CC BY
196
Орипнальна стаття
УДК 611-013.395-018.26:591.81:616-092.9
Семенова В.М.1, Лисяный Н.И.2, Стайно Л.П.1, Бельская Л.Н.2, Егорова Д.М.1
1 Лаборатория культивирования тканей, Институт нейрохирургии им. акад. А.П.Ромоданова НАМН Украины, Киев, Украина
2 Отдел нейроиммунологии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины, Киев, Украина
Пролиферативный и дифференцировочный потенциал мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани в условиях культивирования
Цель. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из жировой ткани (ЖТ) экспериментальных животных и человека для изучения индукции нейрогенной дифференцировки. Материалы и методы. Для культивирования МСК использована ЖТ от 30 животных и 5 пациентов. Культуры МСК исследованы в течение 5 пассажей. Для индукции нейрогенной дифференцировки использованы ретиноевая кислота (1 мкмоль) или/и 5-азацитидин (1 мкмоль). Культуры изучены прижизненно, а также по данным цитологического и иммуногистохимического исследований.
Результаты. В культурах клеток из ЖТ отмечен рост фибробластоподобных МСК. В присутствии факторов специфической дифференцировки они приобретают нейроноподобный и астроцитоподобный фенотип с позитивной реакцией на GFAP.
Выводы. При культивировании клеток из ЖТ экспериментальных животных и человека получена фракция МСК, способных к индукции нейрогенной дифференцировки под влиянием ретиноевой кислоты и/или 5-азацитидина, что подтверждается данными иммуногистохимических исследований.
Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, жировая ткань, культура, нейроглиальная дифференцировка.
Укр. нейрохiрург. журн. — 2014. — №3. — С. 24-29.
Поступила в редакцию 05.03.14. Принята к публикации 25.04.14.
Адрес для переписки: Семенова Вера Михайловна, Лаборатория культивирования тканей, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова, ул. Платона Майбороды, 32, Киев, Украина, 04050, e-mail: [email protected]
Вступление. Современное состояние учения о биологии мезенхимальных стволовых клеток (МСК), выделенных из различных тканей, позволяет надеяться на возможность их успешного использования в качестве объекта тканевой терапии в восстановительном лечении дегенеративных заболеваний ЦНС. В связи с этим активно обсуждается вопрос о биологических свойствах плюрипотентных аутологичных стволовых клеток (СК) стромально-васкулярной фракции (СВФ) жировой ткани (ЖТ), содержащей мало дифференцированные клетки-предшественницы в соединительнотканных междольковых перегородках. Использование МСК ЖТ с предварительным дифференцированием их в нейральном направлении в условиях культивирования и их последующую алло- или аутотрансплантацию гистосовместимым пациентам считают одним из перспективных методов клеточной терапии при таких малокурабельных заболеваниях ЦНС, как деструкция межпозвонковых дисков, рассеянный склероз, травма спинного мозга, дегенеративное перерождение периферических нервов, болезнь Гентингтона, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, деменция, ДЦП, реакции «трансплантат против хозяина», опухоли мозга (глиобластома, нейробластома) и некоторых других [1, 2].
Преимуществом СКЖТ является доступность и безопасность выделения ЖТ в достаточном количестве практически у любого пациента, а также относительно несложная ферментная обработка для последующего культивирования в целях получения достаточного количества клеточного материала. В связи с этим ЖТ рассматривают как оптимальный ресурс для клеточной терапии, в том числе регенерации поврежденной нервной ткани. Установлено, что использование аутологичных культивируемых МСК, дифференцированных в нейральном направлении, оказывает положительное влияние на скорость улучшения функции мышц, обеспечивает восстановление функций органов таза и уменьшение спастичности даже у больных при старой спинальной травме с полным анатомическим повреждением спинного мозга. При этом раннее применение такого способа в условиях частичного сохранения целостности проводящих путей значительно повышает эффективность лечения [3, 4].
При введении МСК из ЖТ человека в боковой желудочек мозга крысы через 1 сут после моделирования инсульта значительно улучшались поведенческие функции животного уже на 7-е сутки. По данным патоморфологического исследования поврежденных областей мозга установлена тропность миграции МСК
Статья содержит рисунки, которые отображаются в печатной версии — в оттенках серого, в электронной — в цвете.
