CC BY
32
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія, екологія. Visnik Dnipropetrovs’kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia
Visnyk of Dnepropetrovsk University. Biology, ecology. 2013. 21(1)
ISSN 2310-0842
www.ecology.dp.ua
УДК 636.1.083.38:591.1
Прооксидантний і антиоксидантний баланс крові
u •• •• •• • • і •
коней української верхової породи в динаміці фізичних навантажень
А.В. Андрійчук1, І.В. Ткачова1, Г.М. Ткаченко2, Н.М. Кургалюк2
1Інститут тваринництва Національної академії аграрних наук України, Харків, Україна 2Інститут біології та охорони навколишнього середовища, Померанський університет, Слупськ, Польща
Досліджено вміст маркерів оксидаційного стресу та активність ферментів антиоксидантного захисту у крові, плазмі та суспензії еритроцитів коней української верхової породи, які використовуються у класичних видах кінного спорту. Встановлено достовірні зміни інтенсивності перекисного окиснення ліпідів еритроцитів та вмісту похідних оксидаційної модифікації білків плазми, а також активності ферментів антиоксидантного захисту крові спортивних коней у динаміці тренувань. Виявлено істотне зниження вмісту малонового діальдегіду у суспензії еритроцитів і продуктів окиснювальної модифікації білків плазми коней після фізичних навантажень, що свідчить про розвиток ефективних адаптаційних реакцій. У динаміці тренінгу спостерігалось також істотне підвищення активності ферментів антиоксидантного захисту (супероксиддисмутази та глутатіонредуктази). Кореляційний аналіз залежності між маркерами оксидаційного стресу та системи антиоксидантного захисту виявив важливу роль ферментів глутатіо-нової ланки, які попереджують розвиток пероксидації ліпідів і білків під час фізичних навантажень у коней української верхової породи. Таким чином, рівень маркерів оксидаційного стресу та активність ферментів антиоксидантного захисту у спортивних коней можуть бути інформативними показниками для оцінки рівня тренованості коней спортивного напряму працездатності.
Ключові слова: прооксидантний та антиоксидантний баланс; українська верхова порода; динаміка фізичних навантажень
Prooxidant and antioxidant balance in the blood of Ukrainian Warmblood horses during the exercises
A. Andriichuk1, I. Tkachova1, H. Tkachenko2, N. Kurhaliuk2
1Institute of Animal Breeding of National Academy of Agricultural Sciences, Kharkiv, Ukraine 2Institute of Biology and Environmental Protection, Pomeranian University, Slupsk, Poland
The goal of our study was an analysis of oxidative stress markers level and antioxidant defences in the blood of Ukrainian Warmblood horses at the rest and after training. There were significant decrease in the thiobarbituric acid reactive substrates (TBARS) content and lipid hydroperoxides level in the erythrocytes and plasma of horses after the training. There were also significant decreases in the values of the aldehyde derivatives of protein oxidation in the plasma. An antioxidant defence in the blood of horses after the training was provided by the activation of superoxide dismutase and glutathione reductase. Correlation analysis of the relationship between markers of oxidative stress and antioxidant defence system confirmed the important role of glutathione antioxidant system for prevention of oxidative stress during exercises. The level of oxidative stress markers and activity of antioxidant defences in the blood of sport horses can be sensitive and informative parameters for the assessment of equine performance.
Keywords: prooxidant and antioxidant balance; Ukrainian Warmblood horses; exercises
1 Інститут тваринництва Національної академії аграрних наук України, Харків. E-mail: [email protected]
2Кафедра фізіології тварин, кафедра зоології, Інститут біології та охорони навколишнього середовища,
Померанський університет, вул. Арцизевського, 22b, 76-200 Слупськ, Польщаю E-mail: [email protected]
institute ofAnimal Breeding ofNational Academy ofAgricultural Sciences, Kharkiv, Ukraine. E-mail: [email protected] 2Department of Animal Physiology, Department of Zoology, Institute of Biology and Environmental Protection, Pomeranian University, ArciszewskiStr., 22b, 76-200 Slupsk, Poland. E-mail: [email protected]
© А.В. Андрійчук, І.В. Ткачова, Г.М. Ткаченко, Н.М. Кургалюк
Вступ
Кінноспортивні змаганя створюють умови для ретельного відбору коней з урахуванням їх породних особливостей, походження, екстер’єрних даних і функціональних показників. Визначення потенційних можливостей коней, призначених для використання у класичних видах кінного спорту (конкур, виїздка, триборство) вимагає поглибленого усебічного дослідження їх анатомо-морфологічних, фізіологічних та біохімічних показників, які відіграють важливу роль для конкретного виду рухової активності (Laskov, 1997).
