CC BY
63
УДК 616.24-002-008.87-009.88-08:578.72 DOI: 10.22141/2224-0551.15.3.2020.204554
Абатуров А.Е. ©
ГУ «Днепропетровская медицинская академия МЗ Украины», г. Днепр, Украина
Протеазы, деградирующие биопленочный матрикс
For citation: Zdorov'e Rebenka. 2020;15(3):187-194. doi: 10.22141/2224-0551.15.3.2020.204554
Резюме. Биопленки защищают бактерии от действия антибактериальных препаратов и являются одним из механизмов антибиотикорезистентности инфектов. Деструкция матрикса бактериальной биопленки приводит к высвобождению бактерий, и они вновь становятся уязвимыми для антибактериальных средств. В деградации различных компонентов экстрацеллюлярного матрикса биопленок участвуют различные ферменты: протеазы, гликозидазы, дезоксирибонуклеазы, которые секретируются бактериями и клетками макроорганизма. Многочисленные бактериальные протеазы и протеазы животного происхождения способствуют диспергированию биопленки. Протеазы делятся на две основные группы: экзо- и эндопептидазы. В диспергировании биопленки участвуют экзопептидазы. Бактериальные протеазы выполняют две основные функции: во-первых, они участвуют в обеспечении микроорганизма пептидными питательными веществами и, во-вторых, способствуют развитию инфекционного процесса. Бактерии каждого семейства продуцируют несколько протеаз, активность которых направлена против различных таргетных молекул. Такие бактериальные протеазы, как ауреолизин, стафопаины A и B, стрептококковая цистеиновая протеаза, сериновая протеаза V8, протеазы Spl, лизостафин, протеазы Lasb, Lapg, серратиопептидаза, протеиназа К, субтилизин и субтилизин-подобные ферменты, которые участвуют в расщеплении матрикса биопленок, способствуют высвобождению патогенных бактерий, что обусловливает повышение эффективности антибактериальной терапии и снижает риск неблагоприятного течения тяжелых бактериальных инфекций. В настоящее время показано, что применение рекомбинантных форм лизостафина, серратиопептидазы, протеиназы К сопровождается снижением массы биопленки или полной ее деградацией и способствует са-ногенезу инфекционных болезней. Несмотря на то, что большинство идентифицированных протеаз с анти-биопленочной активностью в настоящее время находятся в фазе экспериментального изучения, не остается сомнений, что лекарственные средства, разработанные на их основе, станут препаратами, которые будут использоваться при лечении заболеваний, вызванных антибиотикорезистентными инфектами. Ключевые слова: бактериальные биопленки; диспергирование; внеклеточные бактериальные протеазы
Введение
Внеклеточное полисахаридное вещество (extracellular polysaccharide substance — EPS) биопленки защищает микроорганизмы от различных противомикроб-ных агентов. Дезорганизация EPS сопровождается высвобождением бактерий, которые становятся доступными для антимикробных веществ и антибактериальных лекарственных средств. Матрикс-дегради-рующие ферменты представляют собой определяющие компоненты механизмов диспергирования, которые разрушают целостность матрикса предформирован-ных бактериальных биопленок. В деградации раз-
личных компонентов экстрацеллюлярного матрик-са биопленок участвуют многочисленные протеазы, гликозидазы, дезоксирибонуклеазы, которые секре-тируются бактериями и клетками макроорганизма [6, 17, 23]. Матрикс-деградирующие ферменты разрушают экзополисахариды EPS, лишая бактерии их физической защиты. В настоящее время в качестве основных ферментных лекарственных средств рассматриваются дезоксирибонуклеаза I и дисперзин B. Де-зоксирибонуклеаза I разрушает структуру внеклеточных ДНК, а дисперзин B расщепляет полимеры в 1-6 N-ацетилглюкозамина, способствующего агрегации
© 2020. The Authors. This is an open access article under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License, CC BY, which allows others to freely distribute the published article, with the obligatory reference to the authors of original works and original publication in this journal.
Для корреспонденции: Абатуров Александр Евгеньевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой педиатрии 1 и медицинской генетики, ГУ «Днепропетровская медицинская академия МЗ Украины», ул. Вернадского, 9, г. Днепр, 49044, Украина; e-mail: alexabaturov@i.ua
For correspondence: Oleksandr Abaturov, MD, PhD, Professor, Head of the Department of pediatrics 1 and medical genetics, State Institution "Dnipropetrovsk Medical Academy of the Ministry of Health of Ukraine', Vernadsky st., 9, Dnipro, 49044, Ukraine; e-mail: alexabaturov@i.ua Full list of author information is available at the end of the article.
бактерий [29, 34]. Также для деградации EPS биопленки используют лекарственные средства с муколитиче-ской активностью [42].
Протеазы, участвующие в диспергировании бактериальной биопленки
Многочисленные бактериальные протеазы и протеазы животного происхождения способствуют диспергированию биопленки. Протеазы делятся на две основные группы: экзо- и эндопептидазы. В диспергировании биопленки участвуют экзопептидазы [27].