© Семенова В.М., Лисяный Н.И., Стайно Л.П., Бельская Л.Н., Егорова Д.М., 2014
к очагу поражения, а также выживание имплантированных в мозг клеток в течение не менее 30 сут [5].
На модели геморрагического инсульта у крыс показано, что после трансплантации МСК, полученных из ЖТ, у животных уменьшились неврологический дефицит и степень атрофии мозга [6].
Исследована также способность МСК из ЖТ восстанавливать нарушенные функции мозга крыс на модели хореи Гентингтона, индуцированной путем внутрибрюшинного введения 3-нитропропионовой кислоты. Этот нейротоксин вызывает стойкий окислительный стресс, гибель нейронов базальных ядер мозга, что обусловливает у подопытных животных когнитивные нарушения, сходные с таковыми при хорее Гентингтона у человека. При однократном внут-рижелудочковом введении таким животным суспензии активированных мультипотентных МСК, полученных из ЖТ человека, заметно улучшалось состояние животных, уменьшалась выраженность неврологических симптомов, повышалась исследовательская активность и почти полностью восстанавливалась утраченная способность животных к обучению. По данным морфологического исследования пораженной ткани мозга обнаружено восстановление формы нейронов хвостатого ядра. По мнению авторов, эффективное лечение хореи Гентингтона у человека также возможно с помощью МСК, полученных из собственной ЖТ пациентов [7].
МСК из ЖТ могут активировать пролиферацию клеток и микроциркуляцию, обеспечивая существенное уменьшение зоны ишемического инфаркта мозга [8]. Предполагают, что этот процесс осуществляется вследствие активации синтеза ^-8, SDF-1, фактора ингибиции апоптоза Вс1-2, фактора фон Виллебранда и даблкортина.
На модели аутоиммунного энцефаломиелита показана миграция МСК из ЖТ в демиелинизированные участки мозга, что сопровождается увеличением количества эндогенных олигодендроцитов [9]. Предполагают, что нейропротекторные свойства МСК из ЖТ реализуются паракринно за счет трофических факторов и активации клеток реципиента. Кондиционированная среда от МСК защищает культуру гранулярных нейронов мозжечка от индуцированного апоптоза путем активации каспазы-3 [10].
В настоящее время актуальным направлением научных изысканий в области биологии МСК из ЖТ является разработка оптимальных методов выделения, идентификации и получения клонов стволовых и плюрипотентных клеток из ЖТ, а также совершенствование методов индукции их направленной дифференцировки в различные специализированные клетки, в частности, нейральные [11].
В настоящее время существуют несколько протоколов выделения и дифференцирования МСК из ЖТ в нейральном направлении. Большинство из них основаны на получении первоначально адгезивной фракции МСК, которые при последующем культивировании приобретают фибробластоподобный фенотип.
Приведенные данные литературы свидетельствуют о широких потенциальных возможностях использования МСК из ЖТ для клеточной терапии при различных заболеваниях нервной системы. В соответствии с протоколом В. Zavan [12], этап обогащения
СВФ МСК из ЖТ in vitro должен быть направлен на накопление в условиях культивирования как можно большего количества нейропрогениторов при меньшем числе пассажей [13].
Однако единого протокола получения и культивирования МСК из ЖТ нет. Необходимо совершенствование методов индукции их направленной дифференцировки в нейроглиальном направлении в целях последующего практического использования в клеточной терапии при различных заболеваниях ЦНС.
Целью исследования является: отработка оптимального метода получения МСК, выделенных из ЖТ, полученной от экспериментальных животных и человека; обеспечение оптимальных условий эффективного культивирования МСК из ЖТ; изучение условий индукции нейроглиальной дифференцировки МСК из ЖТ с применением известных индукторов (ретиноевой кислоты и 5-азацитидина).
Материалы и методы исследования. Для получения МСК из ЖТ использовали 30 экспериментальных животных: 18 крыс и 12 мышей. Использованы также фрагменты ЖТ 5 людей, полученные из мягких тканей спины во время нейрохирургических операций по поводу опухоли позвоночника и/или спинного мозга. Перед операцией получено информированное согласие больных на взятие фрагментов ЖТ в объеме 0,5 см3.