Інтенсивні фізичні навантаження викликають в організмі коней кисневу недостатність, що спричинює тканинну гіпоксію та активує процеси перекисного окис-нення ліпідів (ПОЛ) (Art and Lekeux, 2005; Kirschvink et al., 2008). Відповідно знижується спортивна витривалість коней, що часто супроводжується функціональними розладами та розвитком різноманітних патологічних станів організму, погіршуються результати змагань (Chiaradia et al., 1998; Art and Lekeux, 2005; Kirschvink et al., 2008). Інтенсифікація процесів ПОЛ в організмі спортивних коней під впливом фізичних навантажень може модифікувати систему антиоксидантного захисту (АОЗ) (Marlin et al., 2002; Kinnunen et al., 2005; Soares et al., 2011). Збільшення генерації активних форм кисню (АФК) та зменшення потужності системи АОЗ під впливом виснажливих фізичних навантажень супроводжуються оксидативним стресом (Marlin et al., 2002; Art and Lekeux, 2005; Kinnunen et al., 2005; Kirschvink et al.,
2008). Із літературних джерел відомо, що надлишкове накопичення продуктів ПОЛ викликає набряк мітохонд-рій, роз’єднання процесів дихання та окисного фосфо-рилювання, ушкодження сульфгідрильних груп тіолових ферментів (Glazkov and Razdajbedin, 2010). У силу своєї стабільності продукти ПОЛ, зокрема дієнові кон’югати та основний продукт реакції з тіобарбітуровою кислотою - малоновий діальдегід (МДА) - найінформативні-ші показники ліпопероксидації (Vladimirov and Archakov, 1972; Antonov, 2010).
Рівень маркерів оксидаційного стресу та активність ферментів АОЗ можуть бути також корисними показниками відповідності використаних обсягів фізичних навантажень функціональним можливостям організму коней (Marlin et al., 2002; Kirschvink et al., 2008; Antonov, 2010; Soares et al., 2011). У спортивних коней, які перебувають у тривалому тренінгу, вміст маркерів оксидативного стресу істотно знижується після фізичних навантажень, відбувається активація системи АОЗ (Tkachenko et al., 2011; Andrijchuk et al., 2012a, 2012b). У спортивних коней під впливом фізичних навантажень відбуваються специфічні зміни резистентності еритроцитів до дії різних гемолітичних чинників (Andrijchuk et al., 2012d). Тому рівень маркерів оксидаційного стресу та показники активності ферментів АОЗ можуть як відображати метаболічні реакції, пов’ язані із процесами адаптації до фізичних навантажень, так і виявляти глибинні біодест-руктивні зміни, спричинені перетренуванням і загрозою розвитку патологічних змін систем і органів.
Мета цього дослідження - оцінити вміст маркерів оксидаційного стресу (первинних і вторинних продуктів
ПОЛ, молекул середньої маси, похідних оксидаційної модифікації білків) та активності ферментів АОЗ (супе-роксиддисмутази, каталази, глутатіонредуктази, глутаті-онпероксидази, церулоплазміну) у коней української верхової породи спортивного напряму працездатності в динаміці фізичних навантажень (у стані спокою та після фізичного навантаження).
Матеріал і методи досліджень
Об’єкт досліджень - 18 клінічно здорових спортивних коней 8-15-річного віку української верхової породи (рис. 1), які активно використовуються у класичних видах кінного спорту (конкур, виїздка, триборство). Коней утримували на базі ДЮСШ кінного спорту «Буревісник» (м. Львів). Вони брали активну участь у кінноспортивних змаганнях різних рівнів. Умови годівлі дослідних коней були однаковими, до того ж усі тварини перебували у тривалому спортивному тренінгу.
Для визначення вмісту маркерів оксидаційного стресу та активності ферментів АОЗ у крові спортивних коней у динаміці тренінгу всі дослідні тварини піддавалися фізичному навантаженню середнього об’ єму та середньої інтенсивності: рух кроком - 5 хв, рух риссю - 10 хв, рух кроком - 10 хв, рух риссю - 10 хв, рух кроком - 5 хв, рух галопом - 10 хв, рух кроком - 10 хв (Nerodenko,
2009). Фізичне навантаження тривало одну годину.
Кров у коней відбирали з яремної вени у пробірки з антикоагулянтом (K-EDTA, фірма MedLab) двічі: вранці, у стані спокою, та одразу після тренування. Для отримання плазми цільну кров центрифугували упродовж 10 хв при 3000 об./хв. Суспензію еритроцитів отримували промиванням осаду охолодженим фізіологічним розчином тричі. Уміст продуктів, які реагують із 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК-продукти), визначали у крові, плазмі та суспензії еритроцитів. Кетонові та альдегідні похідні оксидаційно модифікованих білків (ОМБ) та активність ферментів АОЗ визначали у суспензії еритроцитів і в плазмі. Для визначення активності супероксиддисмутази (СОД), глутатіонредуктази (ГР) та глутатіонпероксидази (ГПО) використовували гемолізат крові. Активність каталази та вміст церулоплазміну, а також уміст молекул середньої маси та дієнових кон’югатів визначали у плазмі крові.