Основные бактериальные протеазы
Основные бактериальные протеазы, которые способны деградировать компоненты матрикса бактериальной биопленки, представлены в табл. 1.
Бактериальные протеазы выполняют две основные функции: во-первых, они участвуют в обеспечении микроорганизма пептидными питательными веществами и, во-вторых, способствуют развитию инфекционного процесса. Бактерии каждого семейства продуцируют несколько протеаз, активность которых направлена против различных таргетных молекул. Так, установлено, что внеклеточные протеазы являются факторами вирулентности. В частности, внеклеточные протеазы бактерий Staphylococcus aureus участвуют в деградации тканей макроорганизма, деградации иммуноглобулина, инактивации компонентов каскада комплемента и факторов коагуляции и фибринолиза. Так, протеаза V8 расщепляет человеческий IgG, ауреолизин — белок С3 системы комплемента и активирует протромбин (табл. 2). Одной из важнейших функций бактериальных протеаз считают диспергирование биопленки [33, 39].
Таблица 1. Протеазы, участвующие в диспергировании бактериальной биопленки [14]
Фермент Краткая характеристика
Ауреолизин (aureolysin) Стафилококковая металлопротеиназа, которая разрушает биопленки бактерий Staphylococcus aureus, деградируя протеин Bap и фактор комкования
Стафопаин A и B (staphopain A (ScpA), Staphopain B (SspB)) Цистеиновые протеазы стафилококковых бактерий, диспергирующие биопленку бактериями Staphylococcus aureus за счет деградации неизвестной протеиновой мишени
Сериновая протеаза V8 (SspA) Стафилококковая сериновая протеаза, которая деградирует фибронектин-связывающие белки и Bap в биопленках бактерий Staphylococcus aureus
Протеазы Spl Группа из шести сериновых протеаз стафилококковых бактерий. Протеазы Spl, протеин EbpS бактерий Staphylococcus aureus
Лизостафин (lysostaphin) Эндопептидаза бактерий Staphylococcus simulans, которая расщепляет глицин-глициновую связь пептидов
Стрептококковая цистеиновая протеаза (SpeB) Цистеиновая протеаза бактерий Streptococcus pyogenes, которая участвует в гидролизе поверхностных белков M и F1
Фермент, высвобождающий поверхностный белок (surface-protein-releasing enzyme — SPRE) Эндогенная стрептококковая протеаза, которая, как было показано, вызывает отслойку биопленки бактерий Streptococcus mutans за счет высвобождения поверхностного антигена P1
Протеаза LasB Протеаза, продуцируемая бактериями Pseudomonas aeruginosa
Протеаза LapG Протеаза, продуцируемая бактериями Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, которая индуцирует диспергирование за счет модификации связанного с наружной мембраной экзополисахаридсвязывающего протеина LapA
Серратиопептидаза (serratiopep-tase/serralysin/serrapeptase — Spep) Металлопротеиназа энтеробактерий Serratia marcescens
Протеиназа К Стабильная сериновая протеаза, которая разрушает пептидные связи, примыкающие к карбоксильной группе, алифатических и ароматических аминокислот. Проявляет активность против биопленок, формируемых бактериями Staphylococcus aureus, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus heamolyticus, Listeria monocytogenes, Gardnerella vaginalis и Escherichia coli, Heamophilus influenza и Bdellovibrio bacteriovorus
Субтилизин (subtilisin) и субтилизин-подобные ферменты Внеклеточная сериновая пептидаза бактерий Bacillus subtilis, архей, бактерий, эукариев, грибов и дрожжей
Трипсин Сериновая протеаза поджелудочной железы, проявляющая активность против биопленок, бактерий Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mitis, Actinomyces radicidentis, Staphylococcus epidermidis и Gardnerella vaginalis
Протеазы бактерий Staphylococcus
Грамположительные патогенные бактерии Staphylococcus aureus продуцируют протеазы трех молекулярных семейств: металлопротеазы (1 тип), цистеиновые (2 типа) и сериновые протеазы (9 типов). Из 12 стафилококковых протеаз четыре — сериновая протеаза V8 (SspA), два стафопаина (SspB и ScpA) и ауреолизин (Aur) — принимают участие в диспергировании биопленки, а экзогенные очищенные протеазы Aur, ScpA и SspB диспергируют установленные биопленки бактерий Staphylococcus aureus in vitro, причем Aur является протеазой с наиболее эффективной антибиопленоч-ной активностью (табл. 3) [14, 39].
Активация протеаз бактерий Staphylococcus aureus носит каскадный характер (рис. 1).