Методика выделения ЖТ у экспериментальных животных. Под наркозом операционное поле обрабатывали 96% раствором этанола в течение 5-10 мин. Стерильными ножницами вскрывали брюшную полость, из пахового участка выделяли ЖТ. Фрагменты ЖТ промывали несколько раз в свежих порциях раствора PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Sigma) без Ca2+ и Mg2+.
Для получения МСК из ЖТ в условиях культивирования фрагменты ЖТ в стерильных условиях измельчали микроножницами, инкубировали в 0,075 % растворе коллагеназы (тип 1) в течение 60 мин при температуре 37°С, при постоянном помешивании. Фермент инактивировали путем добавления (1:1) среды DMEM (Sigma) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), клетки осаждали путем центрифугирования в течение 5-10 мин при скорости 1000 об./мин. Жидкую фазу со зрелыми жировыми клетками удаляли пипеткой Пастера, осадок ресуспендировали в среде роста (DMEM + 10% ЭТС). Выделяли мононуклеарные клетки путем центрифугирования в течение 30 мин при скорости 1000 об./мин в градиенте плотности Histopaque (Sigma). Полученную суспензию клеток отмывали дважды в среде роста путем центрифугирования в течение 10 мин при скорости 1000 об./мин, фильтровали через нейлоновый мешочек и после осаждения ресуспендировали в среде роста. Затем клетки помещали на дно пластиковых чашек Петри по 5-9х10б клеток на 1 чашку. Осторожно без круговых движений распределяли суспензию равномерно по всей поверхности дна чашки Петри. Культуры содержали в СО2-инкубаторе в стандартных условиях (95% влажности, 37°С). Для удаления неадгезированных элементов на следующие сутки питательную среду в культурах заменяли, добавляли факторы роста — 20 нг/мл bFGF (Sigma) и 20 нг/мл EGF (Sigma). В после-
дующем культуральную среду меняли через каждые 3-4 сут. Первый пассаж проводили при 50-70% конф-люэнтности монослоя (7-9-е сутки культивирования). Питательную среду заменяли 0,25% раствором трипсина, инкубировали в течение 30 мин при температуре 37°С, осаждали путем центрифугирования в течение 10 мин при скорости 1000 об./мин. Осадок ресуспендировали в среде роста и рассаживали по 1х10б клеток на чашку. Аналогичным способом получали второй и последующие пассажи (максимально 5). Для гистологического исследования часть клеток культивировали на адгезивных покровных стеклах, предварительно обработанных полиэтиленимином (Sigma).
Для индукции нейроглиального дифференцирования в культуры клеток 2-го пассажа добавляли специфические факторы нейрогенного дифференцирования: ретиноевую кислоту (1 мкмоль) или/и 5-аза-цитидин (1 мкмоль) как отдельно, так и в сочетании. Все культуры ежедневно прижизненно наблюдали с помощью инвертированного микроскопа Биолам П-3 (Россия) и Nikon Eclipse TS100 (Япония). Для цитологического исследования в разные сроки наблюдения культуры фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, окрашивали гематоксилином Караччи и тионином по Нисслю для выявления тонкой структуры нейроцитов, иммуногистохимически выявляли GFAP белок (глиальный маркер) по стандартной методике с помощью комплексного набора Mouse universal kit RNN34 (производства фирмы AMERSHAM, США).
Результаты и их обсуждение. По данным прижизненного наблюдения культивируемых МСК из ЖТ экспериментальных животных и человека в динамике роста в течение 3-5 пассажей, диссоциированные клетки, выделенные из СВФ ЖТ хорошо прикрепляются к пластиковому субстрату чашек Петри. При этом не адгезированные к пластику гемопоэтические клетки постепенно десквамировались, а на дне чашек формировалась культура фибробластоподобных клеток МСК (рис. 1). На цитологических препаратах культивируемых МСК из ЖТ в диссоциированных культурах, независимо от источника получения ЖТ, преобладали мономорфные клетки округлой формы разного диаметра, среди них выявляли клетки биполярной формы с отростками.
При дальнейшем культивировании по мере увеличения плотности клеток монослоя в большинстве
из них появлялись четкие признаки конусообразного выпячивания полюса цитоплазмы и образования коротких отростков. После первого пассажа в сформированных колониях условно выделяли два типа стромальных клеток из ЖТ: увеличенные фиброблас-топодобные клетки с наличием филоподий и клетки с крупными ядрами, содержащими по 1-2 ядрышка с наличием вакуолей в цитоплазме. Кроме того, в зоне роста культур МСК наблюдали относительно мелкие клетки веретенообразной формы с четко выраженным ядром и короткими отростками.
