CC BY
10
диагностики ранних изменений в состоянии здоровья человека, возникающих под воздействием неблагоприятных факторов ОС.
Литература
1. Беляева Н. Н„ Кумпан Н. Б. // Структурно-функциональные и биохимические механизмы влияния факторов окружающей среды на организм человека и экспериментальных животных. — М., 1986.— С. 27—30.
2.Бонашевская Т. И. // Вести. АМН СССР.— 1978. — №4, —С. 44—52.
3. Бонашевская Т. И., Ламентова Т. Г., Долинская С. И. и др. // Современные биохимические методы в гигиене окружающей среды, — М., 1982.— С. 40—46.
4. Бонашевская Т. И., Беляева Н. Н„ Кумпан И. Б., Па-насюк ¿1. В. // Морфофункциональные исследования в гигиене. — М., 1984.
5. Бонашевская Т. И., Кумпан Н. Б.// Арх. анат.— 1986, — № 4, —С. 41—48.
6. Иванов Ю. В. II Структурно-функциональные и биохимические механизмы влияния факторов окружающей среды на организм человека и экспериментальных животных,—М., 1986, — С. 154—157.
7. Меркурьева Р. В., Судаков К. В., Бонашевская 'Г. И., Журков В. С. Медико-бнологическне исследования в гигиене.—М., 1986.
8. Шамарин А. А., Радкевич J1. А., Кобаков А. 10., Фетисов В. В. Структурно-функциональные и биохимические механизмы влияния факторов окружающей среды на организм человека и экспериментальных животных. — М., 1986, —С. 118—123.
Поступила 17.05.88
Summary. Application of morphomelric, histochemical and histoenzymatic examination techniques enabled one to detect early biologic effect of exposure to environmental chemical factors before the appearance of shifts in toxicologic indicators. A combination of characteristics involving damage and compensation reactions at the level of cells and cellular populations served as a hygienically significant criterion of adverse body effect of toxic substances. Biologic significance of morphologic criteria was confirmed by their correlation to the level of body resistance to specific load along with the degree of cellular stability, and by the comparison of morphologic shifts with the changes in physiologic and biochemical indicators. The prospects of development of morphologic studies in the field of environmental health are set forth.
УДК 615.9-015.4:616.30-008.11.076.9
Н. Н. Беляева
ПРОЛИФЕРАЦИЯ И ПОЛИПЛОИДИЗАЦИЯ ГЕПАТОЦИТОВ КАК ПОКАЗАТЕЛИ ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНИ ПРИ ДЕЙСТВИИ ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
НИИ общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
В условиях загрязнения окружающей среды возрастает потребность в гигиенической регламентации различных агентов, что в свою очередь делает необходимым выбор наиболее информативных показателей неблагоприятного воздействия на организм. Так как одной из главных функций печени является детоксикация химических соединений, то изучение гепатоток-сического эффекта факторов окружающей среды представляет одну из важнейших социально-гигиенических задач. Однако использование морфологического анализа для гигиенической оценки гепатотропного действия имеет ряд методических особенностей, главными из которых являются хроническое воздействие веществ в низких концентрациях, не приводящих, как правило, к выраженной органной патологии [5], и невозможность динамического исследования, что приводит подчас к взятию материала в конце эксперимента. Последнее обстоятельство значительно затрудняет трактовку изменений, так как длительное воздействие низких концентраций токсических агентов приводит к чередующимся процессам повреждения и компенсации. В связи с этим наиболее остро стоят вопросы об определении гепатотоксического эффекта и о выборе адекватного для его решения критериально значимого показателя.
В настоящей работе обосновываются необходимость изучения восстановительной регенерации печени в виде компенсаторной пролиферации и полиплоидизации гепатоцитов как адекватного ответа на повреждающее дейстзие химических факторов окружающей среды.
