CC BY
202
ТОМ 5 • НОМЕР 4 • 2012
КЛИНИЧЕСКАЯ
ОНКО ГЕМАТОЛОГИЯ
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ
Протеинкиназа Pim-1:
мишень противоопухолевой терапии?
Л.Л. ТютюнникА.А. Штиль2
Pim-1 protein kinase: a target for antitumor therapy?
РЕФЕРАТ
L.L. Tyutyunnik1 2, A.A. Shtil2 SUMMARY
Targeted anticancer therapy presumes inactivation of proteins critical for carcinogenesis and viability of tumor cells. The serine/threonine protein kinases Pim represent a family of proteins with pro-proliferative and pro-survival functions. These protein kinases are activated in hematological malignancies; therefore, inhibition of Pim kinases can increase the therapeutic efficacy. This review analyzes the molecular mechanisms of regulation of tumor cell growth and survival in transformed blood cells by Pim-1, a major protein in the family. We discuss the structure of Pim-1 at the atomic resolution and the chemical groups important for the formation of stable complexes with the inhibitors. Also, we analyze the chemical classes of low molecular weight Pim-1 antagonists. These data provide the basis for the design of clinical inhibitors of Pim-1 as perspective drugs for treatment of hematological malignancies.
Keywords: hematological malignancies, Pim family protein kinases, protein kinase inhibitors, intracellular signaling, antitumor chemotherapy.
1 M.V. Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Technologies, Moscow
2 N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow Контакты: [email protected]
Принято в печать: 2 ноября 2012 г.
Принцип таргетной терапии опухолей — воздействие на белки, функции которых состоят в формировании и поддержании злокачественного фенотипа. Серин-треониновые протеинкиназы Pim — одно из семейств белков, активность которых способствует пролиферации и выживанию нормальных и опухолевых клеток. Протеинкиназы семейства Pim активированы при онкогематологических заболеваниях. Следовательно, ингибирование этих белков может увеличить эффективность противоопухолевого воздействия. Рассмотрены молекулярные механизмы регуляции пролиферации и выживаемости опухолевых клеток (главным образом, на моделях трансформированных клеток крови) с участием протеинкиназы Pim-1 — основного представителя семейства. Приведен детальный анализ структуры Pim-1, указаны химические группы, важные для образования устойчивых комплексов с ингибиторами, и рассмотрены химические классы низкомолекулярных соединений — антагонистов Pim-1. Эти данные могут служить основой для создания ингибиторов Pim-1 — лекарственных средств, перспективных для лечения опухолей кроветворной и лимфоидной тканей.
Ключевые слова:
онкогематологические заболевания, протеинкиназы семейства Pim, ингибиторы протеинкиназ, внутриклеточные сигналы, противоопухолевая химиотерапия.
ВВЕДЕНИЕ
Современные представления о молекулярных механизмах развития злокачественных опухолей существенно изменили стратегии лечения больных. Накопление обширного массива информации о многочисленных молекулах и межмолекулярных взаимодействиях в опухолевых клетках способствовало становлению нового терапевтического подхода — направленного фармакологического воздействия на мишени, важные для выживания и прогрессии опухолей. Этот подход — таргетная терапия — существенно дополняет прежние режимы противоопухолевого медикаментозного лечения.
Онкогематология — один из разделов онкологии, в котором знания о молекулярных событиях и таргетная терапия развиваются наиболее интенсивно. В настоящее время трудно представить создание новых лекарственных средств в онкогематологии без детального указания их внутриклеточной мишени (мишеней) и молекулярного механизма противоопухолевого действия. Особое место среди указанных мишеней занимают белки, функции которых направлены на поддержание злокачественного фенотипа клеток системы крови, в частности, их неконтролируемой пролиферации и выживания при действии лекарств. Новая терапевтическая стратегия предполагает, что
1 ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова», Москва
2 ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
287
Л.Л. Тютюнник, А.А.Штиль
инактивация таких белков снизит способность опухолевых клеток «ускользать» от воздействий противоопухолевых препаратов и повысит чувствительность опухоли к препаратам. В настоящем обзоре обобщены результаты исследований протеинкиназы Pim-1 — вероятной мишени новых лекарственных средств для таргетной терапии опухолей кроветворной и лимфоидной тканей. В качестве прототипов таких лекарств исследованы разнообразные классы низкомолекулярных химических соединений, как известных, так и новых.
Pim-1: РОЛЬ В ОНКОЛОГИИ. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О СТРУКТУРЕ И ФУНКЦИЯХ
Семейство протеинкиназ Pim-1 (Proviral Integration site for the Moloney murine leukemia virus) представлено сходными по структуре и функциям изоформами Pim-1, Pim-2 и Pim-3. В данном обзоре представлен анализ протеинкиназы Pim-1 как наиболее важной для создания противоопухолевых лекарственных средств. Согласно данным рентгеноструктурного анализа [1], в молекуле Pim-1 можно выделить две части: N-концевую, состоящую из антипараллельных ^-слоев, и С-концевую, представленную а-спиралями (рис. 1). Эти части соединены петлей («шарниром», аминокислотные остатки 121 — 126) с общей для всех изоформ консенсусной последовательностью ERPXPX (Glu-Arg-Pro-X-Pro-X, где Х — любой аминокислотный остаток), уникальной для семейства белков (у Pim-1 эта последовательность представлена аминокислотными остатками Glu-Arg-Pro-Glu-Pro-Val).
Pim-1 экспрессируется в нормальных и злокачественных клетках. Важно, что эта протеинкиназа высокоактивна во многих линиях клеток, полученных из лимфоидных и миелоидных злокачественных опухолей [2—5]. Отмечена и повышенная активность Pim-1 в опухолях предстательной железы [6, 7], области головы и шеи [8, 9], желудка [10, 11].