В динамике пассирования культур МСК сохраняют приобретенные фенотипические особенности в течение 29-32 сут. Наблюдаемые нами фенотипические особенности клеточного состава культур, полученных из ЖТ, совпадают с описанными в литературе [14].
На 3-4-е сутки после добавления в среду роста культур МСК факторов нейрогенной дифференцировки — ретиноевой кислоты и/или 5-азацитидина как отдельно, так и в сочетании, в культурах МСК из ЖТ появлялись клетки с цитологическими признаками нейробластного фенотипа. Они приобретали веретенообразную и униполярную форму с образованием длинных отростков. Цитоплазматические тела некоторых нейроклеток приобретали звездчатую форму с наличием коротких цитоплазматических отростков, подобных дендритам.
В динамике наблюдения через 2 нед среди МСК из ЖТ, культивируемых в питательной среде, содержащей факторы нейрогенной дифференцировки, обнаружены нейроноподобные и астроцитоподобные формы нейроклеток с увеличенной длиной и количеством отростков, которые обычно были в несколько раз длиннее цитоплазматического тела нейроклетки. Местами в таких культурах нейроклеток отмечена тенденция к образованию межклеточных контактов. Постепенно увеличивалась доля нейроклеток пирамидной и звездчатой форм с наличием множественных ветвящихся отростков, имитирующих сетеобразные структуры, характерные для архитектоники нервной ткани in vivo (рис. 2).
После 5-го пассажа в зоне роста культур МСК из ЖТ определяли нейроклетки угловатой формы с несколькими отростками с признаками дихотомического деления. Местами выявляли переходные типы ней-
Рис. 1. Микрофото. Клеточный состав живой культуры МСК из ЖТ крыс на 9-е сутки. Пояснение в тексте. Ув.х100.
Рис. 2. Микрофото. МСК ЖТ человека. 2-й пассаж. 29-е сутки культивирования. Пояснение в тексте. Окрашивание гематоксилином Караччи. Ув.х400.
роклеток от биполярных к мультиполярным формам нейроцитов (рис. 3). Между такими нейроклетками обнаружены межклеточные контакты.
Таким образом, при культивировании МСК из ЖТ в присутствии ретиноевой кислоты достигнуто дифференцирование части клеток в нейрональном направлении. При этом доля таких клеток составляет приблизительно 10% от общего количества МСК недифференцированного типа.
В серии наблюдений МСК, культивированных в питательной среде с добавлением 5-азацитидина, также определяли цитологические признаки фено-типической дифференцировки части клеток в нейро-ноподобные и глиоподобные формы с образованием хорошо развитых отростков разного типа (рис. 4).
При сопоставлении клеточного состава культур на цитологических препаратах МСК в сериях опытов с добавлением в культуральную среду ретиноевой кислоты и 5-азацитидина, отдельно или одновременно, не удалось обнаружить каких-либо существенных различий эффективности индукции фенотипических признаков нейроглиальной дифференцировки в куль-
»
Рис. 3. Микрофото. Признаки нейрогенной дифференцировки МСК из ЖТ крысы. 31-е сутки роста в питательной среде с ретиноевой кислотой, 5-й пассаж. Нейроклетки нейроноподобного фенотипа с дихотомически ветвящимися отростками. Окраска гематоксилином Караччи. Ув.х800.
Рис. 5. Микрофото. Культура МСК из ЖТ при добавлении ретиноевой кислоты в питательную среду. Комплекс нейроклеток с позитивной иммуногистохимической реакцией на GFАP. Ув.х800
тивируемых МСК. Это позволяет предположить, что оба индуктора оказывают сходное влияние на способность МСК из ЖТ к нейроглиальной дифференцировке в условиях длительного культивирования.
При сравнительном анализе способности к индуцированной дифференцировке МСК, выделенных из ЖТ человека и крысы, установлено, что в условиях культивирования МСК из ЖТ обоих источников цитологические признаки дифференцировки в нейро-нальном и глиальном направлении однотипны. Важно, что в контрольных культурах, в которые индукторы дифференцировки не добавляли, на подложке определяли лишь изолированные клетки недифференцированного фенотипа округленной формы.