Эксперименты проведены на беспородных белых крысах-самцах, получавших брикетированный корм. Исследовали острые и хронические ингаляционные и пероральные воздействия целого ряда химических веществ. Методика проведения эксперимента, взятия материала и методы исследования более подробно описаны ранее [2]. Полиплоидизацию печени изучали при непрерывной ингаляции 1,2-дихлорпропана (ДХП) в концентрациях 2000 мг/м3 (экспозиция 20 ч, 3 и 7 сут), 1000 мг/м3 (7 сут), 100 и 500 мг/м3 (14 уст), 1,5 и 9 мг/м3 (86 сут); при ингаляции 1,2,3-трихлорпропана (ТХП) в концентрациях 800 мг/м3 (7 сут), 20 и 100 мг/м3 (14 сут), 0,4 и 2 мг/м3 (86 сут); при ингаляции перхлорэтилена (тетрахлорэтилена, ПХЭ) в концентрациях 2750 мг/м3 (7 сут), 100 и 500 мг/м3 (14 сут), 4,2 и 19 мг/м3 (86 сут). Комбинацию этих веществ оценивали через 7 сут (ДХП 680 мг/м3, ТХП 270 мг/м3 ПХЭ 1200 мг/м3), 14 сут (ДХП 190 мг/м3, ТХП 35 мг/3, ПХЭ 210 мг/м3) и 86 сут (2 смеси: 1) ДХП 4,5 мг/м3, ТХП 2 мг/м3 и ПХЭ
3,5 мг/м3; 2) ДХП 24 мг/м3, ТХП 3 мг/м3, ПХЭ -\210 мг/м3). Полиплоидизацию и пролиферацию Гепатоцитов при ингаляционном воздействии че-тыреххлористого углерода (ССЦ) в концентрациях 100 и 300 мг/м3 оценивали в условиях хронического непрерывного и прерывистого воздействия [4]. При непрерывной ингаляции бензолом и фенолом пролиферацию и полиплоидизацию исследовали в подострых и хронических эксперименах: бензол в концентрациях 0,45 мг/м3 (экспозиция 1 и 8 сут), 3,5 мг/м3 (3 и 4 мес), фенол в концентрации 14 мг/м3 (4 и 14 сут). В опытах с бензолом часть контрольных и подопытных животных получали специфическую нагрузку этим же веществом в виде одноразового пе-рорального введения его в дозе 3000 мг/кг с последующим взятием материала через 2 сут. Непрерывную ингаляцию смесью 33 химических веществ, включающих ацетон, ССЦ, бензол, хлороформ, толуол, циклогексан, винилацетат, ме-тилкрилат, дихлорэтан, ацетофенол, стирол, ксилол, этилбензол, диметиламин, формальдегид, ммиак, окись углерода и др., проводили в кон-ентрациях, выражаемых суммарным показателем Р [7], на уровне 8 и 30 Р в течение 32 дней воздействия. Часть контрольных и подопытных животных получали 3-дневную нагрузку той же смесью на уровне 800 Р. Пероральную затравку хлороформом в дозе 1000 мг/кг изучали через 3, 7 и 30 сут воздействия.
Пролиферацию исследовали путем сопоставления числа ДНК-синтезирующих и полиплоидизи-рующих гепатоцитов. Первые подсчитывали с помощью авторадиографического метода у декапк-тированных животных через час после внутрк-брюшинного введения им метил-3Н-тимидина (3Н-Т) в дозе 1 мкКи на 1 г массы тела.
Индекс меченных 3Н-тимидином ядер (ИМЯ) определяли как отношение (в процентах) числа меченых гепатоцитов к числу просчитанных (обычно 1000—3000 гепатоцитов). Полиплоиди-ч зацию оценивали на мазках-гепатоцитах, полу-^¿(аемых по методам Л. Н. Белова и соавт. [1] и I. Jacob и P. Bhargava [10], на основе цито-фотометрического и кариометрического анализов [2, 3]. Кариометрически исследовали распределение одно- и двуядерных гепатоцитов по классам плоидности на мазках печени. В ряде случаев при появлении большого числа клеток промежуточной плоидности, выявляемых по нарушению дискретности гистограмм, а также частично по повышению ИМЯ, проводили определение гепатоцитов по сумме классов плоидности. При кариометрическом анализе от каждого животного оценивали 500—2000 гепатоцитов. Запуск процесса регенерации регистрировали либо по увеличению ИМЯ, либо по появлению значимого числа клеток промежуточной плоидности, завершение этого процесса — по повышению плоидности одно- и двуядерных гепатоцитов.