Металлопротеаза: ауреолизин
Молекула ауреолизина (протеазы III) бактерий Staphylococcus aureus состоит из двух консервативных доменов: N-терминального в-листового и C-терминального a-спирального, наличие которых характерно для бактериальных металлопротеаз семейства термолизинов. Ауреолизин в отличие от других бактериальных термолизинов не обладает эластазной активностью. Молекула Aur активируется за счет аутопро-теолиза посредством отщепления N-терминального пропептида [2]. Активный фермент предпочитает расщеплять пептидные связи в N-терминальном регионе гидрофобных аминокислотных остатков, таких как аланиновый, изолейциновый и тирозиновый. Широкая субстратная специфичность Aur позволяет ей
Таблица 2. Функции экстрацеллюлярных протеаз, секретируемых бактериями
Staphylococcus aureus [33]
Протеазы Специфическая функция
Ауреолизин Деградация ингибитора а1-протеазы
Активация протромбина
Деградация антимикробного пептида LL-37
Деградация компонента комплемента С3
Стафопаин А Расщепление ^концевого домена нейтрофильного хемокинового рецептора CXCR2
Стафопаин B Деградация нейтрофильной молекулы CD31
Протеаза V8 (SspA) Деградация человеческого ^
Серин-протеазоподобный белок А (serine protease-like protein A — SplA) Деградация муцина
Сериновая протеаза EpiP (epidermin leader peptide processing serine protease) Деградация коллагена и казеина
Эксфолиативные токсины A (ETA) и B (ETB) Деградация десмоглеина-1
Протеазы Тип Активаторы Ингибиторы Особенности протеолиза Регуляторные системы
Aur Металлопроте-иназа Аутоактива-ция EDTA, o-фенантролин Отщепляет вконец крупных гидрофобных аминокислот agr, sar
SspA Сериновая протеаза Aur DFP Отщепляет С-конец аспарагиновой или глу-таминовой кислоты agr, sar
SspB Цистеиновая протеаза SspA E-64, SspC Отщепляет аргининовый остаток, который предшествует остаткам гидрофобных аминокислот agr, sar
ScpA Цистеиновая протеаза Аутоактива-ция Е-64, крысиный Т-кининоген, фосфори-лированный цистатин а, макроглобулин а-2, неидентифицированные ингибиторы плазмы, ScpB Широкая субстратная специфичность, эластинолитическая активность agr, sar
Таблица 3. Биохимические характеристики основных внеклеточных протеаз бактерий Staphylococcus aureus, способствующих диспергированию биопленки [22]
нацеливаться на различные пептиды. Aur активирует SspA, вторую протеазу в каскаде активации стафилококковых протеаз [30].
Allister J. Loughran и соавт. [21] продемонстрировали, что очищенный Aur ограничивает образование биопленки в 14 из 15 изолятов Staphylococcus aureus, устойчивых к метициллину.
Цистеиновые протеазы: стафопаины
Стафопаин A (ScpA) был первой идентифицированной в 1973 году цистеиновой протеазой бактерий Staphylococcus aureus; стафопаин B (SspB) был идентифицирован в 1998 году как ORFX. Стафопаин С выделен из изолятов Staphylococcus aureus, ассоциированных с птицами. Кристаллические структуры обоих стафопаинов демонстрируют структурное сходство с папаином. Классические папаиноподоб-ные протеазы содержат два домена: N-терминальный спиральный L-домен, содержащий каталитический цистеин, и C-терминальный R-домен, образующий Р-бочкообразную структуру, содержащую каталитический гистидин и аспартат [40]. Экспрессия обоих стафопаинов репрессируется во время образования биопленки, а продукция стафопаина приводит к диспергированию бактериальной биопленки [26, 31].
Сериновая протеаза: SspA
Сериновая протеаза SspA (протеаза V8 или GluV8) представляет собой глутамилэндопептидазу, часть небольшой группы сериновых протеаз, которые преимущественно отщепляют субстраты в С-терминальном регионе глутамата и аспартата. Молекула SspA содержит консервативную трипсиноподобную серин-протеазную каталитическую триаду, состоящую из гистидинового,
аспарагинового и серинового остатков. С-терминальный регион ее молекулы состоит из тандемных повторов ProAsp или Asn-Asn, количество которых варьирует от 9 до 19 [11]. Протеаза SspA способствует уклонению от иммунного ответа и диспергированию бактерий Staphylococcus aureus за счет деградации протеинов макроорганизма и белков матрикса биопленки.
Olga Mitrofanova и соавт. [25], используя количественные методы и сканирующую электронную микроскопию для обнаружения биопленки, продемонстрировали высокую эффективность субтилизи-ноподобной протеазы и SspA в процессе деградации биопленки. Ферментативная обработка приводила к деградации компонентов EPS и значительному уменьшению массы биопленок.
Лизостафин
Лизостафин (lysostaphin) представляет собой стафилококковую глицин-глициновую эндопептидазу (пептидогликангидролазу), продуцируемую бактериями Staphylococcus simulans, которая специфически расщепляет связи между третьим и четвертым глициновыми остатками поперечного мостика пентагли-цина клеточной стенки бактерий Staphylococcus aureus (рис. 2) [4, 24, 41].
