CC BY
101
УДК 615.099:577.151.042:599.323.4-148.11
ПРООКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНА СИСТЕМА ГОЛОВНОГО МОЗКУ ЩУРІВ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІЙ ПОРФІРИНОПАТІЇ
Вивчено порушення прооксидантю-антшксидантюго балансу в головному мозку в умовах експериментальної порфіринопатії. Показано, що дана патологія характеризується активацією вільнорадикальних процесів (збільшенням кількості ТБК-активних продуктів, підвищенням інтенсивності індукованого ПОЛ) та пригніченням антиоксидантної системи (зменшенням глутатіонпероксидазної і каталазної активності).
Ключові слова: порфіринопатія, головний мозок, перекисне окиснення ліпідів, антиоксидантна система.
Робота виконана у рамках науково-дослідної програми Національного фармацевтичного університету “Фармакологічні дослідження біологічно активних речовин і лікарських засобів синтетичного та природного походження, їх застосування у медичній практиці (№ держ. реєстр. 010300909418).
Процеси вільнорадикального окиснення у нормі перебігають в усіх органах та тканинах організму, зокрема у головному мозку, однак їх надмірна активація є універсальним механізмом деградації біомембран при багатьох патологічних станах [3]. У відповідь на вплив пошкоджувального чинника відбувається порушення прооксидантно-антиоксидантного балансу, яке у подальшому може набути генералізованої форми [1, 8]. Особливу увагу привертає група захворювань з загальною назвою порфірії, при яких порушення біосинтезу гему та як наслідок, накопичення в організмі порфіринів та/або їх попередників приводить до порушення діяльності і центральної нервової системи. Стан прооксидантно-антиоксидантного балансу головного мозку в умовах порушеного порфіринового обміну представляє цікавість для науковців та клініцистів з точки зору визначення ступеню його пошкодження та медикаментозної корекції в подальшому.
Метою роботи була оцінка ступеню порушення інтенсивності ПОЛ і активності ферментів системи антиоксидантного захисту (АОЗ) головного мозку щурів при експериментальному порушенні порфіринового обміну.
Матеріал та методи дослідження. Експерименти проведені на 40 нелінійних білих щурах масою 180200г. Порушення порфіринового обміну викликали підшкірними ін’єкціями бензолу [11, 13] дозами із розрахунку 0,1 мл на 1 кг маси тварини 2 рази на тиждень протягом 3 місяців. На момент початку експерименту вік тварин складав 6 місяців. До контрольної групи ввійшли щури тієї ж статі та віку, які отримували аналогічну дієту. В останній день експерименту тварин декапітували під наркозом, готували 25 % гомогенат головного мозку на 50 тМ ^-НСІ буфері, що містив 50 тМ №СІ (рН-7,4). У гомогенатах головного мозку вивчали базальний рівень ТБК-активних продуктів згідно з методом [1], показник виражали у нмоль МДА/мг білка. Також досліджували інтенсивність індукованого ПОЛ. Для цього гомогенат інкубували 10 хв у середовищі (рН-7,4), що містило 50 тМ ^-НСІ, 50 тМ №СІ, 0,25 тМ аскорбату й 12 тМ FeS04. Швидкість накопичення ТБК-активних продуктів вивчали згідно з методом [2], виражали у нмоль МДА/мг білка за 1 хв. Активність каталази досліджували за зменшенням вмісту перекису водню при довжині хвилі 240 нм [4], виражали у мкмоль Н202 білка за 1 хв. Активність глутатіонпероксидази визначали за зниженням вмісту відновленого глутатіону, виражали у мкмоль GSSG/мг білка за 1 хв [5, 11]. Вміст білка у гомогенаті головного мозку оцінювали за допомогою біуретового методу. Інтенсивність поглинання зразків визначали на спектрофотометрі "Сагу-50" (Австралія). Усі маніпуляції на тваринах проводили під етамінал-натрієвим наркозом (60 мг/кг підшкірно), згідно з Міжнародними принципами Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментів та інших наукових цілей (Страсбург, 18.03.1986) [7]. Статистичну обробку даних проводили з використанням параметричних методів статистики за ^критерієм Ст’юденту [2, 12].