Pim-1 является протеинкиназой стрессового ответа и регулируется цитокинами [12], факторами роста [13],
гормонами [14], в условиях ишемии [15] и гипоксии [16], а также инфекционными агентами: вирусом Эпштейна— Барр [17] и Helicobacter pylori [18].
Важная особенность протеинкиназ Pim — наличие в области петли донора и акцептора водородных связей, что обусловливает взаимодействия с атомом N1 и группой NH2 аденина АТФ. Хотя Pim-1 предоставляет акцептору кислород карбонильной группы остатка Glu121, у протеинкиназы отсутствует амидная группа, необходимая для формирования водородной связи с N1 аденина. Кроме того, Pim-1 имеет более длинную область петли, чем другие протеинкиназы, поэтому петля выходит за пределы АТФ-связывающей области и АТФ-связывающий карман расширяется в горизонтальном направлении. Следовательно, в комплексе Pim-1-АМФ —пуриннуклеотидфосфорилаза (ПНФ) образуется единственная водородная связь между атомом кислорода карбонильной группы Glu121 и одним атомом водорода аминогруппы аденина. Другая область, важная для связывания АМФ —ПНФ, представляет собой полярный фосфатсвязывающий карман, содержащий остатки Lys67, Glu89 и Asp 186, которые образуют водородные связи. Указанные детали молекулярной структуры белка важны при создании ингибиторов для использования в клинике (см. ниже).
В отличие от других серин-треониновых протеинкиназ, таких как митоген-активированные протеинкиназы, протеинкиназы А, B и С, фосфотрансферазная активность Pim-1 не требует инициации другими протеинкиназами. Протеинкиназы Pim не имеют регуляторного домена; кристаллографические данные позволяют считать, что эти протеинкиназы постоянно находятся в активированной форме [19]. Анализ кристаллической структуры Pim-1 показал, что фосфорилирование Pim-1 не является необходимым для регуляции ее каталитической активности, но способствует ее стабильности [19]. Итак, Pim-1 фосфорилирует и посредством этого биохимического механизма регулирует функции многих белков, активных
Рис. 1. Структура протеинкиназы Pim-1 (по [1] с изменениями)
288
Клиническая онкогематология
Протеинкиназа Pim-1
Фосфорилирование
Ингибирование
апоптоза
Рис. 2. Увеличение экспрессии Pim-1 вызывают цитокины, тепловой шок, активные формы кислорода, гормоны, гипоксия. Высокая активность Pim-1 обусловливает фосфорилирование белка Bad по остатку Ser112 и инактивацию этого проапоптотического белка. Pim-1 может также фосфорилировать и инактивировать проапоптотические белки ASK1 и FOXO3а (по [23])
при митозе, дифференцировке и программированной гибели (апоптоз) клеток [20—22].
Pim-1: защита клеток от гибели (антиапоптотическая функция)
Активность протеинкиназы Pim-1 способствует выживанию клеток (рис. 2).
Первоначально было отмечено, что гиперэкспрессия Pim-1 защищает клетки от апоптоза, индуцированного воздействием стрессовых факторов, например, декса-метазона [24] или в результате удаления из питательной среды факторов роста [25]. Молекулярное обоснование роли Pim-1 в выживании клеток оставалось неясным. Ключевыми оказались эксперименты с интерлейкин-3 (ИЛ-З)-зависимыми миелоидными клетками [26]. При удалении этого фактора роста из среды, в которой культивировали ИЛ-З-зависимые миелоидные культуры, преимущественно выживали клетки с высокой экспрессией Pim-1 по сравнению с клетками, не экспрессирующими эту протеинкиназу. Выживание клеток связано с поддержанием трансмембранного потенциала митохондрий (Дф ) и количеством мРНК антиапоптотического митохондриального белка Bcl-2. При отсутствии экспрессии Pim-1 в клетках снижается Дф в ответ на «голодание» по ИЛ-3 и транскрипция Bcl-2, а также увеличивается продукция активных форм кислорода.
Один из молекулярных механизмов, способствующий выживанию клетки (в частности, В-лимфоцитов), основан на взаимодействии Pim-1 с белком Bad, проапоптотическим представителем семейства Bcl-2 (см. рис. 2). Pim-1 фосфо-рилирует Bad по остатку Ser112, что приводит к инактивации Bad из-за его связывания с белками 14-3-3 и задержкой комплекса фосфо-Bad—14-3-3 в цитоплазме [27, 28]. Если Bad не фосфорилирован, он может образовывать димеры и с Bcl-2, и с Bcl-xL — антиапоптотическими белками внешней митохондриальной мембраны [29]. В интактных клетках Bcl-2 и Bcl-xL формируют комплексы с митохондриальным белком Bax, нейтрализуя его проапоптотическую функцию [30]. Нефосфорилированный Bad, связываясь с Bcl-2 и Bcl-xL, высвобождает Bax из комплексов с белками — ингибиторами гибели клеток. Свободный Bax образует гомодимеры, формирующие поры в мембране митохондрий, через которые выходит цитохром С в цитоплазму — важнейшее событие при апоптозе [31].
Таким образом, фосфорилирование белка Bad протеинкиназой Pim-1 способствует выживанию клеток, ингибируя митохондриальный путь апоптоза (рис. 3).
Pim-1 фосфорилирует проапоптотический транскрипционный фактор FOXO3a [32]. Этот механизм вызывает перемещение FOXO3a из ядра в цитозоль и проте-
олиз с участием убиквитин-зависимой лигазы Mdm2 [33]. Деградация FOXO3a способствует выживанию клетки.