Лизостафин обладает различными типами каталитической активности: активностью глицилгли-цин-эндопептидазы, эндо-бета-нацетилглюкоза-мидазы и ^ацетилмурамил^-аланинамидазы, что позволяет ему эффективно гидролизовать клеточные стенки бактерий Staphylococcus aureus, которые состоят из Р-1,4-связанного N-ацетилглюкозамина, N-ацетилмурамовой кислоты, мурамовой кислоты, D-аланина, D-изоглутамина и L-лизина [40].
Рисунок 1. Гены протеаз бактерий Staphylococcus aureus и каскад их активации [26] Примечания: A — геномная организация секретируемых протеаз бактерий Staphylococcus aureus USA300. Красным цветом обозначена металлопротеиназа; синим — сериновая протеаза; зеленым — цистеиновые протеазы (стафопаины); оранжевым — внутриклеточные ингибиторы цистеиновых протеаз стафостатинов (Staphostatins); B — протеолитический каскад активации протеаз бактерий Staphylococcus aureus. Протеазы Aur, SspA, SspB и ScpA секретируются в виде неактивных зимогенов (Pro-). Pro-Aur активируется автоматически и активирует Pro-SspA, SspA, в свою очередь, активирует Pro-SspB. Проформа протеазы Pro-ScpA, как и Pro-Aur, аутоактивируется.
Лизостафин способен вызывать лизис бактерий Staphylococcus aureus на всех стадиях развития. Лизо-стафин эффективен как против спокойных бактерий Staphylococcus aureus, включая стафилококки в биопленках, так и активно делящихся бактерий. Лизо-стафин проявлет бактерицидное действие против метицилл- (methicillin-resistant S.aureus — MRSA), ван-комицин-резистентных бактерий Staphylococcus aureus (vancomycin-resistant S.aureus — VRSA) и бактерий Staphylococcus aureus, резистентных к другим антибиотикам [5, 19]. Лизостафин также активен против бактерий Staphylococcus carnosus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, инфицирующих иммуноде-фицитных пациентов, особенно пациентов с имплан-татами, лиц, подвергающихся диализу и с тяжелой формой сахарного диабета, и Staphylococcusxylosus (оппортунистический патоген) [40].
Рекомбинантный лизостафин может стать одним из важнейших антистафилококковых средств в клинической практике [7]. Hamid Abtahi и соавт. [1] создали рекомбинантный лизостафин (rLysostaphin), экспрес-сируемый pLysS Escherichia coli BL21 (DE3) с использованием вектора pET32a, и показали, что rLysostaphin в концентрации 100 мкг/мл подавляет рост стафилококковой колонии, а его однократное введение в дозе 200 мкг достоверно уменьшает колонизацию носовой полости у всех экспериментальных животных.
Высокая эффективность лизостафина по отношению к биопленке, образуемой бактериями Staphylococcus aureus, была подтверждена исследованиями John F. Kokai-Kun и соавт. [18] и Hilana Ceotto-Vigoder и соавт. [8]. Показано, что назначение экспериментальным животным лизостафина в суточной дозе 15 мг/кг и нафциллина в суточной дозе 50 мг/кг в течение четырех суток приводит к полному исчезновению биопленок MRSA. Также авторы продемонстрировали, что лизостафин эффективно защищает постоянные катетеры от колонизации бактериями MRSA [18].
Несмотря на многообещающие результаты применения лизостафина при стафилококковых инфекциях, его использование в медицинских учреждениях затруднено из-за высокой себестоимости. Новые способы дешевого синтеза рекомбинантного лизоста-фина позволяют надеяться на то, что данное лекарственное средство станет доступным для клинической практики лечения инфекций, вызванных бактериями Staphylococcus aureus, особенно MRSA [12].
Протеазы, продуцируемые бактериями Pseudomonas
Одной из наиболее активных экстрацеллюлярных протеаз бактерий Pseudomonas aeruginosa является LapG, которая представляет семейство бактериальных транс-глутаминазоподобных цистеиновых протеиназ [9].
Протеин LapG функционирует как периплазматическая про-теаза, которая способна отщеплять адгезин CdrA от поверхности клетки макроорганизма и таким образом индуцировать диспергирование биопленки. Протеаза LapG бактерий Pseudomonas aeruginosa является функциональным гомологом белка LapG Pseudomonas putida, функционирующего как периплазматическая протеа-за, взаимодействующая с поверхностным адгезином LapA. Идентификация адгезина CdrA молекулярной мишенью LapG удивительна тем, что CdrA не гомологичен LapA [35].
Другие
экстрацеллюлярные протеазы
Субтилизины
Субтилизины (subtilisins) являются сериновыми проте-азами и продуцируются бактериями Bacillus spр. и некоторыми растениями. Субтилизины расщепляют протеины, у которых сериновый остаток представляет собой нуклеофильный компонент [13]. Субтилизины
Рисунок 2. Основной механизм действия лизостафина [40]
гидролизуют бактериальные адгезины, предотвращая коагрегацию микроорганизмов Actinomyces naeslundii, Streptococcus oralis, Porphyromonas gingivalis, и участвуют в диспергировании биопленок, сформированных бактериями Pseudomonas, Pseudoalteromonas, Listeria monocytogenes и Bacillus spр. [40].