ТБК-активні сполуки оцінювали за вмістом продуктів, які реагують із 2-тіобарбітуровою кислотою (мало-новий діальдегід, МДА), виражали у мкмоль/л (Kamyshnikov, 2004). Рівень окиснювального пошкодження білків оцінювали за вмістом альдегідних (ОМБ370) і кетонових похідних (ОМБ430) оксидаційної модифікації білків у реакції з 2,4-динітрофенілгідразином, використовуючи коефіцієнт поглинання 22000 ммоль-1^см-1, і виражали в нмоль/мл (Levine et al., 1990). Уміст дієнових кон’югатів визначали в плазмі з використанням суміші гептан -ізопропанол у кислому середовищі (рН 2,0). У гептановому шарі визначали вміст дієнових кон’ югатів за ступенем світлопоглинання в ультрафіолетовій ділянці спектра та виражали у А233/мл (Kamyshnikov, 2004). Концентрацію середніх молекул у сироватці крові визначали спектрофотометричним методом і виражали у мг/л. Метод базується на осадженні високомолекулярних біл-
ків плазми крові з використанням хлорної кислоти та етилового спирту з такою фотометрією за довжини хвилі 210 нм (Kamyshnikov, 2004). Активність супероксид-дисмутази визначали в реакції окиснення кварцетину та виражали в од. акт./мл (Kostjuk et al., 1990). Активність каталази оцінювали в реакції з молібдатом амонію та виражали у мкмоль/хв^л крові (Koroljuk et al., 1988). Активність глутатіонредуктази визначали в реакції перетворення НАДФН2 і відновленого глутатіону, виражали в нмолях НАДФН2/хв^мл крові (Glatzle et al., 1974). Активність глутатіонпероксидази визначали за швидкістю окиснення глутатіону за присутності гідроперекису
Отримані результати статистично проаналізовано за допомогою пакета програм Statistica 8.0 (StatSoft). Після аналізу нормальності вибірок за допомогою критеріїв Шапіро - Вілкі та Лілліфорса обраховували середнє арифметичне значення та похибку. Вірогідність різниці між групами тварин до і після фізичного навантаження визначали за відхиленням критерію Вілкоксона (Р < 0,05). Кореляційні залежності між досліджуваними параметрами оцінювали за допомогою рангів Спірмана (Zar,
1999).
Результати та їх обговорення
Підвищення генерації АФК під впливом фізичних навантажень спричинює утворення багатьох продуктів вільнорадикального окиснення (дієнові кон’югати, ма-лоновий діальдегід, перекиси, гідроперекиси, оксида-ційно модифіковані білки), які негативно впливають на функціонування клітин у цілому (Galaktionova et al., 1998; Deaton and Marlin, 2003; Niki, 2009). Молекули середньої маси (МСМ) також можуть бути інформативним показником оксидативного пошкодження та інтенсивності перебігу процесів ПОЛ у коней різних порід (Andrijchuk et al., 2012c). Циркулюючи в кров’яному руслі МСМ як продукти метаболізму, можуть відігравати роль факторів мікрооточення, що здатні впливати на морфофункціональний стан мембрани еритроцитів, індукуючи оксидативний стрес (Kamyshnikov, 2004).
третинного бутилу та виражали у в мкмолях GSH/хв^мл крові (Moin, 1986). Уміст церулоплазміну оцінювали в реакції окиснення p-фенілендіаміну та виражали у мг/л (Kamyshnikov, 2004). Загальну антиоксидаційну активність (ЗАОА) плазми та еритроцитів визначали в реакції інгібування аскорбат- та залізоіндукованого окиснення Твіну-80 до МДА та виражали у % (Galaktionova et al.,
1998). Усі лабораторні дослідження проводили на кафедрі фізіології тварин Інституту біології та охорони середовища Поморської Академії (м. Слупськ, Польща) в рамках міжнародної співпраці.
Активація вільнорадикального окиснення під впливом МСМ може спричинювати зміни фізико-хімічних властивостей мембран еритроцитів та їх проникність (Kamyshnikov, 2004). Підвищення вмісту оксидаційних маркерів у крові вважається інформативною ознакою, що свідчить про деградацію біополімерів, молекулярних комплексів і порушення структурно-метаболічних і фі-зико-хімічних властивостей мембран (Deaton and Marlin, 2003). У зв’язку з цим перший етап наших досліджень -визначення вмісту дієнових кон’югатів, МСМ та ТБК-активних продуктів у крові коней української верхової породи у стані спокою та після фізичних навантажень (рис. 2, 3).
Зареєстровано різноспрямовані зміни рівня маркерів оксидаційного стресу у коней під впливом фізичних навантажень. Після тренувань спостерігалось істотне зниження вмісту дієнових кон’югатів у плазмі на 37% (Р < 0,05) (див. рис. 2 а), натомість вміст МСМ після тренувань недостовірно збільшувався на 46% (Р > 0,05) (див. рис. 2 б). Оскільки утворення дієнових кон’ югатів виявляється на стадії ініціації вільних радикалів (Vladimirov and Archakov, 1972), істотне зменшення їх рівня у плазмі крові коней після тренінгу може свідчити про активацію системи АОЗ. Наші попередні дослідження підтверджують це припущення (Tkachenko et al., 2011; Andrijchuk et al., 2012a, 2012b). За різних патологічних і стресових станів у плазмі крові збільшується вміст МСМ (Andrijchuk et al., 2012c). Такі зміни рівня
Рис. 1. Жеребець української верхової породи (фото Ірини Ткачової)
МСМ пов’язують із порушенням транспорту амінокислот, підвищенням проникності клітин, активацією процесів пероксидації у головному мозку (Kamyshnikov, 2004; Andrijchuk et al., 2012c). Оскільки фізичні навантаження - певною мірою стресовий чинник досліджуваних спортивних коней, збільшення вмісту МСМ плазми після фізичних навантажень відображає відповідь їх
організму на тренінг. Аналіз процесів ПОЛ крові коней УВП у стані спокою показав найвищий вміст ТБК-активних продуктів в еритроцитах і цільній крові (14,36 ± 0,43 і 13,99 ± 0,83 мкмоль/л відповідно). Найменший вміст ТБК-активних продуктів виявлено у плазмі (5,68 ± 0,59 мкмоль/л) (рис. 3).