Pim-1 также фосфорилирует Mdm2, что приводит этот белок в активное состояние. Mdm2 гиперэкспрес-сирован при остром лимфобластном лейкозе [34], неходжкинских лимфомах [35], раке молочной железы [36] и толстой кишки [37, 38]. Функция Mdm2 состоит в деградации проапоптотического белка р53. Результатом активации р53 служит остановка клеточного цикла и апоптоз [39]. Таким образом, Pim-1-зависимая активация Mdm2 способствует выживанию клеток благодаря устранению важного проапоптотического механизма.
Другим регулятором Mdm2-зависимого разрушения р53 выступает опухолевый супрессор ARF. Связываясь с Mdm2, ARF подавляет его убиквитин-лигазную активность, что вызывает активацию р53.
Модели взаимодействия Pim-1 с Mdm2 и р53 представлены на рис. 4. Механизм 1 заключается в том, что Pim-1 фосфорилирует убиквитинлигазу Mdm2, активируя ее. При этом фосфорилирование не затрагивает локализацию Mdm2. Механизм 2: связывание Mdm2 с p53 и деградация р53. В случае увеличения уровня ARF
Apaf — белок-активатор протеаз; CAD — ДНКаза, активируемая каспа-зой; Cyto с — цитохром с; FADD — белок, образующий комплекс с «рецепторами смерти» Fas; Bid, Bcl-XL, Bax, NOXA — белки семейства Bcl-2
wwwmedprint.ru
289
Л.Л. Тютюнник, А.А.Штиль
протеосома
Рис. 4. Взаимодействие Pim-1, Mdm2 и р53 (по [40])
(механизм 3) независимо от фосфорилирования комплекс Mdm2—ARF—p53 не транспортируется из ядра и р53 не разрушается. При взаимодействии Mdm2 и Pim-1 (механизм 4) формируется устойчивый комплекс, защищающий Mdm2 и Pim-1 от протеолиза.
РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
При идентификации белков, фосфорилируемых протеинкиназой Pim-1, выявлены белки, функции которых состоят в регуляции клеточного цикла. Фосфатаза Сdc25A — позитивный регулятор клеточного цикла; Pim-1 связывается с Сdc25A, в результате чего фосфатаза подвергается фосфорилированию и ускоряется переход из фазы G1 в фазу S [41]. Cdc25A и с-TAKd функционируют и при переходе из фазы G2 в митоз. Белок с-TAK! — протеинкиназа, ингибирующая фосфатазу Cdc25C [42, 43], которая, в свою очередь, является позитивным регулятором перехода G2/M. Белок с-TAK! фосфорилируется протеинкиназой Pim-1 [44]. По-вцдимому, Pim-1 может регулировать оба белка, что приводит в случае с с-ТАК1 к инактивации, а в случае с Cdc25C — к активации. Эти события позволяют клетке перейти из фазы G2 в митоз (рис. 5).
Высокая активность Pim-1 обусловливает фосфорилирование и инактивацию белков p21 c1p1/WAF1 и p27Klp1, что способствует переходам G1/S и G2/M [45—47]. Это происходит за счет частичного ингибирования связы-
Рис. 5. Схема клеточного цикла. Указаны белки, регулируемые при участии Pim-1
вания ядерного белка пролиферирующих клеток PCNA с p21Cip1/WAF1 [48]. Диссоциация PCNA от p21Cip1/WAF1 в ядре восстанавливает синтез ДНК и снижает точность восстановления ДНК, что может привести к мутациям (рис. 6). Возможно, в этом состоит причина хромосомной нестабильности, наблюдаемой в клеточных линиях, экспрессирующих Pim-1 [49]. Pim-1 фосфорилирует белок NuMA (Nuclear Mitotic Apoptosis protein), участвующий в организации веретена деления в фазе митоза — события, необходимого для пролиферации клеток [50].
ПРОТЕИНКИНАЗЫ Pim В ОНКОГЕМАТОЛОГИИ
Из вышеизложенного следует, что протеинкиназы семейства Pim имеют важное значение в биологии опухолевой клетки. Особое место занимает вопрос о значении Pim-1 в онкогематологии. Установлена связь активности протеинкиназ Pim с Myc-индуцированным лимфомогенезом [51]. Нарушения функций онкобелка Мус выявлены при агрессивно протекающих опухолях из В-клеток: диффузной В-крупноклеточной и плазмобластной лимфомах, а также при лимфоме Беркитта [52]. Онкобелок Myc функционирует как транскрипционный фактор, регулирующий экспрессию ряда важных для опухолевой клетки генов, в частности гена, кодирующего протеинкиназу Pim-3 [53]. Pim и Мус кооперируют, вызывая злокачественную трансформацию В-клеток [54]. Важна и способность протеинкиназ семейства Pim минимизировать гибель клеток с высоким уровнем Мус [53].
Таким образом, инактивация протеинкиназ семейства Pim представляется обоснованной как терапевтическая стратегия в онкогематологии.
Область фосфорилирования Pim-1
і
PKRRQTS
p21 |
PCNA
t
Увеличение эффективности синтеза ДНК, но снижение точности при синтезе, что приводит к мутациям
PKRRQTS
p21
4
PCNA
I
Снижение эффективности, но повышение точности синтеза ДНК
Рис. 6. Роль Pim-1 в контроле целостности ДНК
290
Клиническая онкогематология
Протеинкиназа Pim-1
Таблица 1. Показатели IC50 флавоноидов — ингибиторов Pim-1
______________Соединение________________________IC50, мкМ
R2
Кд О
1. Кверцетин (quercetin) R2 = R4 = OH, R, = R3 = H 0,043
2. Физетин (fisetin) 0,85
R2 = OH, R, = R3 = R4 = H
3. Кэмпферол (kaempferol) Ф3
R4 = OH, R, = R2 = R3 = H
4. Мирицетин (myricetin) 0,78
r2 = R3 = R4 = OH, R, = H
R.1
5. Кверцетагетин (quercetagetin) 0,34
R, = R3 = R4 = R5 = OH, R2 = R6 = H
6. Госсипетин (gossypetin) 0,43
R, = R3 = R4 = R6 = OH, R2 = R5 = H
7. Апигенин (apigenin) R4 = OH, R, = R2 = R3 = R5 = H 0,94
8. R, = R2 = R4 = OH, R3 = R5 = R6 = H 0,65
9. R = OH, R = R = R = R = R = H 0,98
ПРИМЕЧАНИЕ. Для соответствия формирующейся русскоязычной номенклатуры международным стандартам в таблице и тексте приведены русские и английские названия новых соединений.