Скрининг нескольких коммерческих дезинфицирующих средств, содержащих субтилизин (Pandion, Resinase A2X, Spezyme GA300), показал высокий уровень их эффективности в процессе удаления биопленок бактерий Pseudomonas aeruginosa, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis и Streptococcus thermophiles [3, 10].
Серратиопептидаза
Серратиопептидаза (serratiapeptase/serralysin/ serrapeptase — Spep) является протеолитическим ферментом — неклеточной металлопротеазой, продуцируемой грамотрицательными непатогенными энтеробактериями Serratia marcescences ATCC 21074 (strain E15), обнаруженными в шелковом черве. Молекула Spep содержит цинк-связывающий консенсус HEXXHXXGXXH, где три гистидиновых остатка являются цинковыми лигандами, а остаток глутами-новой кислоты представляет собой каталитическую основу. Серратиопептидаза способна разрушать ма-трикс биопленки и способствовать диспергированию бактерий [15, 36]. Продемонстрировано, что Spep препятствует адгезии бактерий Staphylococcus aureus к клеткам и нарушает структуру биопленки [36]. Продемонстрировано, что фибрин представляет собой ключевой компонент — каркас биопленки, сформированной как чувствительными к метициллину бактериями Staphylococcus aureus (meticillin-susceptible Staphylococcus aureus — MSSA), так и MRSA. Согласно наличию выраженной фибринолитической активности, серратиопептидаза эффективно разрушает биопленки, образованные штаммами MRSA и MSSA [16]. Серратиопептидаза успешно используется в Японии и Европе для подавления активности воспалительного процесса при артритах, травмах, синуситах, бронхитах и других патологических процессах [28]. Siobhan Hogan и соавт. [16] считают, что лизостафин и серратиопептидаза являются наиболее эффективными диспергирующими агентами, разрушающими биопленки штаммов Staphylococcus aureus.
Протеиназа K
Протеиназа K представляет собой сериновую проте-азу, первоначально выделенную из гриба Engyodontium album, которая деградирует кератин [20, 38].
Показано, что экзогенная протеиназа К Pseudomonas aeruginosa индуцирует экспрессию генов эндогенных протеаз, в том числе и SspA, усиливая протеазную активность бактерий Staphylococcus aureus, что приводит к быстрому диспергированию биопленки последнего [32].
Также протеиназа К ингибирует рост биопленок изолятов бычьего мастита Staphylococcus aureus. При обработке протеиназой К наблюдалось повышение уровня диспергирования биопленок, образованных
бактериями Staphylococcus aureus. Сочетанное использование протеиназы К с антибиотиками показало их синергетический эффект активации диспергирования биопленок, сформированных бактериями Staphylococcus aureus. Авторы считают, что диспергирование биопленок бактерий Staphylococcus aureus проте-азой K может быть использовано при разработке анти-биопленочных методов лечения [37].
Заключение
Бактериальные протеазы, которые расщепляют пептиды и пептиды матрикса биопленок, способствуют диспергированию патогенных бактерий, что обусловливает повышение эффективности антибактериальной терапии и снижает риск неблагоприятного течения тяжелых бактериальных инфекций. В настоящее время показано, что применение рекомбинант-ных форм лизостафина, серратиопептидазы, протеи-назы К сопровождается снижением массы биопленки или полной ее деградацией и способствует саногенезу стафилококковых инфекций. Использование ферментных препаратов при лечении заболеваний, течение которых сопровождается развитием биопленки, ассоциировано с риском распространения патогена и поражения других органов организма больного. Поэтому диспергирующие агенты следует использовать в сочетании с системными антимикробными агентами. Несмотря на то, что большинство идентифицированных протеаз с антибиопленочной активностью в настоящее время находятся в фазе экспериментального изучения, не остается сомнений, что лекарственные средства, разработанные на их основе, станут препаратами, которые будут использоваться при лечении заболеваний, вызванных антибиотикорезистентными инфектами.
Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии какого-либо конфликта интересов и собственной финансовой заинтересованности при подготовке данной статьи.
References
1. Abtahi H, Farhangnia L, Ghaznavi-Rad E. In Vitro and in Vivo Antistaphylococcal Activity Determination of the New Recombinant Lysostaphin Protein. Jundishapur J Microbiol. 2016;9(3):e28489. doi:10.5812/jjm.28489.
2. Adekoya OA, Sylte I. The thermolysin family (M4) of enzymes: therapeutic and biotechnological potential. Chem Biol Drug Des. 2009;73(1):7-16. doi:10.1111/j.1747-0285.2008.00757.x.
3. Augustin M, Ali-Vehmas T, Atroshi F. Assessment of enzymatic cleaning agents and disinfectants against bacterial biofilms. JPharm Pharm Sci. 2004;7(1):55-64.