« S
«
сі
<
V iTf'y-■■■
и
щ
Ші
:\r -
ш
и
Стан спокою
Після тренування
Стан спокою
Після тренування
16
б
а
14
12
lO
б
4
2OO
2
O
O
Рис. 2. Вміст дієнових кон’югатів (а) і молекул середньої маси (б) у плазмі коней української верхової породи в динаміці фізичних навантажень: * - статистично істотні відмінності (Р < 0,05) між показниками, отриманими до та після фізичного навантаження (тест Вілкоксона)
16 -14 12 -В- 1O
a s
к
s 64 2 -
ТБК-активні продукти
O -
і
1 ■
■
..'•‘ rV ,j* ■■
■
Стан спокою
Після тренування
Кров
ФІГі-
ІГ- я - -
І
;-і-: % ■::?3
...
■
Стан спокою Після Стан спокою Після
тренування тренування
Плазма Еритроцити
Рис. 3. Вплив фізичного навантаження на вміст ТБК-активних продуктів у крові, плазмі та суспензії еритроцитів спортивних коней у стані спокою та після тренування: * - див. рис. 2
Інтенсивність вільнорадикальних процесів визначається, передусім, особливостями метаболізму клітин і тканин, їх функціональним навантаженням (Vladimirov and Archakov, 1972). На нашу думку, високий вміст ТБК-активних продуктів саме в еритроцитах зумовлений їх мембранною структурою. Еритроцити сприятливі до оксидативного стресу в результаті значного вмісту поліненасичених жирних кислот в їх клітинних мембранах, високого вмісту в клітинах кисню та гемоглобіну -потенційно сильних активаторів окиснювальних процесів (Clemens and Waller, 1987).
У наших дослідженнях виявлено істотне зниження вмісту ТБК-активних продуктів в еритроцитах (на 14%, Р < 0,01) після фізичних навантажень. Вміст МДА у крові неістотно знижувався (на 12%, Р > 0,05), а у плазмі не зазнавав істотних змін (рис. 3). Під впливом систематичних фізичних навантажень розвиваються адаптаційні процеси, що супроводжуються зниженням інтенсивності оксидативного стресу (Deaton and Marlin, 2003). Зокрема, у бігунів після марафону не спостерігали збільшення
вмісту ТБК-активних продуктів у крові. Також у крові тренованих людей після інтенсивних вправ на велотренажері не виявлено інтенсифікації процесів ПОЛ (Deaton and Marlin, 2003). Треновані особи у стані спокою мають вищий рівень ТБК-активних продуктів і діє-нових кон’ югатів у плазмі, ніж після фізичних навантажень (Deaton and Marlin, 2003).
Уміст ТБК-активних продуктів в еритроцитах спортивних коней суттєво знижувався власне після фізичних навантажень, що свідчить про розвиток ефективних адаптаційних змін до систематичних тренувань в організмі коней (Andrijchuk et al., 2012b). Встановлене нами істотне зниження вмісту ТБК-активних продуктів в еритроцитах спортивних коней після тренувань свідчить, вочевидь, про ефективну адаптацію їх до фізичних навантажень шляхом модифікації процесів метаболізму в напрямку зменшення інтенсивності оксидаційного стресу.
Активні форми кисню поряд з окисненням ліпідів спричинюють також оксидаційну модифікацію білків, що викликає порушення конформації білкових молекул,
їх агрегацію та фрагментацію (Ко^пук й аі., 2009). У зв’язку з особливостями хімічної будови та структури протеїнів процес ОМБ пов’язаний з утворенням великої кількості окиснених продуктів радикальної та нерадика-льної природи. Наслідком пошкоджень окиснених білків є різке підвищення активності мультикаталітичних протеаз (Коїієпук й аі., 2009). Разом із цим, деструкція білків - надійніший маркер окиснювальних пошкоджень тканин, ніж продукти ПОЛ, оскільки похідні ОМБ стабільніші (Коїієпук й аі., 2009). Зважаючи на це, наступним етапом наших досліджень став аналіз похідних ОМБ у плазмі та еритроцитах спортивних коней у стані спокою та після фізичних навантажень (рис. 4).
Аналіз вмісту альдегідних і кетонових похідних ОМБ у стані спокою виявив різноскеровані зміни значень у плазмі та еритроцитах тварин. Останні характеризуються нижчим вмістом модифікованих похідних білків порівняно з плазмою. Високий рівень процесів модифікації білків плазми є “віддзеркаленням” окиснюва-льних змін в інших тканинах і органах, а не лише в еритроцитах. Натомість після фізичних навантажень спостерігалося достовірне зниження вмісту альдегідних похідних у плазмі (на 4%, Р < 0,05), а вміст альдегідних і кетонових похідних ОМБ в еритроцитах (рис. 4) недостовірно зменшився (на 42%, Р > 0,05 та 27%, Р > 0,05 відповідно). Окиснення білків під дією АФК з утворенням альдегідо- та кетогруп також виконує адаптаційну
функцію при систематичних фізичних навантаженнях, що супроводжуються активацією протеосомних комплексів, які вибірково руйнують окиснені білки (Radak et al., 2008). Вочевидь, істотне зниження рівня альдегідних похідних оксидаційно модифікованих білків плазми та неістотне зменшення вмісту альдегідних і кетонових похідних ОМБ у суспензії еритроцитів спортивних коней після фізичного навантаження свідчить про ініціацію процесів протеолітичної деградації окиснених білкових молекул.