, Статистическую обработку результатов прово-%
: л Л '
: jW^
= гГ^^Л-^^гПл^, „ „„ „„
- в ~ г-ГЬ^Ц „ г-Г ^"Чгч „ „ „ „
г ~ _____ п , n
_ г i J 1 4 8 д 16
L M 1 1 1 III
n Ln гПпгГЦп r, "
Z 4 в 16
Рис. 1. Гистограмма распределения ядер гепатоцитов по классам плоидности у контрольных и подопытных крыс, подвергавшихся непрерывной ингаляции ДХП в концентрации 2,2 мг/л. По оси абсцисс — содержание ДНК (в ед. плоидности); по оси ординат — число ядер п каждом интервале (в %, цена деления 5%). Время ингаляции: а, 6 — 20 ч. в, г—3 сут, д—ж — 7 сут. . . - __________К — контроль.
дили по критериям Фишера — Стьюдента и с помощью таблиц Р. Б. Стрелкова [9].
Обобщение результатов исследований по изучению процессов репаративной регенерации в печени при действии факторов окружающей среды позволило сформулировать ряд положений.
1. Действие химических факторов малой интенсивности, оказывающих гепатотропное действие, сопровождается в печени компенсаторными реакциями в виде увеличения пролиферации и полиплоидизации гепатоцитов [2—5], что подтверждает общебиологический характер репаративной регенерации.
2. Полиплоидизация гепатоцитов идет со сменой одно- и двуядерных поколений. Начавшаяся волна полиплоидизации нарушает дискретность гистограмм, как, например, при 20-часовой и
юо\-80 60 40 20
«ч
100 во 60 40 20
к 1 2 а
Ю
о,5
в
К 4 5
А
К 4 5
Рнс. 2. Диаграммы числа тетраплоидных (о, б) и ДНК-синтезирующих (в) гепатоцитов при пероральном воздействии хлороформа в дозе 1000 мг/кг (о) и фенола в концентрации 14 мг/л (б, в).
По оси абсцисс — номер группы: по оси ординат — количество одноядерных тетраплоидных гепатоцитов (о. б) и ИМЯ (в) в %. Заштрихованные столбики здесь и на рнс. 3 — достоверные по отношению к контролю изменения. Время воздействия хлороформа: 1 — 3 сут; 2 — 7 сут; 3 — I мес; 4 — 4 сут; 5 — 14 сут. К — контроль.
3-суточной ингаляции ДХП в концентрации 2000 мг/м3 (рис. 1, а—г), недельной его экспозиции в концентрации 1000 мг/м3 (рис. 1 ,ж). Аналогичный эффект характерен для 14-дневной ингаляции комбинации ДХП, ТХП и ПХЭ (в больших из полученных концентраций), 3-месячной ингаляции ДХП (9 мг/м3), ТХП (2 мг/м3) и ПХЭ (4,2 и 19 мг/м3). Продолжение ингаляции в тех же концентрациях или воздействие большими дозами химических веществ вызывает волну митозов, приводящих к достоверному увеличению одноядерных тетраплоидных гепатоцитов, образовавшихся из двуядерных с диплоидными ядрами, что документируется уменьшением числа последних [3]. Такое же карио- и цитофото-метрическое распределение гепатоцитов наблю-' дается при пероральном воздействии хлороформа в дозе 1000 мг/кг через 7 и 30 сут воздействия (рис. 2, о), непрерывной ингаляции фенола в концентрации 14 мг/л в течение 4 и 14 сут (рис. 2, б).
3. Процессы полиплоидизации гепатоцитов подчинены общебиологической зависимости доза — время — эффект. Увеличение Бремени или дозы воздействия факторов малой интенсивности усиливает полиплоидизацию гепатоцитов. Так, при недельной ингаляции ДХП в концентрации 1000 мг/м3 достоверно (р<0,001) снижается количество двуядерных гепатоцитов не только с диплоидными, но и с тетраплоидными (р<0,05) ядрами. При таком же сроке воздействия ТХП в концентрации 800 мг/м3 проходит несколько волн митозов, приводящих к достоверному повышению процента одноядерных тетраплоидных (р<0,001), октаплоидных (р<0,005) клеток и появлению клеток с плоидностыо (п), равной 16. Параллельно с этим происходит уменьшение процента двуядерных гепатоцитов (для тетраплоидных при ¿><0,01, для октаплоидных при р<0,05) [3].