Ингибиторы протеинкиназы Pim-1
Низкомолекулярные ингибиторы протеинкиназ семейства Pim представляют многочисленные химические
классы. Для анализа свойств и создания эффективных ингибиторов Pim-1 наиболее важны область петли и аденозинсвязывающий карман [55, 56] (см. рис. 1). Во взаимодействии с ингибитором участвуют аминокислотные остатки АТФ-связывающего кармана [57].
Флавоноиды — соединения полифенольной природы (производные дифенилпропана) — первые изученные ингибиторы Pim-1. Наиболее значимые результаты получены для соединений 1 — 6 (табл. 1), вызывавших почти полное ингибирование активности протеинкиназы в концентрации 1 мкM [58]. Кверцетин (quercetin, 1) и физетин (fisetin, 2) показали наиболее высокую ингибиторную способность. В модели, предложенной для комплекса физетин—Pim-1, карбонильная группа Glu121 области петли предоставляет гидроксильную группу. Это взаимодействие завершается формированием водородных связей между двумя гидроксильными группами фенильного кольца и остатков Lys67, Glu89 и Asp186, а также водородной связи между гидроксильной группой в положении C-7 и Asp128. Дальнейшие исследования флавоноидов привели к открытию кверцетагетина (quercetagetin, 5) (IC50 0,34 мкМ), превосходящего физетин (2) (см. табл. 1) [59].
Определены кристаллические структуры Pim-1 в комплексе с кверцетином (1) и кверцетагетином (5). Оба ингибитора принимают конформацию, в которой фенильное кольцо в положении C-2 ориентируется внутри АТФ-связывающего кармана. В случае кверцетина (5) гидроксильная группа в положении 3 создает водородную связь с атомом кислорода карбоксильной группы Glu121 (рис. 7).
Рис. 7. Кристаллические структуры Pim-1 в комплексах с кверцетином (1) (А) и кверцетагетином (5) (Б). Красным обозначены атомы кислорода, синим — атомы азота (по [59])
www.medprint.ru
291
Л.Л. Тютюнник, А.А.Штиль
Рис. 8. Соединение 10 LY-294002
Соединение 10 LY-294002 (рис. 8) отличается от флавоноидов наличием в положении C-2 морфолиние-вого заместителя [60].
Это соединение несет дополнительную фенильную группу при положении C-8 и не содержит гидроксильные группы, важные для ингибирования Pim-1 флавоноидами. Атомная структура комплекса LY-294002 с Pim-1 показала, что ориентация ингибитора в АТФ-связывающем кармане существенно отличается от таковой в комплексе LY-294002 с другими протеинкиназами [61] из-за сте-рических препятствий, вызванных структурой остатка Pro123. Фенильная и морфолиновая части располагаются за пределами АТФ-связывающего кармана, образуются гидрофобные взаимодействия с остатками Arg122, Val126, Leu174 и Ph49.
Некоторые производные индолокарбазола и бис-индолилмалеимида проявляют ингибиторную способ -ность к протеинкиназам, в частности, служат антагонистами Pim [62]. M.D Jacobs и соавт. обнаружили, что соединения стауроспорин, K252a, Bim-1 и Bim-9 (табл. 2) ингибируют Pim-1 в наномолярных концентрациях [63].
E. Meggers и соавт. разработали серию органометаллических соединений с низкой наномолярной ингибиторной активностью (табл. 3) [64]. Общими в структуре этих соединений являются плоские гетероциклические матрицы — бидентатные лиганды рутения (лиганд за-
Таблица 2. Показатели IC50 производных индолокарбазола и бис-индолилмалеимида
Соединение IC50, мкМ
11.Стауроспорин
13. Bim-1
R, = -(CH2)3-NMe2, R2 = Me
14. Bim-9
R, = -(CH2)3-S-(C = NH)-NH2, R2 = H
0,01
0,15
0,15
0,01
нимает два координационных места атома рутения). Гетероциклическая часть может взаимодействовать с АТФ-связывающим карманом, тогда как остальная часть комплекса замещает рибозу кармана. Исследования этих металлоорганических комплексов как ингибиторов протеинкиназ показали, что рацемическая (равное соотношение оптических изомеров) смесь соединений 16 и 17 является высокоактивным ингибитором GSK3 [65]. Кроме ингибирования этой протеинкиназы соединения 16 и 17 подавляли Pim-1 в наномолярных концентрациях [66]. Так, (S)-17 проявлял высокую активность по отношению к Pim-1 (IC50 0,22 нМ). Рацемический аналог (R, S)-16 был протестирован на панели из 57 протеинкиназ; оказалось, что Pim-1 и GSK3 были единственными мишенями, ингибированными при IC50 < 50 нМ.
Для проявления высокой ингибиторной способности важно наличие в комплексе атома рутения. Например, соединение 15 (рис. 9), не содержащее Ru, проявляет низкую активность по сравнению с соединением 18.