У механізмах регуляції вільнорадикальних і перок-сидних процесів ключову роль відіграють ферменти АОЗ, такі як супероксиддисмутаза, каталаза, глутатіон-редуктаза, глутатіопероксидаза, церулоплазмін тощо (Marlin et al., 2002; Kinnunen et al., 2005; Kirschvink et al., 2008; Antonov, 2010; Soares et al., 2011; Andrijchuk et al., 2012b). Підвищення ефективності функціонування системи АОЗ в організмі спортивних коней запобігає виникненню негативних наслідків, які викликані надмірною інтенсивністю перебігу оксидаційного стресу у тканинах при напруженій м’ язовій діяльності, і тим самим підвищує їх стійкість до фізичних навантажень (Deaton and Marlin, 2003; Kinnunen et al., 2005; Kirschvink et al., 2008; Andrijchuk et al., 2012a, 2012b). Наступним етапом наших досліджень було визначення активності ферментів системи АОЗ у крові спортивних коней у стані спокою перед тренуванням і після фізичних навантажень (табл. 1).
Рис. 4. Рівень альдегідних (ОМБз70) та кетонових (ОМБ4з0) похідних окиснювальної модифікації білків у суспензії еритроцитів та плазмі крові спортивних коней української верхової породи до і після фізичних навантажень: * - див. рис. 2
Таблиця 1
Активність ферментів антиоксидантного захисту у крові коней української верхової породи, призначених для використання у класичних видах кінного спорту, в динаміці тренувань
Ферменти антиоксидантного захисту Перед тренуванням Після фізичних навантажень
Супероксиддисмутаза, од. акт./мл 11,89 і 0,48 16,30 і 1,12*
Каталаза, мкмоль/хвл 2,79 і 0,26 3,08 і 0,36
Глутатіонредуктаза, нмоль НАДФН2/хв-мл 1,13 і 0,16 1,66 і 0,23*
Глутатіонпероксидаза, мкмоль GSH/хв-мл 0,96 і 1,35 1,35 і 0,26
Церулоплазмін, мг/л 31,16 і 4,31 40,32 і 6,32
Примітка: * - статистично достовірні зміни (Р < 0,05) між показниками, отриманими у стані спокою та після фізичного навантаження (тест Вілкоксона).
Найпотужнішим природним антиоксидантом і ферментом першої ланки АОЗ є СОД, яка здійснює реакцію дисмутації супероксидних аніон-радикалів і перетворює їх на менш реакційно здатні молекули пероксиду водню (Deaton and Marlin, 2003). Нами встановлене істотне збільшення активності СОД після тренінгу коней (на 37%, Р < 0,01). Після фізичних навантажень активність ката-лази у крові досліджуваних коней також неістотно зростала (на і0%, Р > 0,05). Наші дані підтверджують результати, отримані раніше (Soares et al., 2011) щодо біохімічних і антиоксидантних змін у плазмі та еритроцитах коней до і після змагань із подолання перешкод. Ці автори також встановили, що у крові спортивних коней ефективне обмеження розвитку оксидативного стресу після змагань відбувалося за рахунок зниження вмісту ТБК-активних продуктів, і визначальну роль у цих процесах відігравала саме СОД. Спрямованість фізичних навантажень у коней спортивного та призового напряму працездатності визначають зміни в антиоксидантній системі (Kirschvink et al., 2008). Активність СОД, зокрема, підвищувалася у коней стандартбредної породи після 12-тижневого періоду тренувань і позитивно корелювала зі збільшенням споживання кисню (VO2 max) під час фізичних навантажень (Kirschvink et al., 2008).
Клітинні механізми АОЗ пов’язані також із функціонуванням потужної глутатіонової ланки, що включає низку ферментів: глутатіонредуктазу, глутатіон^-тран-сферазу, глутатіонпероксидазу та кофактори (глутатіон, НАДФН) (Deaton and Marlin, 2003; Kirschvink et al., 2008). Її захисні функції під час оксидативного стресу визначаються специфічним парціальним внеском кожного індивідуального компонента. Глутатіонпероксидаза каталізує розщеплення пероксиду водню та гідропере-кисів жирних кислот за участю відновленого глутатіону (Deaton and Marlin, 2003; Kirschvink et al., 2008). Регенерацію окисненого глутатіону каталізує глутатіонредук-таза, завдяки чому забезпечується дія глутатіонперокси-дази. Після фізичних навантажень у коней істотно зростала активність ГР (на 47%, Р < 0,05) та недостовірно -активність ГПО (на 41%, Р > 0,05). Наші результати узгоджуються з літературними даними, згідно з якими активація глутатіонової ланки АОЗ відбувається у відповідь на виснажливі тривалі фізичні навантаження значного об’ єму та середньої інтенсивності. Із літературних джерел також відомо, що більші за об’ємом фізичні навантаження на витривалість, такі як тривалі дистанційні пробіги коней на 80 і 210 км, викликають істотне збільшення активності глутатіонової ланки системи АОЗ (Deaton and Marlin, 2003; Gondim et al., 2009).
У функціонуванні АОЗ важливу роль відіграє церу-лоплазмін - мідьумісна оксидаза крові, яка бере участь у транспорті та утилізації міді, нейроендокринній регуляції, гемопоезі, регуляції рівня біогенних амінів (Kamyshnikov, 2004). Це головний антиоксидант плазми, який бере активну участь у виведенні продуктів розпаду клітин і субклітинних структур із вогнища запалення (Kamyshnikov, 2004). У наших дослідженнях встановлено недостовірне збільшення вмісту церулоплазміну (на 29%, Р > 0,05) у крові коней після тренування (табл. і). Підвищення активності ферментів системи АОЗ у коней після фізичних навантажень можна розглядати як компенсаторну реакцію організму тварин, спрямовану на
нормалізацію процесів ПОЛ і зменшення шкідливих впливів АФК, викликаних фізичним навантаженням, що підтверджується статистично неістотним зниженням антиоксидантної активності плазми та еритроцитів після фізичних навантажень (рис. 5).