4. Плоидность гепатоцитов зависит от режима воздействия. Эта зависимость была показана на модели непрерывной и прерывистой ингаляций СС14 [4], и объясняется, вероятно, она тем, что
для развития эффекта необходима определенная, для каждого из веществ своя суммарная доза, учитывающая в условиях прерывистой затравка!» суммарную экспозицию.
5. Вместе с тем процесс полиплоидизации носит скачкообразный характер. Так, непрерывная ингаляционная затравка бензолом (450 мг/м3) через сутки резко снижает количество двуядерных гепатоцитов (до 5% против 17,3% У ин-тактных животных) при повышении доли высо-коплоидных одноядерных (до 95 % по сравнению с 82,7% У интактных крыс). К 8-м суткам эксперимента процесс полиплоидизации сохраняется. 3-месячная ингаляция бензола в концентрации 3,5 мг/м3 вызывает уменьшение числа двуядерных гепатоцитов при увеличении количества одноядерных. Продолжение затравки до 4 мес не меняет степень полиплоидизации, что может трактоваться как достижение печенью резистентности и предполагает скачкообразное развитие процесса регенерации. Пульсирующий характер его, вероятно, связан с накоплением дефектных клеток, стимулирующих процессы деления. Так как полиплоидная клетка ввид^ особенностей своего образования обладает большей функциональной активностью, чем диплоидная [6, 8], то полиплоидизация печени в ответ на химическое воздействие частично или полностью приводит к замене дефектных клеток, повышая резистентность органа. В этом случае печень может на какое-то время приобрести устойчивость к воздействию последующих доз веществ до нового накопления пула поврежденных клеток, вызывающих очередную волну регенерации.
6. При одних и тех же дозах полиплоидизация определяется гепатотропностью вещестз [4]. Например, гепатотоксичность хлорпроизводных углеводородов ДХП, ТХП и ССЦ связывают с количеством атсмов хлора в молекуле. Эта же зависимость прослеживается при оценке степени развития полиплоидизации. Так, непрерывная 14-суточная ингаляция ДХП в концентрации^ 100 мг/м3 не вызывает полиплоидизации, ТХП^ при тех же концентрациях и сроке воздействия приводит к полиплоидизации гепатоцитов только у половины подопытных животных, а ССЦ в аналогичной концентрации вызывает этот процесс уже через 9 сут воздействия.
7. Репаративная регенерация в печени в ответ на воздействие химических факторов окружающей среды может выражаться не только по-липлоидизацией, но и пролиферацией. В ряде экспериментов (ингаляция ССЦ в течение 9 сут, фенола на 4-е сутки, ингаляции бензола в течение 4 мес и его пероральное воздействие и др.) наблюдалось одновременное повышение числа как ДНК-синтезирующих, так и полиплоидизи-рующихся гепатоцитов (см. рис. 2, б, в). Однако во многих представленных в данной работе опытах (3-месячная ингаляция бензола, 2-недель-
ная — фенола и др.) повышение ИМЯ не зарегистрировано, хотя кариометрическое распределение гепатоцитов по классам плоидности указывает на прохождение гепатоцитами синтеза ДНК до изученного срока (см. рис. 2, б, в). Такое несоответствие'объясняется следующим образом: пролиферирующий и полиплоидизирующийся ге-патоциты проходят через редупликацию ДНК, которая является процессом, регистрируемым в определенный интервал времени и, следовательно, не всегда улавливаемым. Повышение степени полиплоидизации печени означает сразу или через какое-то время после редупликации образование высокоплоидных гепатоцитов из числа ДНК-редуплицирующкх. Этот процесс четко регистрируется методами карио- и цитофотомет-рии.
8. Так же как и полиплоидизация, пролиферация является скачкообразно-ступенчатым процессом, идущим по пути включения в митотиче-ский цикл гепатоцитов все более высокой плоидности. Например, при 3- и 4-месячной экспозиции бензола большинство 3Н-Т-гепатоцитов составляют клетки диплоидного класса — 76 клеток, тогда как тетраплоидного — 30 и октапло-идного — 3. Пролиферация, возникающая при однократном воздействии бензола (3000 мг/кг) характеризуется увеличением ИМЯ более чем в 5 раз (с 0,07 % У интактных крыс до 0,365 % У подопытных) и наибольшим количеством меченых тетраплоидных гепатоцитов. 50-суточная ингаляция бензола в концентрации 20 мг/м3 повышает ИМЯ до 0,822 %. У части крыс, получивших специфическую нагрузку, изменился качественный состав меченых гепатоцитов в сторону мечения тетра- и октаплоидных.