Таблица 3. Показатели IC50 органометаллических комплексов
_____________Соединение__________________________IC50, нM
В
Г
16. R3 = R2 = R3 = H 3
(R,S)-16 25
(R)-16 2,5
(S)-16
17. R3 = OH, R2 = R3 = H 0,22
18. R, = OH, R, = Br, R = CO,Me
(R)-18 35
(S)-18 3
19. M = Ru, R3 = -(C = O)NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-OH,
R2 = R3 = H 0,5
20. M = Ru, R3 = -(C = O)-W-D-Ala-CO2H, R2 = R3 = H 4
(S)-22
0,6
0,3
0,45
292
Клиническая онкогематология
Протеинкиназа Pim-1
Таблица 6. Показатели IC производных пирроло[2,3-а]карбазола
Соединение ICa, нМ
30. R = H 120
31. R = Br 6,8
Рис. 9. Структура соединения 15
Рис. 10. Общая формула соединений 23-25
Также исследованы новые ингибиторы — производные пирроло[2,3-а]карбазола (табл. 6) [68, 69]. Соединения 30 и 31 (рис. 11) проявили ингибиторную активность в субмикромолярном диапазоне концентраций. Замещение в соединении 31 на атом брома при С-6 усилило ингибирующую активность до наномолярных
Таблица 4. Показатели IC50 производных имидазо[1,2-Д]пиридазина концентраций. Кроме того, соединение 30 показало
Соединение IC50, мкМ высокую селективность по отношению к 66 другим про-
23. R1 = циклопропилметил, R2 = ацетил, R3 = H 0,12 теинкиназам.
24. R1 = тетрагидропиран-4-ил, R2 = Cl, R3 = H 0,05 F. Sliman и соавт. сообщили о производных
25. R1 = 1-(гидроксиметил)пропил, R2 = Cl, R3 = F 0,04 7-карбокси-8-гидроксихинолина, проявивших высокую
A.N. Bullock и соавт. установили, что производные имидазо[1,2-$]пиридазина являются эффективными ингибиторами Pim-1 [58]. Так, соединения 23—25 (ими-дазо[1,2- ^]пиридазин-6-амины; рис. 10) ингибировали активность Pim-1 в концентрации менее 1 мкM (табл. 4).
Усилия по идентификации соединений, способных ингибировать одновременно Pim-1, Pim-2 и Pim-3, привели к созданию производных бензотиенопиримидинона (табл. 5) [67]. Соединение 29 проявляет наиболее высокую ингибирующую способность по отношению к Pim-1. Некоторые соединения этого ряда показали антипролиферативную активность на линиях промиелоцитарного лейкоза K562, острого миелоидного лейкоза MV4—11 и ингибировали Pim-1-зависимое фосфорилирование Bad в линиях K562 и аденокарциномы предстательной железы LnCAP.
Таблица 5. Показатели IC производных бензотиенопиримидинона
Соединение
IC^n, нМ
26
130
ингибиторную способность в субмикромолярном диапазоне концентраций (табл. 7) [70]. Из этих производных соединение 34 (рис. 12) — наиболее активное.
Обобщая особенности химической структуры, важные для ингибирования Pim-1, следует отметить, что у большинства ингибиторов присутствует плоское ядро, взаимодействующее с АТФ-связывающим карманом протеинкиназы. Согласно исследованиям кристаллической структуры белка, АТФ-связывающий карман Pim-1 содержит гидрофобные остатки (Leu44, Phe49, Val52, Ala65, Ile104, Leu120, Val126 и Ile185), в которых могут устанавливаться контакты с ингибитором. В дополнение к этим гидрофобным взаимодействиям важным требованием для высокой эффективности является включение ингибитора в водородную сеть в полярной области, содержащей остатки Lys67, Glu89 и Asp186. В соответствии с этим ингибиторы формируют водородную связь с остатком Lys67. Однако, если фрагмент аденина из АМФ—ПНФ создает уникальные водородные связи в области петли с атомом кислорода карбонильной группы Glu121, многие ингибиторы Pim-1 не используют Glu121 и не имеют доноров O-H или N-H в этой области. Таким
Таблица 7. Показатели IC50 производных 7-карбокси-8-гидроксихинолина
50
Соединение IC50, мкМ
32. X = (E)-CH = CH, R, = R3 = H, R2 = R4 = OH 0,4
33. X = (E)-CH = CH, R, = R4 = H, R2 = OH, R3 = OMe 0,5
34. X = CONHCH2, R. = R3 = OH, R,“ R4 = H 0,2
28. R1 = (Е)-2-циклопропилвинил, R2 = NMe2
1
0,7
Рис. 12. Общая формула соединений 32-34
29. R1 = 4-OH-Ph, R2 = NMe2
wwwmedprint.ru
293
Л.Л. Тютюнник, А.А.Штиль
образом, формирование водородной связи с Glu121 вряд ли необходимо для ингибирующей активности.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Новые факты о молекулярных механизмах важнейших биологических процессов — пролиферации, опухолевой трансформации, выживания клеток — позволили обосновать гипотезу таргетной противоопухолевой терапии как рационального, основанного на идентификации механизма (механизмов) подхода к определению тактики лечения больных. Указанный подход доминировал в исследованиях на рубеже столетий и в последующие годы. Анализ достижений и ограничений таргетного принципа — важнейшая задача, выходящая за рамки данной статьи. Основная проблема состоит в применении новых экспериментальных знаний в клинике.