У коней спортивного напряму працездатності тривала адаптація організму до фізичних навантажень супроводжується специфічними змінами перебігу метаболічних реакцій. Різні за об’ємом та інтенсивністю систематичні фізичні навантаження спрямовані на вдосконалення техніки стрибків, виїждженості та витривалості коней, модифікують рівновагу між оксидаційним стресом і системою АОЗ в організмі цих тварин у напрямі попередження оксидаційних порушень метаболізму. Статистичний аналіз залежності між маркерами оксидаційного стресу та активністю ферментів АОЗ як у стані спокою, так і після фізичних навантажень виявив взаємозв’ язок між досліджуваними параметрами (табл. 2).
Уміст дієнових кон’ югатів плазми коней у стані спокою залежить від активності глутатіонредуктази (r = -0,608, Р < 0,01). Вихідний вміст ТБК-активних продуктів у крові безпосередньо пов’язаний з умістом альдегідних похідних оксидаційно модифікованих білків еритроцитів (r = 0,618, Р < 0,01). У стані спокою рівень ТБК-активних продуктів еритроцитів (r = -0,503, Р < 0,05), як і вміст альдегідних похідних оксидаційно модифікованих білків плазми (r = 0,613, Р < 0,01) пов’ язаний з антиоксидаційними властивостями церуло-плазміну. Активність СОД у стані спокою також корелює з умістом церулоплазміну (r = -0,672, Р < 0,05).
Таким чином, інтенсивність перебігу вільнорадика-льних реакцій в організмі коней у стані спокою визначається активністю ферментів глутатіонової ланки АОЗ та антиоксидантними властивостями церулоплазміну, які ефективно обмежують розвиток оксидативного стресу. Після фізичних навантажень зменшення вмісту дієнових кон’ югатів безпосередньо пов’ язане із загальними анти-оксидаційними властивостями еритроцитів (r = 0,602, Р < 0,01). Спричинений фізичними навантаженнями оксидативний стрес лімітується зростанням вмісту середніх молекул за рахунок збільшення вмісту ТБК-активних продуктів у крові (r = 0,506, Р < 0,05) та підвищенням активності глутатіонпероксидази (r = 0,606, Р < 0,01). Також уміст ТБК-активних продуктів у крові визначається інтенсивністю перебігу оксидаційної модифікації еритроцитів під впливом фізичних навантажень (r = 0,639, Р < 0,01 та r = 0,483, Р < 0,05 для альдегідних і кетонових похідних відповідно). Підтримання ТБК-активних продуктів плазми після тренувань на вихідному рівні безпосередньо пов’ язане із процесами ок-сидаційної модифікації білків плазми (r = 0,490, Р < 0,05), що, у свою чергу, спричинює зниження активності глутатіонредуктази (r = -0,566, Р < 0,05), яка бере участь в елімінації шкідливих впливів АФК. Наші дослідження засвідчили, що інтенсивність процесів ліпопероксидації та окисної модифікації білків у коней спортивного напряму працездатності лімітується активністю ферментів глу-татіонової ланки АОЗ. Процеси ПОЛ і ОМБ у крові коней у динаміці тренувань безпосередньо пов’язані між собою та, вочевидь, певною мірою відображають відповідність обсягів використовуваних фізичних навантажень функціональним можливостям організму цих коней.
%
68
66
64
62
6o
58
56
"Я
A SW*-'
-;‘rf j .M __________:
ift
Стан спокою І Після тренування Плазма
Стан спокою І Після тренування Еритроцити
Рис. 5. Загальна антиоксидантна активність (ЗАОА) плазми та еритроцитів крові коней української верхової породи у стані спокою перед тренуванням і після фізичних навантажень
Кореляційні залежності між умістом маркерів оксидаційного стресу та системою АОЗ у крові коней української верхової породи в динаміці тренінгу
Таблиця 2
54
Зв’язок між параметрами Коефіцієнт кореляції, R Достовірність, p
Стан спокою перед тренуванням
Дієнові кон’югати - глутатіонредуктаза -0,608 <0,01
ТБК-активні продукти (кров) - ОМБ370 (еритроцити) 0,618 <0,01
ТБК-активні продукти (еритроцити) - церулоплазмін -0,503 <0,05
ОМБ370 (плазма) - церулоплазмін 0,613 <0,01
ЗАОА (плазма) - глутатіонпероксидаза -0,672 <0,01
СОД - церулоплазмін -0,672 <0,05
Після тренування
Дієнові кон’югати - ЗАОА (еритроцити) 0,602 <0,01
Середні молекули - ТБК-активні продукти (кров) 0,506 <0,05
Середні молекули - ГПО 0,606 <0,01
ТБК-активні продукти (кров) - ОМБ370 (еритроцити) 0,639 <0,01
ТБК-активні продукти (кров) - ОМБ430 (еритроцити) 0,483 <0,05
ТБК-активні продукти (плазма) - ОМБ370 (плазма) 0,490 <0,05
ТБК-активні продукти (плазма) - ГР -0,566 <0,05
Висновки
Маркери оксидативного стресу (вміст дієнових кон’югатів, молекул середньої маси, ТБК-активнних продуктів та оксидаційно модифікованих білків), а також активність ферментів антиоксидантного захисту у крові коней спортивного напряму працездатності - чутливі та інформативні показники, які можуть бути використані для оцінки адекватності фізичних навантажень і відображати рівень їх тренованості.