9. Сопоставление количества ДНК-синтезиру-ющих и полиплоидизирующихся гепатоцитов выявило, что часть ЭНК-редуплицирующих клеток идет в пролиферацию, а часть—в полиплоидиза-цию. Так как кариометрическое распределение
/ гепатоцитов по классам плоидности у животных \>иэдного вида, возраста и линии является стабильным показателем, а степень развития полиплоидизации строго коррелирует с интенсивностью воздействия, то для полиплоидных тканей, каковой считается печень, наиболее весомым и улавливаемым показателем, характеризующим восстановительную регенерацию органа в ответ на воздействие химических веществ малой интенсивности, служит регистрация повышения ее плоидности.
Значение клеточной регенерации при воздействии химических факторов окружающей среды для печени велико. Регенерация как восстановление структуры и функции поврежденной печени возникает при повреждении или гибели части клеток. Пролиферация или полиплоидизация восстанавливает число клеток или геном, т. е. матрицы, необходимые для специфических син-/ тезов. Полиплоидия в печени как активно функ-
____Х//Л//Л//Л//А
К 1 2 а 4 5 К 1 г 3 4 5
Рис. 3. Изменение индекса альтерации (а) и числа высокоплоидных гепатоцитов (б) при ингаляционном воздействии смеси из 33 химических веществ. По оси абсцисс — номер опыта; но оси ординат — индекс альтерации в условных единицах (а) и процент высокоплоидных гепатоцитов (й). Уровень нагрузки: реальной — 8 Р (I). 30 Р (2). специфической (3); реальной на фоне специфической — 8 Р (4). 30 Р (5). К — контроль.
ционирующем органе, вероятно, возникает при конкуренции тканево-специфических и предми-тотических синтезов, и можно допустить, что ее включение служит механизмом генетической защиты, придающей устойчивость гепатоцитам при возникновении аберрантного генома [6]. Результатом репаративной регенерации является восстановление клеточного гомеостаза и как следствие— нормализация функции печени и повышение резистентности органа. Данное положение иллюстрируется с помощью введения животным специфических нагрузок. Выявляются 3 варианта ответа на нагрузку, характеризующих разную степень резистентности органа: 1-й вариант — в ответ на воздействие происходят структурно-функциональные нарушения, незначительно или вовсе не запускающие процесс клеточной регенерации, что снижает резистентность печени. Предъявление животным на этом фоне специфической нагрузки обусловливает структурно-функциональные нарушения, индуцирующие регенерацию. Так, на модели многокомпонентной смеси показано, что 32-дневное воздействие смесью 33 химических веществ с условным уровнем в 8 Р достоверно повышает индекс альтерации гепатоцитов, однако изменения недостаточны, чтобы запустить процессы регенерации, о чем свидетельствует отсутствие полиплоидизации (рис. 3, а, б). Специфическая нагрузка, предъявленная контрольным животным, вызывает как повреждение, так и максимальное для данного опыта повышение полиплоидизации (см. рис. 3, а, б). Так как материал был взят через 2 дня после нагрузочной дозы, то образовавшиеся полиплоидные клетки, вероятно, заменили часть поврежденных, чем и объясняется достоверное по отношению к показателям подопытных животных снижение индекса альтерации. Предъявление нагрузки подопытным животным приводит к повышению индекса альтерации гепатоцитов, стимулирующему увеличение числа высокоплоидных гепатоцитов.
2-й вариант ответа на нагрузку отличается от предыдущего тем, что фоновое воздействие (например, смесью веществ с уровнем 30 Р) вызывает повреждение печени, запускающее его регенерацию (увеличение числа высокоплоидных гепатоцитов). Предъявление этим животным нагрузки почти в 2 раза увеличивает число высокоплоидных гепатоцитов. Аналогичный ответ на нагрузку наблюдается при действии бензола в течение 50 дней.