Представленный выше анализ многочисленных функций протеинкиназ Pim обосновывает предположение о том, что ингибирование этих ферментов повысит эффективность химиотерапии. Действительно, установлена роль протеинкиназ семейства Pim как важных антиапоп-тотических сигнальных молекул. Следует ожидать, что и сами ингибиторы Pim, и их комбинации с традиционными противоопухолевыми препаратами будут вызывать гибель опухолевых клеток при минимальном повреждении неопухолевых. Вместе с тем первоначальные результаты применения ингибиторов Pim в клинике пока не дают оснований ожидать скорого внедрения таких препаратов в лечебную практику. Так, соединение SGI-1776 вызвало высокую общерезорбтивную токсичность у больных с неходжкинскими лимфомами; испытания препарата приостановлены (www.clinicaltrials.gov). На настоящем этапе развития таргетной химиотерапии опухолей знания и биотехнологические возможности еще недостаточны для обеспечения рационального конструирования клинических модуляторов белков-мишеней. Среди причин указанных трудностей можно отметить сложность регуляторных процессов в опухолевых клетках, возможность взаимодействия ингибитора с мишенью в нормальных клетках, ограниченность методов молекулярного моделирования, проблемы направленной доставки лекарственных веществ в опухоль и др. Проводимые в настоящее время доклинические испытания соединений-лидеров позволят определить их пригодность как ингибиторов Pim-1, перспективных в онкогематологии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kumar A., Mandiyan V., Suzuki Y. et al. Crystal structures of protooncogene kinase Pim1: a target of aberrant somatic hypermutations in diffuse large cell lymphoma. J. Mol. Biol. 2005; 348: 183-93.
2. Жукова Ю.Н., Алексеева М.Г., Захаревич Н.В., Штиль А.А, Даниленко
В.Н. Протеинкиназы семейства Pim: структура, функции и роль в патогенезе гемобластозов. Молек. биол. 2011; 45(4): 1-10.
3. His E.D., Jung S.H., Lai R. et al. Ki67 and PIM1 expression predict outcome in mantle cell lymphoma treated with high dose therapy, stem cell transplantation and rituximab: a Cancer and Leukemia Group B 59909 correlative science study. Leuk. Lymphoma 2008; 49: 2081-90.
4. Wallentine J.C., Kim K, Seiler C.E. III et al. Comprehensive identification of proteins in Hodgkin lymphoma-derived Reed-Sternberg cells by LC-MS/MS. Lab. Invest. 2007; 87: 1113-24.
5. Amson R, Sigaux F, Przedborski S. et al. The human protooncogene product p33pim is expressed during fetal hematopoiesis and in diverse leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 86: 8857-61.
6. Dhanasekaran S.M., Barrette T.R., Ghosh D. et al. Delineation of prognostic biomarkers in prostate cancer. Nature 2001; 412: 822-6.
7. Valdman A, FangX., Pang S.T. et al. Pim-1 expression in prostatic intraepithelial neoplasia and human prostate cancer. Prostate 2004; 60: 367-71.
8. Beier U.H., Weise J.B., Laudien M, Sauerwein H, Gorogh T. Overexpression of Pim-1 in head and neck squamous cell carcinomas. Int. J. Oncol. 2007; 30: 1381-7.
9. Peltola K, Hollmen M, Maula S.M. et al. Pim-1 kinase expression predicts radiation response in squamocellular carcinoma of head and neck and is under the control of epidermal growth factor receptor. Neoplasia 2009; 11: 629-36.
10. Reiser-Erkan C, Erkan M, Pan Z. et al. Hypoxia-inducible proto-oncogene Pim-1 is a prognostic marker in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Biol. Ther. 2008; 7: 1352-9.
11. Babel I., Barderas R, Diaz-Uriarte R. et al. Identification of tumor-associated autoantigens for the diagnosis of colorectal cancer in serum using high density protein microarrays. Mol. Cell Proteomics 2009; 8: 2382-95.
12. Aho T.L., Lund R.J., Ylikovski E.K. et al. Expression of human PIM family genes is selectively up-regulated by cytokines promoting T helper type 1, but not T helper type 2, cell differentiation. Immunology 2005; 116: 82-8.
13. Qian J., Nui J., Li M, Chiao P.J., Tsao M.S. In vitro modeling of human pancreatic duct epithelial cell transformation defines gene expression changes induced by K-ras oncogenic activation in pancreatic carcinogenesis. Cancer 2005; 65: 5045-53.
14. Rimon E, Sasson R, Dantes A, Land-Bracha A, Amsterdam A. Gonadotropin-induced gene regulation in human granulose cells obtained from IVF patients: modulation of genes coding for growth factors and their receptors and genes involved in cancer and other diseases. Int. J. Oncol. 2004; 24: 1325-38.
15. Barrier A., Olaya N, Chiappini F. et al. Ishemic preconditioning modulates the expression of several genes, leading to the overproduction of IL-1Ra, iNOS, and Bcl-2 in a human model of liver ischemia-reperfusion. FASEB J. 2005; 19: 1617-26.
16. Le Q.T., Denko N.C., Giaccia A.J. Hypoxic gene expression and metastasis. Cancer Metastasis Rev. 2004; 23: 293-310.
17. Rainio E.M., Ahlfors H, Carter K.L. et al. PIM kinases enhance EBNA2 activity. Virology 2005; 333: 201-6.
18. Sepulveda A.R., Tao H, Carloni E. et al. Screening of gene expression profiles in gastric epithelial cells induced by Helicobacter pylori using microarray analysis. Aliment. Pharmacol. Ther. 2002; 2: 14-57.
19. Qian K.C., Wang L, Hickey E.R. et al. Structural basis of constitutive activity and unique nucleotide binding mode of human PIM1 kinase. J. Biol. Chem. 2005; 280: 6130-7.
20. Aho T.L., Sandholm J., Peltola K.J. et al. Pim-1 kinase promotes inactivation of the proapoptotic Bad protein by phosphorylating it on the Ser112 gatekeeper site. FEBS Lett. 2004; 571: 43-9.