Суттєве зниження вмісту ТБК-активних продуктів в еритроцитах і альдегідних похідних оксидаційної модифікації білків у плазмі після фізичних навантажень у коней української верхової породи свідчить про розвиток ефективних адаптаційних реакцій в їх організмі, пов’ язаних із систематичними тренуваннями з удосконалення техніки стрибків, витривалості та виїждженості.
Систематичний тренінг і активна участь у змаганнях із класичних видів кінного спорту у коней української верхової породи викликають різноспрямовані модифікаційні зміни метаболізму за рахунок підтримання балансу між прооксидантами та системою АОЗ, що запобігає негативному впливу АФК на клітинні та субклітинні структури. Кореляційний аналіз між маркерами оксидативного стресу та активністю ферментів антиоксидантного захисту, як у стані спокою, так і після фізичних навантажень,
показав, що для коней української верхової породи, спеціалізованої для використання в кінному спорті, важлива роль в антиоксидантному захисті відведена саме глута-тіоновій ланці, яка суттєво обмежує розвиток оксидати-вного стресу під час фізичних навантажень.
Дослідження особливостей перебігу метаболічних процесів, пов’язаних із функціонуванням системи антиоксидантного захисту та інтенсивністю процесів ліпопе-роксидації у спортивних коней на різних етапах змагально-тренувальної діяльності залишається актуальним, оскільки дозволяє вивчати адаптаційні процеси до фізичних навантажень різного об’єму та інтенсивності, оцінювати рівень тренованості та визначити чинники, що лімітують їх працездатність. Подальше дослідження про- та антиоксидантного балансу коней спортивного напряму працездатності в динаміці тренінгу сприятиме науковому обґрунтуванню оцінки адекватності фізичних навантажень та розробки ефективних корекційних тренувальних програм спортивних коней.
Acknowledgments
This study was carried out during Anastasiia Andriichuk’ Scholarship Program supported by The International Visegrad Fund (N51200912) in the Department of Animal Physiology, Institute of Biology and Environmental Protection,
Pomeranian University (Slupsk, Poland). We thank to The
International Visegrad Fund for the support of our study.
Бібліографічні посилання
Andrijchuk, A.V., Tkachova, I.V., Tkachenko, G.M., Kurgaljuk, N.M., 2012a. Oksidativnyj stress u sportivnyh loshadej pod vlijaniem fizicheskih nagruzok [Oxidative stress in sport horses under the influence of physical activity]. Nauchnoe obespechenie razvitija konevodstva: Mezhdunarodnaja
nauchno-prakticheskaja konferencija. Divovo, 93-98 (in Russian).
Andrijchuk, A.V., Tkachova, I.V., Tkachenko, G.M., Kurgaljuk, N.M., Vartovnyk, M.S., 2012b. Markery oksydatyvnogo stresu u konej, shho vykorystovujut’sja u vyi’zdci v dynamici treningu [Markers of oxidative stress in horses used in dressage training in the dynamics]. Pryrodnychyj Al’manah 17, 32-43 (in Ukrainian).
Andrijchuk, A.V., Tkachova, I.V., Tkachenko, G.M., Kurgaljuk, N.M., 2012c. Gematologichni pokaznyky ta prooksydatyvni markery u krovi kobyl arabs’koi’ chystokrovnoi’ ta velykopol’skoi’ porid [Hematological indices and prooksydatyvni markers in blood and purebred Arabian mares velykopolskoyi rocks]. Pryrodnychyj Al’manah 17, 17-31 (in Ukrainian).
Andrijchuk, A.V., Tkachova, I.V., Tkachenko, G.M., Kurgaljuk, N.M., Matjuha, I.O., 2012d. Zminy rezystentnosti
erytrocytiv peryferijnoi’ krovi u sportyvnyh konej pid vplyvom fizychnyh navantazhen’ [Changes in resistance of erythrocytes in the peripheral blood sport horse under the influence of physical activity]. Naukovo-Tehnichnyj Bjuleten’ 13(3-4), 93-98 (in Ukrainian).
Antonov, A.V., 2010. Perekisnoe okislenie lipidov i
antioksidantnaja zashhita u troebornyh loshadej v sorevnovatel’nyj period [Lipid peroxidation and antioxidant protection in triathlon horses in the competition period]. Sel’skohozjajstvennaja Biologija 6, 47-49 (in Russian).
Art, T., Lekeux, P., 2005. Exercise-induced physiological adjustments to stressful conditions in sports horses. Livestock Production Science 92, 101-111.
Chiaradia, E., Avellini, L., Rueca, F., Spaterna, A., Porciello, F., Antonioni, M.T., Gaiti, A., 1998. Physical exercise, oxidative stress and muscle damage in racehorses. Comp. Bio-chem Physiol. 119B, 833-836.
Clemens, M.R., Waller, H.D., 1987. Lipid peroxidation in erythrocytes. Chem. Phys. Lipids 45, 251-268.
Deaton, C.M, Marlin, D.J., 2003. Exercise-associated oxidative stress. Clin. Tech. Equine Pract. 2, 278-291.