И, наконец, наболее важным для понимания роли клеточной регенерации при воздействии химических веществ малой интенсивности является такой ответ, когда регенерация печени настолько повышает его резистентность, что орган практически не отвечает на нагрузку. Такой ответ характерен для 3-месячной ингаляции бензола. Увеличение времени экспозиции до 4 мес вызывает значительный достоверный подъем ДНК-синтезирующих гепатоцитов (ИМЯ 0,994%) при росте количества высокоплоидных (до 90,65 %) и уменьшении двуядерных (до 9,35 %) гепатоцитов. Среди 3Н-Т-гепатоцитов больше всего ядер тетраплоидного класса (321 ядро), меньше диплоидных (83), октапло-идных (3); присутствуют также гепатоциты переходного класса (от тетра- к октаплоидному), что свидетельствует о прохождении нескольких митотических волн. Следовательно, увеличение срока экспозиции переводит 3-й вариант ответа во 2-й.
Таким образом, комплексная оценка пролиферации и полиплоидизации гепатоцитов является интегрирующим показателем компенсаторно-восстановительной регенерации печени и ее резистентности. Развитие репаративной регенерации коррелирует с накоплением значимого количества деструктивных клеток и служит адекватным ответом на повреждающее действие токсических агентов, что позволяет расценивать ее как информативный показатель гепатотоксического эффекта при гигиеническом регламентировании и обосновывает изучение ее при действии химических факторов окружающей среды.
Выводы. 1. Действие химических факторов малой интенсивности, оказывающих гепатотроп-ное действие, вызывает в печени развитие репаративной регенерации в виде увеличения пролиферации и полиплоидизации гепатоцитов, носящих скачкообразно-ступенчатый характер.
2. Развитие репаративной регенерации коррелирует с накоплением значимого количества деструктивных клеток и является адекватным от-" ветом на повреждающее действие химических факторов окружающей среды, что позволяет расценивать ее как информативный показатель гепатотоксического эффекта при гигиеническом регламентировании.
3. Процессы полиплоидизации гепатоцитов подчинены общебиологической зависимости доза — время — эффект, обусловлены режимом воздействия, определяются гепатотропностыо веществ и имеют количественное выражение, что позволяет использовать их при гигиеническом нормировании химических веществ.
Литература
1. Белов Л. Н„ Коган М. Е., Леонтьева Т. А и др.//Ци-
тология. — 1975. — № 4. — С. 1332—1337.
2. Беляева Н. И., Цулая В. Р., Маршак Т. Л., Бродский В. Я. // Бюл. экспер. биол. — 1974. — № 12. — С. 74—77
3. Беляева Н. Н.. Бонашевская Т. И.. Маршак Т. Л.)\ Бродский В. Я- //Там же,— 1977. —№ 3.—С. 345— 348.
4. Беляева Н. И.. Бонашевская Т. И., Некрасова Г. И. // Там же.— 19В0. — № 1, —С. 57—59.
5. Бонашевская Т. И., Беляева Н. Н„ Кумпан И. Б.. Панасюк Л. В. Морфофункциональиые исследования в гигиене. — М., 1984.
6. Бродский В. Я-, Урываева И. В. Клеточная полиплоидия: Пролиферация и дифференцировка. — М., 1981.
7. Пинигин М. .4. Научные основы санитарной охраны атмосферного воздуха городов. — М., 1976. — С. 15—47.
8. Селиванова Г. В., Власова Т. Д., Богданова М. С. // Цитология. — 1987. — № 2. — С. 186—197.
9. Стрелков Р. Б. Метод вычисления стандартной ошибки и доверительных интервалов средних арифметических величин с помощью таблицы. — Сухуми, 1966.
10. Jacob J., Bhargava P.// Exp. cell. Res. — 1962. — Vol. 27. — P. 453—455.
Поступила 29.03.88
Summary. The study revealed that a comprehensive assessment of proliferation and hepatocyte polyploidy server as an integral indicator of compensator liver regeneration and its resistance. The development of reparative regeneration is correlated with the acumulation of the significant amount of destructive cells and is regarded as an adequate reaction to the damaging effect of toxic agents. Thus it is possible to consider reparative regeneration as an indicator of hepatotoxic effect under hygienic regulation and to justify its examination under the effect of environmental hy-gicnic factors.
-4
<r