Результати дослідження та їх обговорення. Отримані нами дані свідчать про те, що гематоенцефалічний бар'єр в умовах експериментальної порфіринопатії легко пропускає порфірини та/або їх попередники. Це можна пояснити тим, що вони гарно сорбуються тканиною мозку за рахунок високого вмісту води та інтенсивною васкуляризацією. Окрім того, оксидативний стрес є важливим механізмом реалізації їх деструктивних ефектів на головний мозок [8, 14, 15], що приводило до порушення інтенсивності ПОЛ та АОЗ тканини. Прооксидантний статус клітин головного мозку оцінювали за базальним рівнем ТБК-активних продуктів та інтенсивністю неферментативного Ре2+-аскорбатіндукованого ПОЛ. Базальний рівень ТБК-активних продуктів у експериментальній групі складав (547,8±36,7), у контрольній - (332,9±12,8) нмоль МДА/мг білка. Швидкість накопичення ТБК-активних продуктів у експериментальній і контрольній групах становила (117,6+8,3) і (36,1 ±5,5) нмоль МДА/мг білка за 1 хв відповідно (р<0,05) (табл. 1).
Таким чином, спостерігалось збільшення базального рівня в 1,7 раза та швидкості накопичення ТБК-активних продуктів у 3,3 раза, що свідчить про стимуляцію процесів ПОЛ (р<0,05). Стан системи АОЗ головного мозку щурів з порфіринопатією оцінювали за зміною активності її основних ферментативних складників. Так, глутатіонпероксидазна активність у головному мозку тварин експериментальної групи
складала (0,188±0,012), контрольної - (0,309±0,014) мкмоль GSSG/мг білка за 1 хв. Разом із тим, каталазна активність була на рівні (11,7±0,5) і (16,3±0,7) мкмоль Н202/мг білка за 1 хв відповідно (табл. 2).
Таблиця 1
Базальний рівень ТБК-активних продуктів та інтенсивність індукованого ПОЛ у гомогенаті кори _______головного мозку тварин при експериментальному порушенні порфіринового обміну_____
ТБК-активні продукти нмоль МДА/мг білка Інтенсивність індукованого ПОЛ нмоль МДА/мг білка за 1 хв
Контрольна група 332,9±12,8 36,1 ±5,5
Експериментальна група з порфіринопатією 547,8±36,7* 117,6+8,3*
Примітка: * - р<0,05 порівняно з контрольною групою.
Таблиця 2
Глутатіонпероксидазна та каталазна активність у гомогенаті кори головного мозку тварин при _____________________експериментальному порушенні порфіринового обміну__________________________________
глутатіонпероксидазна активність мкмоль GSSG/мг білка за 1 хв. каталазна активність мкмоль Н202/мг білка за 1 хв
Контрольна група 0,309±0,014 16,3±0,7
Експериментальна група з порфіринопатією 0,188±0,012* 11,7±0,5*
Примітка: * - р<0,05 порівняно з контрольною групою
Наведені результати показали зниження глутатіонпероксидазної активності в 1,6 раза, каталазної - в 1,4 раза, що свідчить про пригнічення роботи системи АОЗ на тлі порушеного порфіринового обміну.
