Press Incorporated. 2012.
6. Гарафутдинов Р. Р., Галимова А. А., Сахабутдинова А. Р., Вахитов В. А., Чемерис А. В. ПЦР-амплификация ДНК с помощью праймеров «встык» // Мол. биол. 2015, Т. 49, №4, С. 628-637.
7. Doyle J. J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. bull. 1987. V 19. P. 11-15.
8. Garafutdinov R. R., Galimova А. А., Sakhabutdinova А. R. Pol-ymerase chain reaction with nearby primers // Anal. Biochem. 2017. V. 518. P. 126-133.
9. Ахрем А. А., Андреюк Г. М., Кисель М. А. Способ определения концентрации гемоглобина в крови // Патент 1386901. СССР. 1986.
10. Akane A., Matsubara K., Nakamura H., Takahashi S., Kimura K. Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification // J. Forens. Sci. 1994. V. 39. P. 362-372.
11. Opel K. L., Chung D., McCord B. R. A Study of PCR Inhibition Mechanisms Using Real Time PCR // J. Forens. Sci. 2010. V. 55. P. 25-33.
Поступила в редакцию 02.08.2017 г.
ISSN 1998-4812
BeciHHK EamKHpcKoro yHHBepcHTeTa. 2017. T. 22. №4
1021
POLYMERASE CHAIN REACTION WITH ABUTTING PRIMERS IN THE PRESENCE OF INHIBITORS
© A. A. Galimova*, А. R. Sakhabutdinova, R. R. Garafutdinov
Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Scientific Center, RAS 71 Oktyabrya Avenue, 450054 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.
Phone: +7 (347) 235 60 88.
*Email: aiz.galimova@yandex. ru
Polymerase chain reaction (PCR) as one of the most used methods for biomedical research is constantly undergoing changes related to the need to solve new problems. To ensure the reliability of PCR results, it is necessary to comply with the quality requirements of the reaction components, in particular, the target DNA. Amplified DNA often contains PCR inhibitors. The authors of the work show the differences in efficiency of amplification DNA in PCR with endpoint and real-time detection using abutting primers compared to primers with a traditional arrangement, when inhibitors are present in the PCR mixture. It was found that the use of abutting primers provides less sensitivity of the PCR system to inhibitors.
Keywords: polymerase chain reaction, abutting primers, PCR inhibitors, heme, phenolic compounds, specificity.
Published in Russian. Do not hesitate to contact us at bulletin_bsu@mail.ru if you need translation of the article.
REFERENCES
1. Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R. Biotechnology. 1993. Vol. 11. Pp. 1026-1030.
2. Gingeras T. R., Higuchi R., Kricka L. J., Lo Y. M., Wittwer C. T. Clin. Chem. 2005. Vol. 51. Pp. 661-671.
3. Kontanis E. J., Reed F. A. J. Forens. Sci. 2006. Vol. 51. Pp. 795-804.
4. Chemeris A. V., Chemeris D. A., Magdanov E. G., Garafutdinov R. R., Nagaev N. R., Vakhitov V. A. Biomika. 2012. Vol. 4. Pp. 31-47.
5. Hofreiter M., Shapiro B. Humana Press Incorporated. 2012.
6. Garafutdinov R. R., Galimova A. A. Mol. biol. 2015, T. 49, No. 4, Pp. 628-637.
7. Doyle J. J. Phytochem. bull. 1987. V 19. Pp. 11-15.
8. Garafutdinov R. R., Galimova A. A. Anal. Biochem. 2017. Vol. 518. Pp. 126-133.
9. Akhrem A. A., Andreyuk G. M., Kisel' M. A. Patent 1386901. SSSR. 1986.
10. Akane A., Matsubara K., Nakamura H., Takahashi S., Kimura K. J. Forens. Sci. 1994. Vol. 39. Pp. 362-372.
11. Opel K. L., Chung D., McCord B. R. J. Forens. Sci. 2010. Vol. 55. Pp. 25-33.
Received 02.08.2017.