4. BastosMD, CoutinhoBG, CoelhoML. Lysostaphin: A Staphylococcal Bacteriolysin with Potential Clinical Applications. Pharmaceuticals (Basel). 2010;3(4):1139-1161. doi:10.3390/ph3041139.
5. Berscheid A, François P, Strittmatter A, et al. Generation of a vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (VISA) strain by two amino acid exchanges in VraS. J Antimicrob Chemother. 2014;69(12):3190-3198. doi:10.1093/jac/dku297.
6. Blackledge MS, Worthington RJ, Melander C. Biologically inspired strategies for combating bacterial biofilms. Curr Opin Pharmacol. 2013;13(5):699-706. doi:10.1016/j.coph.2013.07.004.
7. Boksha IS, Lavrova NV, Grishin AV, et al. Staphylococcus simulans Recombinant Lysostaphin: Production, Purification, and Determination of Antistaphylococcal Activity. Biochemistry (Mosc). 2016;81(5):502-510. doi:10.1134/S0006297916050072.
8. Ceotto-Vigoder H, Marques SL, Santos IN, et al. Nisin and lysostaphin activity against preformed biofilm of Staphylococcus aureus involved in bovine mastitis. J Appl Microbiol. 2016;121(1):101-114. doi:10.1111/jam.13136.
9. Cherny KE, Sauer K. Untethering and Degradation of the Polysaccharide Matrix Are Essential Steps in the Dispersion Response of Pseudomonas aeruginosa Biofilms. JBacteriol. 2020;202(3):e005 75-19. doi:10.1128/ JB.00575-19.
10. Coughlan LM, Cotter PD, Hill C, Alvarez-Ordóñez
A. New Weapons to Fight Old Enemies: Novel Strategies for the (Bio)control of Bacterial Biofilms in the Food Industry. Front Microbiol. 2016;7:1641. doi:10.3389/ fmicb.2016.01641.
11. Dubin G. Extracellular proteases of Staphylococcus spp. Biol Chem. 2002;383(7-8):1075-1086. doi:10.1515/ BC.2002.116.
12. Duman ZE, Ünlü A, Qakar MM, Ünal H, Binay
B. Enhanced production of recombinant Staphylococcus simulans lysostaphin using medium engineering. Prep Biochem Biotechnol. 2019;49(5):521-528. doi:10.1080/10 826068.2019.1599393.
13. Figueiredo J, Sousa Silva M, Figueiredo A. Subtilisin-like proteases in plant defence: the past, the present and beyond. Mol Plant Pathol. 2018;19(4):1017-1028. doi:10.1111/mpp.12567.
14. Fleming D, Rumbaugh KP. Approaches to Dispersing Medical Biofilms. Microorganisms. 2017;5(2):15. doi:10.3390/microorganisms5020015.
15. Gupte V, Luthra U. Analytical techniques for serratiopeptidase: A review. JPharm Anal. 2017;7(4):203-207. doi:10.1016/j.jpha.2017.03.005.
16. Hogan S, Zapotoczna M, Stevens NT, Humphreys H, O'Gara JP, O'Neill E. Potential use of targeted enzymatic agents in the treatment of Staphylococcus aureus biofilm-related infections. J Hosp Infect. 2017;96(2):177-182. doi:10.1016/j.jhin.2017.02.008.
17. Kaplan JB. Biofilm matrix-degrading enzymes. Methods Mol Biol. 2014;1147:203-213. doi:10.1007/978-1-4939-0467-9 14.
18. Kokai-Kun JF, Chanturiya T, Mond JJ. Lysostaphin eradicates established Staphylococcus aureus biofilms in jugular vein catheterized mice. J Antimicrob Chemother. 2009;64(1):94-100. doi:10.1093/jac/dkp145.
19. Kumar JK. Lysostaphin: an antistaphylococcal agent. Appl Microbiol Biotechnol. 2008;80(4):555-561. doi:10.1007/s00253-008-1579-y.
20. Kumar Shukla S, Rao TS. Dispersal of Bap-mediated Staphylococcus aureus biofilm by proteinase K. J Antibiot (Tokyo). 2013;66(2):55-60. doi:10.1038/ ja.2012.98.
21. Loughran AJ, Atwood DN, Anthony AC, et al. Impact of individual extracellular proteases on Staphylococcus aureus biofilm formation in diverse clinical isolates and their isogenic sarA mutants. Microbiologyopen. 2014;3(6):897-909. doi:10.1002/mbo3.214.
22. Martínez-García S, Rodríguez-Martínez S, Cancino-Diaz ME, Cancino-Diaz JC. Extracellular proteases of Staphylococcus epidermidis: roles as
virulence factors and their participation in biofilm. APMIS. 2018;126(3):177-185. doi:10.1111/apm.12805.
23. Maunders E, Welch M. Matrix exopolysaccharides; the sticky side of biofilm formation. FEMS Microbiol Lett. 2017;364(13):fnx120. doi:10.1093/femsle/fnx120.