В усіх живих системах існують прооксидантні чинники та механізми, стримування яких відбувається за рахунок системи АОЗ. Пояснити причини розвитку оксидативного стресу при порфіринопатії можна особливостями метаболізму порфіринів та/або їх попередників. Їх тривале надходженні у кору головного мозку у високих дозах значна кількість руйнується за участю мікросомальної системи, що окиснює токсичні речовини. Окиснення за цим шляхом відбувається під впливом цитохрому Р-450, при цьому як побічні продукти утворюються активні форми кисню, що залучаються до ланцюгових реакцій ПОЛ [6]. Відомо, що система цитохрому Р-450 представлена як у сірих так і білих структурах головного мозку [8, 9]. Отже, цитохром Р-450-залежний шлях генерації вільних радикалів у клітинах головного мозку при порфіринопатії можна враховувати як один з шляхів розвитку оксидативного стресу. Незалежно від шляху окиснення порфіринів та/або їх попередників утворюються активні форми кисню (АФК) [6]. Розвиток перекісних процесів викликає руйнування молекул антиоксидантів, зміну фосфоліпідного складу мембран, внаслідок чого порушується їх структурно-функціональна цілісність. Підвищення проникності мембран клітинних органел призводить до вивільнення гідролітичних ферментів, порушення іонного гомеостазу, зниження мембранного потенціалу, що, у свою чергу, супроводжується роз'єднанням окиснювального фосфорилювання у мітохондріях, і зменшує енергетичне забеспечення клітини [3, 16]. Ці події підсилюються тим, що різноманітні продукти ПОЛ здатні ковалентно взаємодіяти з окремими функціональними групами білків, і зумовлює їх полімеризацію та пошкодження амінокислотних залишків. Глутатіонпероксидаза, локалізована у цитоплазмі, ядрі та мітохондріях, є гомотетрамером, містить в активному центрі 4 атоми селену, що пов'язані з цистеїном, основна функція ферменту - нейтралізація перекису водню і гідроперекисів ліпідів [5]. Каталаза -гемовмісний білок, що локалізується у пероксисомах та діє у сполученій системі із супероксиддисмутазою, нейтралізує Н202. Надмолекулярна структура стабілізується 4 молекулами НАДФН [9]. Таким чином, обидва ферменти мають досить складну структуру, зміна якої при взаємодії з продуктами ПОЛ може призводити до порушення їх активності. Зв'язуючись з ДНК та білками ядерного хроматину, активні форми кисню також впливають на їх структуру і функцію, що зумовлює порушення зчитування генетичної інформації та проявляється зниженням активності синтетичних процесів у клітині. Таким чином, отримані нами дані свідчать про те, що вивчені нами ферменти приймають активну участь у розвитку оксидативного стресу в корі головного мозку експериментальних тварин як за рахунок посиленого утворення активних форм кисню, так і блокування функціональної активності ферментів системи АОЗ, зокрема глутатіонпероксидази та каталази. Окрім того, можливим є пригнічення біосинтезу вказаних ферментів. Лікування уражень головного мозку токсичного генезу є складним завданням. Це зумовлено низкою причин, однією з яких можна назвати відсутність лікарських препаратів, що активно впливають на патогенез захворювання, зокрема на розвиток оксидативного стресу і проникливість гематоенцефалічного бар'єру. Поява ліків, здатних пригнічувати перекисні процеси в корі головного мозку, може стати ефективним методом зменшення тяжкості пошкодження головного мозку в цілому, і зокрема, при порфіринопатії. Отримані у нашій роботі результати показали підвищення інтенсивності процесів ПОЛ у корі головного мозку щурів при порфіринопатії, що супроводжується зниженням активності ферментів системи АОЗ -глутатіонпероксидази та каталази. Ці дані свідчать про розвиток вільнорадикального пошкодження головного мозку
- одного з головних механізмів реалізації деструктивного впливу накопичених в організмі порфіринів та/або їх попередників та, ймовірно, можуть вказувати на тяжкість перебігу процесу.
Експериментальне накопичення в організмі порфіринів та/або їх попередників у щурів супроводжується порушенням прооксидантно-антиоксидантного балансу в корі головного мозку, що проявляється активацією процесів ПОЛ (збільшенням кількості ТБК-активних продуктів, підвищенням
інтенсивності індукованого ПОЛ) та пригніченням антиоксидантної системи (зменшенням глутатіонпероксидазної і каталазної активності).
Перспективи подальших досліджень у даному напрямку. Отримані у роботі дані можуть бути використані для розробки та оцінки ефективності нових методів лікування уражень головного мозку токсичного генезу на етапі їх доклінічних і клінічних випробувань.
1. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Жибина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. - С.Пб.: ИКС "Фолиант", 2000. - 200 с.
2. Зайцев В.М., Лифляндский В.Г., Маринкин В.И. Прикладная медицинская статистика. - СПб.: ФОЛИАНТ,
2003. - 429с.
3. Казимирко В.К., Мальцев В.И., Бутылин В.Ю., Горобец Н.И. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная терапия. - К.: Морион, 2004. -160 с.
4. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. - 1988. -№ 1. - С. 16-19.
5. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатионпероксидазы // Усп. совр. биол. - 1993. -113, № 1. -С. 107-122.
6. Ляхович В.В., Вавилин В.А., Зенков Н.К. Активированные кислородные метаболиты в монооксигеназных реакциях // Бюллетень CO РАМН. -2005.- 118, №4. -С. 7-12.
7. Науково-практичні рекомендації з утримання лабораторних тварин та роботи з ними / Ю.М.Кожемякін, О.С.Хромов, М.А.Філоненко, Г.А.Сайфетдінова. - К.:Авіцена, 2002. - 156с.
8. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньшикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А.Бондарь, Н.Ф. Круговых, В.А. Труфакин. - М.: Фирма «Слово», 2006. - 556 с.
9. Падалко В.И., Севастьянова Т.В. Клинические аспекты функционирования системы цитохрома Р-450 микросом печени // Вісник Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна. Серія: Медицина. -2005. - № 705, Вип. 11. - С. 110-21.
10. Петренко А.Ю., Ковалев Г.А., Грищенко В.И. Внутривенное введение эмбриональных нервных клеток крысам с хроническим отравлением бензолом // Проблемы криобиологии. - 2005. - 15, №1. -С. 71-78.
11. Руководство по клинической лабораторной диагностике. Ч.3. Клиническая биохимия: Учеб. пособие / М.А.Базарнова, З.П.Гетте, Л.И.Кальнова и др.; Под ред. проф. М.А.Базарновой, проф. В.Т.Морозовой. - 2-е изд., перераб. и доп. - К.: Вища шк., 2000. - 319 с.
12. Сернов Л.Н., Гацура В.В. Елементы экспериментальной фармакологии // М., 2000. - С.192.
13. Ткачишин В.С. Професійні захворювання опорно-рухового апарату та прилеглих структур, спричинені впливом ряду шкідливих виробничих факторів. Лекция 6. Физические, химические и биологические факторы в процессе производственной деятельности.// Український ревматологічний журнал. - 2006. - № 2(24) С.26-29.
14. Calabrese V., Scapagnini G., Latteri S. et al. Long-term ethanol administration enhances age-dependent modulation of redox state in different brain regions in the rat: protection by acetyl carnitine // Int. J. Tissue React. - 2002. - 24, № 3.
- P. 97-104.
15. Cullinan S.B., Zhang D., Hannink M. et al. Nrf2 is a direct PERK substrate and effector of PERK-dependent cell survival // Mol. Cell. Biol. - 2003. - Vol.23. - P.7198-7209.
16. Kirkman H.N., Ferraris M.R., Gaetani G.F. Mechanisms of protection of catalase by NADPH: kinetics and stoichiometry // J. Biol. Chem. - 1999. - 274, №20. -P. 13908-13914.
ПРООКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПОРФИРИНОПАТИИ Крыжная С.И., Березняков;! А.И.
Изучено нарушение прооксидантно-
антиоксидантного баланса в головном мозге в условиях экспериментальной порфиринопатии. Показано, что данная патология характеризуется активацией свободнорадикальных процессов (увеличению количества ТБК-активных продуктов, повышению интенсивности индуцированного ПОЛ) и угнетению антиоксидантной системы (уменьшению глутатионпероксидазной и каталазной активности).
Ключевые слова: порфиринопатия, головной мозг, перекисное окисление липидов, антиоксидантная система.
Стаття надійшла 15.05.2011 р.
PROOXIDANT-ANTIOXIDANT SYSTEM OF RATS BRAIN DUE TO EXPERIMENTAL PORFIRINOPATIA Kryzhnaya S.I., Bereznyakova A.I.
It is studied the disturbance of prooxidant -antioxidant balance in the brain under the influence of experimental porphyrinopathia. It is shown that this pathology is characterized by the activation of free-radical processes (to increase in the amount of TBA-active products, to an increase the intensity of induced LPO) and to the inhibition of antioxidant system (decrease glutationperoxidase and catalase activity) .
Key words: porphyrinopathia, the brain, lipid peroxidation, antioxidant system.