21. White E. The pims and outs of survival signaling: Role of the Pim-2 protein kinase in the suppression of apoptosis by cytokines. Genes Dev. 2003; 17: 1813-6.
22. Moroy T, Grzeschiczek A, Petzold S, Hartmann K.U. Expression of Pim-1 transgene accelerates lymphoproliferation and inhibits apoptosis in lpr/lpr mice. Proc. Nat. cad. Sci. 1993; 90(22): 10734-8.
23. Magnuson N.S., WangZ, Ding G, Reeves R. Why target Pim-1 for cancer diagnosis and treatment? Fut. Oncol. 2010; 6: 1461-78.
24. Moroy T, Grzeschiczek A, Petzold S, Hartmann K.U. Expression of a Pim-1 transgene accelerates lymphoproliferation and inhibits apoptosis in lpr/lpr mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: 10734-8.
25. Rahman Z, Yoshikawa H, Nakajima Y, Tasaka K. Down-regulation of Pim-1 and Bcl-2 is accompanied with apoptosis of interleukin-6-depleted mouse B-cell hybridoma 7TD1 cells. Immunol. Lett. 2001; 75: 199-208.
26. Lilly M, Kraft A. Enforced expression of the Mr 33,000 Pim-1 kinase enhances factor-independent survival and inhibits apoptosis in murine myeloid cells. Cancer Res. 1997; 57: 5348-55.
27. Aho T.L., Sandholm J., Peltola K.J. et al. Pim-1 kinase promotes inactivation of the pro-apoptotic Bad protein by phosphorylating it on the Ser112 gatekeeper site. FEBS Lett. 2004; 571: 43-9.
28. Zhou X.M., Liu Y, Payne G, Lutz R.J., Chittenden T. Growth factors inactivate the cell death promoter BAD by phosphorylation of its BH3 domain on Ser155. J. Biol. Chem. 2000; 275: 25046-51.
29. Hirai I., WangH.G. Survival-factor-induced phosphorylation of Bad results in its dissociation from Bcl-x(L) but not Bcl-2. Biochem. J. 2001; 359: 345-52.
30. Chao D.T., Linette G.P., Boise L.H. et al. Bcl-XL and Bcl-2 repress a common pathway of cell death. J. Exp. Med. 1995; 182: 821-8.
31. Yang E., Zha J., Jockel J. et al. Bad, a heterodimeric partner for Bcl-XL and Bcl-2, displaces Bax and promotes cell death. Cell 1995; 80: 285-91.
32. Burgering B.M., Kops G.J. Cell cycle and death control: long live Fork-heads. Trends Biochem. Sci. 2002; 27: 352-60.
33. Morishita D., Katayama R., Sekimizu K., Tsuruo T., Fujita N. Pim kinases promote cell cycle progression by phosphorylating and down-regulating p27Kip1 at the transcriptional and posttranscriptional levels. Cancer Res. 2008; 68: 5076-85.
34. Bueso-Ramos C.E., Manshouri T., Haidar M.A. et al. Multiple patterns of MDM-2 deregulation in human leukemias: implications in leukemogenesis and prognosis. Leuk. Lymphoma 1995; 17: 13-8.
35. Finnegan M.C., Goepel J.R., Royds J., Hancock B.W., Goyns M.H. Elevated levels of MDM-2 and p53 expression are associated with high grade non-Hodgkin’s lymphomas. Cancer Lett. 1994; 86: 215-21.
36. Murray SA., Yang S., Demicco E. et al. Increased expression of MDM2, cyclin D1, and p27Kip1 in carcinogen-induced rat mammary tumors. J. Cell Bio-chem. 2005; 95: 875-84.
294
Клиническая онкогематология
Протеинкиназа Pim-1
37. Dworakowska D., Jassem E., Jassem J. et al. MDM2 gene amplification: a new independent factor of adverse prognosis in non-small cell lung cancer (NSCLC). Lung Cancer 2004; 43: 285-95.
38. Kondo I., lida S., Takagi Y, Sugihara K. MDM2 mRNA expression in the p53 pathway may predict the potential of invasion and liver metastasis in colorectal cancer. Dis. Colon Rectum. 2008; 51: 1395-402.
39. Toker A. Signaling through protein kinase C. Front. Biosci. 1998; 3: 1134-47.
40. Hogan C., Hutchison C., Marcar L. et al. Elevated levels of oncogenic protein kinase Pim-1 induce the p53 pathway in cultured cells and correlate with increased Mdm2 in mantle cell lymphoma. J. Biol. Chem. 2008; 283: 18012-23.
41. Mochizuki T., Kitanaka C., Noguchi K. et al. Physical and functional interactions between Pim-1 kinase and Cdc25A phosphatase. Implications for the Pim-1-mediated activation of the c-Myc signaling pathway. J. Biol. Chem. 1999; 274: 18659-66.
42. Bachmann M., Kosan C., Xing P.X. et al. The oncogenic serine/threonine kinase Pim-1 directly phosphorylates and activates the G2/M specific phosphatase Cdc25C. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2006; 38: 430-43.
43. Peng C.Y., Graves P.R., Ogg S. et al. C-TAK1 protein kinase phosphorylates human Cdc25C on ser 216 and promotes 14-3-3 protein binding. Cell Growth Diff. 1998; 9: 197-208.
44. Bachmann M., Hennemann H., Xing P.X., Hoffmann I., Moroy T. The oncogenic serine/threonine kinase Pim-1 phosphorylates and inhibits the activity of Cdc25C-associated kinase 1 (c-TAK1): a novel role for Pim-1 at the G2/M cell cycle checkpoint. J. Biol. Chem. 2004; 279: 48319-28.
45. Wang Z., Bhattacharya N., Mixter P.F. et al. Phosphorylation of the cell cycle inhibitor p21Cip1/WAF1 by Pim-1 kinase. Biochim. Biophys. Acta 2002; 1593: 45-55.