Galaktionova, L.P., Molchanov, A.V., El’chaninova, S.A., Varshavskij, B.J., 1998. Sostojanie perekisnogo okislenija bol’nyh s jazvennoj bolezn’ju zheludka i dvenadcatiperstnoj kishki [State peroxidation in patients with gastric ulcer and duodenal ulcer]. Klin. Lab. Diagnostika 6, 10-14 (in Russian).
Glatzle, D., Vuilleumier, J.P., Weber, F., Decker, K., 1974. Glutathione reductase test with whole blood, a convenient procedure for the assessment of the riboflavin status in human. Experientia 30, 665-667.
Glazkov, E.O., Razdajbedin, V.M., 2010. Vplyv kvarcetynu na pokaznyky systemy antyoksydantnogo zahystu organizmu sportsmeniv pry intensyvnomu fizychnomu navantazhenni [Kvartsetyn effect to performance of antioxidant protection of athletes during intense physical load]. Visnyk LNU 24(211), 31-35 (in Ukrainian).
Gondim, F.J., Zoppi, C.C., Silveira, L.R., da-Silva, L.P., de Macedo, D.V., 2009. Possible relationship between per-
formance and oxidative stress in endurance horses. J. Equine Vet. Sci. 29(4), 206-212.
Kamyshnikov, V.S., 2004. Spravochnik po Kliniko-
Biohimicheskim Issledovanijam i Laboratornoj Diagnostike [Handbook of Clinical and Biochemical Studies and Laboratory Diagnosis]. Moscow, Med-Press-Inform (in Russian).
Kinnunen, S., Atalay, M., Hyppa, S., Lehmuskero, A., Han-ninen, O., Oksala, N., 2005. Effects of prolonged exercise on oxidative stress and antioxidant defense in endurance horse. J. Sport Sci. Med. 4, 415-421.
Kirschvink, N., de Moffarts, B., Lekeux, P., 2008. The oxidant / antioxidant equilibrium in horses. Vet. J. 177(2), 178-191.
Kolisnyk, M.I., Kolisnyk, I.V., Nidzjulka, J., Vlizlo, V.V., 2009. Aktyvni formy kysnju ta i’h rol’ u metabolizmi klityn [Reactive oxygen species and their role in the metabolism of cells]. Biologija Tvaryn. 11(1-2), 59-71 (in Ukrainian).
Koroljuk, M.A., Ivanova, L.I., Majorova, I.G., Tokarev, V.E., 1988. Metod opredelenija aktivnosti katalazy [The Method for Determining the Activity of Catalase]. Lab. Delo 1, 1619 (in Russian).
Kostjuk, V.A., Popovich, A.I., Kovaleva, Zh.I., 1990. Prostoj i chuvstvitel’nyj metod opredelenija superoksiddismutazy, osnovannyj na reakcii okislenija kvercetina [A Simple and Sensitive Method for the Determination of Superoxide Dismutase Based on the Oxidation of Quercetin]. Vopr. Med. Himii 2, 78-91 (in Russian).
Laskov, A.A., 1997. Podgotovka Loshadej k Olimpijskim Vidam Konnogo Sporta [Prepare Horses for Equestrian Olympic Kinds of Sports]. VNII Konevodstva (in Russian).
Levine, R.L., Garland, D., Oliver, C.N., Amici, A., Climent, I., Lenz, A.-G., Ahn, B.-W., Shaltiel, S., Stadtman, E.R., 1990. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Meth. Enzymol. 186, 465-478.
Marlin, D.J., Fenn, K., Smith, N., Deaton, C.D., Roberts, C.A., Harris, P.A., Dunster, C., Kelly, F.G., 2002. Changes in circulatory antioxidant status in horses during prolonged exercise. J. Nutr. 132, 162-167.
Moin, V.M., 1986. Prostoj i specificheskij metod opredelenija aktivnosti glutationperoksidazy v jeritrocitah [A Simple and Specific Method for Determining the Activity of Glutathione Peroxidase in Erythrocytes]. Lab. delo 8, 724727 (in Russian).
Nerodenko, V.V., 2009. Biologicheskie Osnovy Sportivnoj Trenirovki v Konnom Sporte [Biological Basis of Sports Training in Equestrian Sports]. Cherkassy (in Russian).
Niki, E., 2009. Lipid peroxidation: Physiological levels and dual biological effects. Free Radical Bio. Med. 29, 469-484.
Radak, Z., Young, C.H., Goto, S., 2008. Systematic adaptation to oxidative challenge induced by regular exercise. Free Radical Bio. Med. 44, 153-159.
Soares, J.C.M., Zanelal, R., Bondan, C., Alves, L., Lima, M., Motta, A., Zanella, E., 2011. Biochemical and antioxidant changes in plasma, serum, and erythrocytes of horses before and after a jumping competition. J. Equine Vet. Sci. 31, 357-360.
Tkachenko, H., Andriichuk, A., Kurhalyuk, N., Zalewska, K., Tkachova, I., 2011. Impact of training on blood pro- and antioxidant balance of trained horses. Abstracts of International Conference “Horse welfare”, 2011, 3-4 December, Wroclaw University of Environmental and Life Sciences, Poland, 33.
Vladimirov, J.A., Archakov, A.I., 1972. Perekisnoe okislenie lipidov v biologicheskih membranah [Lipid Peroxidation in Biological Membranes]. Moscow, Nauka (in Russian).
Zar, J.H., 1999. Biostatistical Analysis. 4th ed. New Jersey, Prentice-Hall Inc., Englewood Cliffs.
Надійшла до редколегії 09.04.2013