24. Mitkowski P, Jagielska E, NowakE, et al. Structural bases of peptidoglycan recognition by lysostaphin SH3b domain. Sci Rep. 2019;9(1):5965. doi:10.1038/s41598-019-42435-z.
25. Mitrofanova O, Mardanova A, Evtugyn V, Bogomolnaya L, Sharipova M. Effects of Bacillus Serine Proteases on the Bacterial Biofilms. Biomed Res Int. 2017;2017:8525912. doi:10.1155/2017/8525912.
26. Mootz JM, Malone CL, Shaw LN, Horswill AR. Staphopains modulate Staphylococcus aureus biofilm integrity. Infect Immun. 2013;81(9):3227-3238. doi:10.1128/IAI.00377-13.
27. Nandan A, Nampoothiri KM. Molecular advances in microbial aminopeptidases. Bioresour Technol. 2017;245(Pt B):1757-1765. doi:10.1016/j.biortech.2017.05.103.
28. Nirale NM, Menon MD. Topical formulations of serratiopeptidase: development and pharmacodynamic evaluation. Indian J Pharm Sci. 2010;72(1):65-71. doi:10.4103/0250-474X.62246.
29. Oloketuyi SF, Khan F. Inhibition strategies of Listeria monocytogenes biofilms-current knowledge and future outlooks. J Basic Microbiol. 2017;57(9):728- 743. doi:10.1002/jobm.201700071.
30. Oscarsson J, Tegmark-Wisell K, Arvidson S. Coordinated and differential control of aureolysin (aur) and serine protease (sspA) transcription in Staphylococcus aureus by sarA, rot and agr (RNAIII). Int J Med Microbiol. 2006;296(6):365-380. doi:10.1016/j.ijmm.2006.02.019.
31. Otto M. Staphylococcal Biofilms. Microbiol Spectr. 2018;6(4). doi:10.1128/microbiolspec.GPP3-0023-2018.
32. Park JH, Lee JH, Cho MH, Herzberg M, Lee J. Acceleration of protease effect on Staphylococcus aureus biofilm dispersal. FEMS Microbiol Lett. 2012;335(1):31-38. doi:10.1111/j.1574-6968.2012.02635.x.
33. Pietrocola G, Nobile G, Rindi S, Speziale P. Staphylococcus aureus Manipulates Innate Immunity through Own and Host-Expressed Proteases. Front Cell Infect Microbiol. 2017;7:166. doi:10.3389/fcimb.2017.00166.
34. Roy R, Tiwari M, Donelli G, Tiwari V. Strategies for combating bacterial biofilms: A focus on anti-biofilm agents and their mechanisms of action. Virulence. 2018;9(1):522-554. doi:10.1080/21505594.2017.1313372.
35. Rybtke M, Berthelsen J, Yang L, H0iby N, Givskov M, Tolker-Nielsen T. The LapG protein plays a role in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation by controlling the presence of the CdrA adhesin on the cell surface. Microbiologyopen. 2015;4(6):917-930. doi:10.1002/ mbo3.301.
36. Selan L, Papa R, Tilotta M, et al. Serratiopeptidase: a well-known metalloprotease with a new non-proteolytic activity against S. aureus biofilm. BMC Microbiol. 2015;15:207. doi:10.1186/s12866-015-0548-8.
37. Shukla SK, Rao TS. Staphylococcus aureus biofilm removal by targeting biofilm-associated extracellular proteins. Indian J Med Res. 2017;146(Supplement):S1-S8. doi:10.4103/ijmr.IJMR_410_15.
38. Silva CJ, Vázquez-Fernández E, Onisko B, Requena JR. Proteinase K and the structure of PrPSc: The good, the bad and the ugly. Virus Res. 2015;207:120-126. doi:10.1016/j.virusres.2015.03.008.
39. Tam K, Torres VJ. Staphylococcus aureus Secreted Toxins and Extracellular Enzymes. Microbiol Spectr. 2019;7(2):10.1128/microbiolspec.GPP3-0039-2018. doi:10.1128/microbiolspec.GPP3-0039-2018.
40. Thallinger B, Prasetyo EN, Nyanhongo GS, Guebitz GM. Antimicrobial enzymes: an emerging strategy to fight microbes and microbial biofilms. Biotechnol J. 2013;8(1):97-109. doi:10.1002/biot.201200313.
41. Tossavainen H, Raulinaitis V, Kauppinen L, Pentikainen U, Maaheimo H, Permi P. Structural and Functional Insights Into Lysostaphin-Substrate Interaction. Front Mol Biosci. 2018;5:60. doi:10.3389/ fmolb.2018.00060.
42. Xu D, Jia R, Li Y, Gu T. Advances in the treatment of problematic industrial biofilms. World J Microbiol Biotechnol. 2017;33(5):97. doi:10.1007/s11274-016-2203-4.