46. Morishita D., Katayama R., Sekimizu K., Tsuruo T., Fujita N. Pim kinases promote cell cycle progression by phosphorylating and down-regulating p27Kip1 at the transcriptional and posttranscriptional levels. Cancer Res. 2008; 68: 5076-85.
47. Zhang Y, Wang Z., Magnuson N.S. Pim-1 kinase-dependent phosphorylation of p21Cip1/WAF1 regulates its stability and cellular localization in H1299 cells. Mol. Cancer Res. 2007; 5: 909-22.
48. Prives C., Gottifredi V. The p21 and PCNA partnership: a new twist for an old plot. Cell Cycle 2008; 7: 3840-6.
49. Bhattacharya N., Wang Z., Davitt C. et al. Pim-1 associates with protein complex necessary for mitosis. Chromosoma 2002; 111: 80-95.
50. Allen J.D., Verhoeven E., Domen J., van der Valk M., Berns A. Pim-2 transgene induces lymphoid tumors, exhibiting potent synergy with c-myc. Oncogene 1997; 15: 1133-41.
51. Slack G.W., Gascoyne R.D. MYC and aggressive B-cell lymphomas. Adv. Anat. Pathol. 2011; 18: 219-28.
52. Forshell L.P., Li Y, Forshell T.Z. et al. The direct Myc target Pim3 cooperates with other Pim kinases in supporting viability of Myc-induced B-cell lymphomas. Oncotarget. 2011; 2: 448-60.
53. Bouquet C., Melchers F. Pim1 and Myc reversibly transform murine precursor B lymphocytes but not mature B lymphocytes. Eur. J. Immunol. 2012; 42: 522-32.
54. Nawijn M.C., Alendar A, Berns A. For better or for worse: the role of Pim oncogenes in tumorigenesis. Nat. Rev. Cancer 2011; 11: 23-34.
55. Brault L., Gasser C., Bracher F. et al. PIM serine/threonine kinases in the pathogenesis and therapy of hematologic malignancies and solid cancers. Haematologica 2010; 95: 1004-15.
56. Anizon F., Shtil A.A., Danilenko V.N., Moreau P. Fighting tumor cell survival: advances in the design and evaluation of Pim inhibitors. Curr. Med. Chem. 2010; 17: 4114-31.
57. Liao J.J.-L. Molecular recognition of protein kinase binding pockets for design of potent and selective kinase inhibitors. J. Med. Chem. 2007; 50: 409-24.
58. Bullock A.N., Debreczeni J.E., Fedorov O. et al. Structural basis of inhibitor specificity of the human protooncogene proviral insertion site in Moloney murine leukemia virus (PIM-1) kinase. J. Med. Chem. 2005; 48: 7604-14.
59. Holder S., Zemskova M., Zhang C. et al. Characterization of a potent and selective small-molecule inhibitor of the Pim1 kinase. Mol. Cancer Ther. 2007; 6: 163-72.
60. Vlahos C.J., Matter W.F., Hui K.Y., Brown R.F. A specific inhibitor of phos-phatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002). J. Biol. Chem. 1994; 269: 5241-8.
61. Walker E.H., Pacold M.E., Perisic O. et al. Structural determinations of phosphoinositide 3-kinase inhibition by wortmannin, Ly294002, quercetin, myricetin and staurosporine. Mol. Cell. 2000; 6: 909-19.
62. Marminon C., Anizon F., Moreau P. et al. Rebeccamycin derivatives as dual DNA damaging agents and potent checkpoint kinase 1 inhibitors. Mol. Pharmacol. 2008; 74: 1620-9.
63. Jacobs M.D., Black J., Futer O. et al. Pim-1 ligand-bound structures reveal the mechanism of serine/threonine kinase inhibition by LY294002. J. Biol. Chem. 2005; 280: 13728-34.
64. Bregman H., Williams D.S., Atilla G.E., Carroll P.J., Meggers E. Switching on a signaling pathway with an organoruthenium complex. Angew. Chem. Int. Ed. 2005; 44: 1984-7.
65. Bregman H., Williams D.S., Atilla G.E., Carroll P.J., Meggers E. An or-ganometallic inhibitor for glycogen synthase kinase 3. J. Am. Chem. Soc. 2004; 126: 13594-5.
66. Debreczeni J.E., Bullock A.N., Atilla G.E. et al. Ruthenium half-sandwich complexes bound to protein kinase Pim-1. Angew. Chem. Int. Ed. 2006; 45: 1580-5.
67. Tao Z.-F., Hasvold L.A., Leverson J.D. et al. Discovery of 3H-benzo[4,5] thieno[3,2-d]pyrimidin-4-ones as potent, highly selective, and orally bioavailable inhibitors of the human protooncogene proviral insertion site in moloney murine leukemia virus (PIM) kinases. J. Med. Chem. 2009; 52: 6621-36.
68. Akue-Gedu R., Rossignol E., Azzaro S. et al. Synthesis, kinase inhibitory potencies, and in vitro antiproliferative evaluation of new Pim kinase inhibitors. J. Med. Chem. 2009; 52: 6369-81.
69. Akue-Gedu R., Nauton L., Thery V. et al. Synthesis, Pim kinase inhibitory potencies and in vitro antiproliferative activities of diversely substituted pyrrolo[2,3-a]carbazoles. Bioorg. Med. Chem. 2010; 18(18): 6865-73.
70. Sliman F., Blairvacq M., Durieu E. et al. Identification and structure-activity relationship of 8-hydroxy-quinoline-7-carboxylic acid derivatives as inhibitors of Pim-1 kinase. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010; 20: 2801-5.
www.medprint.ru
295