Получено/Received 12.01.2020 Рецензировано/Revised 14.02.2020 Принято в печать/Accepted 23.02.2020 ■
Information about author
A.E. Abaturov, MD, PhD, Professor, Head of the Department of pediatrics 1 and medical genetics, State Institution "Dnipropetrovsk Medical Academy of the Ministry of Health of Ukraine'; Dnipro, Ukraine; e-mail: alexabaturov@i.ua; ORCID iD: http://orcid.org/0000-0001-6291-5386
Абатуров O.e.
ДЗ «Днпропетровська медична академiя МОЗ Украни», м. Д^про, Украна
Протеази, що деградують бiоплiвковий матрикс
Резюме. Бiоплiвки захищають бактери вщ дшчих анти-бактерiальних препарайв i застосовують один iз механiзмiв антибютикорезистентносп шфеклв. Деструкц1я матриксу бактерiальноT бiоплiвки призводить до вившьнення бакте-рш, i вони знову стають уразливими до антибактерiальних засобiв. У деградацй рiзних компонентiв екстрацелюлярного матриксу бiоплiвок беруть участь рiзнi ферменти: протеази, глшозидази, дезоксирибонуклеази, що секретуються бакте-р1ями та клiтинами макроорганiзму. Численнi бактерiальнi протеази та протеази тваринного походження дозволяють диспергувати бiоплiвки. Протеази подшяються на двi основнi групи: екзо- та ендопептидази. У диспергуванш бiоплiвки беруть участь екзопептидази. Бактерiальнi протеази виконують двi основнi функцй: по-перше, вони беруть участь у забезпе-ченнi мiкроорганiзму пептидними поживними речовинами i, по-друге, сприяють розвитку шфекцшного процесу. Бактери кожно! родини продукують деилька протеаз, активнiсть яких спрямована проти рiзних таргетних молекул. Таш бактерiаль-нi протеази, як авреолiзин, стафопаГни А i В, стрептококова
цистеГнова протеаза, серинова протеаза У8, протеази Spl, лiзостафiн, протеази Lasb, Lapg, сератiопептидаза, протеГна-за К, субтитзин i субтилiзин-подiбнi ферменти, яш беруть участь у розщеплюванш матриксу бiоплiвки, сприяють ви-вшьненню патогенних бактерiй, що обумовлюе пщвищен-ня ефективностi антибактерiальноl терапи i знижуе ризик несприятливого перебiгу тяжких бактерiальних iнфекцiй. Сьогоднi показано, що застосування рекомбiнантних форм лiзостафiну, сератюпептидази, проте'Гнази К супроводжуеть-ся зниженням маси бiоплiвки або повною Г! деградащею та сприяе саногенезу шфекцшних захворювань. Незважаючи на те, що бшьшють iIдентифiкованих протеаз з антибюплшковою активнiстю сьогоднi перебувають у фазi експериментального дослщження, не залишаеться сумнiвiв, що лiкарськi засоби, розробленi на Гх основi, стануть препаратами, що будуть ви-користовуватися при лшуванш захворювань, викликаних ан-тибiотикорезистентними шфектами.
Ключовi слова: бактерiальнi бiоплiвки; диспергування; по-заклiтиннi бактерiальнi протеази
A.E. Abaturov
State Institution "Dnipropetrovsk Medical Academy of the Ministry of Health of Ukraine", Dnipro, Ukraine
Proteases that degrade the biofilm matrix
Abstract. Biofilms protect bacteria from the action of antibacterial drugs and are one of the mechanisms of antibiotic resistance of infections. Destruction of the bacterial biofilm matrix leads to the release of bacteria and they again become vulnerable to antibacterial agents. Various enzymes are involved in the degradation of various components of the excellular matrix of biofilms: proteases, glycosidases, deoxyribonucleases, which are secreted by bacteria and macroorganism cells. Numerous bacterial proteases and proteases of animal origin contribute to the dispersion of biofilms. Proteases are divided into two main groups: exo- and endopeptidases. Exopeptidases are involved in the dispersion of biofilms. Bacterial proteases perform two main functions: firstly, they are involved in providing the microorganism with peptide nutrients and, secondly, they contribute to the development of the infectious process. Bacteria of each family produce several proteases, the activity of which is directed against various targeted molecules. Bacterial proteases such as aureolysin, staphopaines A and B, streptococcal cysteine
protease, V8 serine protease, Spl protease, lysostaphin, LasB protease, LapG protease, serratiopeptidase, proteinase K, subtilisin and subtilisin-like enzymes that are involved in the breakdown of the bioprotein matrix contribute to the release of pathogenic bacteria, which leads to an increase in the effectiveness of antibiotic therapy and reduces the risk of an adverse course of severe bacterial infections. It has now been shown that the use of recombinant forms of lysostaphin, serratiopeptidase, proteinase K is accompanied by a decrease in the weight of the biofilm or its complete degradation and contributes to the sanogenesis of infectious diseases. Despite the fact that most of the identified proteases with antibiotic activity are currently in the phase of experimental study, there is no doubt that drugs developed on their basis will become drugs that will be used in the treatment of diseases caused by antibiotic-resistant infections.
Keywords: bacterial biofilms; dispersion; extracellular bacterial proteases