По данным иммуногистохимического исследования экспрессии кислого фибриллярного белка (GFАP) в цитоплазме МСК при культивировании МСК из ЖТ, в присутствии ретиноевой кислоты на 28-е сутки культивирования в цитоплазме большинства нейроклеток выявляли включения продукта реакции на GFАP в виде зернистости коричневой окраски, что отражало их нейроглиальный генез (рис. 5). В
Рис. 4. Микрофото. Живая культура МСК из ЖТ крысы, 5-й пассаж. Наличие 5-азацитидина в питательной среде. Пояснение в тексте. Ув.х400.
Рис. 6. Микрофото. Культура МСК из ЖТ при добавлении 5-азацитидина в питательную среду. Комплекс нейроклеток с позитивной реакцией на GFАP в цитоплазме. Ув.х800.
отличие от этого, в контрольных культурах МСК в эти сроки при отсутствии в питательной среде индукторов дифференцировки в цитоплазме клеток продукт реакции не обнаружен.
При иммуногистохимическом исследовании препаратов МСК из ЖТ, культивируемых с 5-азацитиди-ном, также отмечена позитивная реакция на GFAP в цитоплазме некоторых нейроклеток в виде включений компактной зернистости продукта реакции коричневой окраски (рис. 6).
Выводы. 1. Использование методики получения клеточного материала из СВФ ЖТ экспериментальных животных и человека и последующее долгосрочное культивирование позволяют получать фракцию МСК.
2. Цитологический анализ клеточного состава культур в динамике наблюдения показал, что по фенотипическим признакам культивируемые клетки относятся к МСК. Они проявляют адгезивные свойства, приобретают фибробластоподобный фенотип, способность к пролиферации и пластичности.
3. Наличие в культуральной среде индукторов специфической дифференцировки — ретиноевой кислоты и/или 5-азацитидина стимулирует появление цитологических признаков индуцированной ней-роглиальной дифференцировки в части клеток. Это проявляется формированием характерного фенотипа нейроцитов и астроцитов с тенденцией к образованию сетчатых структур, свойственных нервной ткани, что подтверждается данными иммуногистохимических исследований культивированных клеток с выявлением GFAP в цитоплазме трансформированных клеток.
4. При сравнительной оценке цитологических препаратов культивируемых МСК в сериях опытов с добавлением в культуральную среду ретиноевой кислоты и 5-азацитидина, отдельно или одновременно, не обнаружены существенные различия эффективности направленной индукции нейроглиальной дифференцировки в культивируемых МСК.
Список литературы
1. US Patent 7078230. Adipose tissue-derived stromal cells for that expresses characteristics of a neuronal cell / W.O. Wilkinson, G.M. Gimble. — Appl. N:09/793173, 07/18/2006.
2. US Patent 7582292. Adipose tissue derived stromal cells for the treatment of neurological disorders / W.O. Wilkinson, J.M. Gimble, P. Vanguri. — Appl. N:11/286900, 09/01/2009.
3. Десятилетний опыт применения биотехнологий / В.К. Гринь, А.Г. Попандопуло, А.А. Штутин А.М. Гнилорыбов,
О.И. Миминошвили, Э.Я. Фисталь, В.Ю. Михайличенко // Вестн. неотлож. и восстановит. медицины. — 2012.
— Т.13,№1. — С.3-9.
4. Исследование влияния мезенхимальных стволовых клеток
на восстановление двигательных и когнитивных функций у крыс после острой фокальной ишемии головного мозга / В.К. Гринь, А.Г. Попандопуло, Б.Б. Ивнев, Р.М. Радык // Вестн. неотлож. и восстановит. медицины. — 2012. — Т.13, №1. — С.151.
5. Improvement of neurological deficits by intracerebral transplantation of human adipose tissue-derived stromal cells after cerebral ishemia in rats / S.K. Kang, D.H. Lee, Y.C. Bae, H.K. Kim, S.Y. Baik, J.S. Jung // Exp. Neurol. — 2003.
— N183. — P.355-366.
6. Systemic transplantation of human adipose stem cells attenuated cerebral inflammation and degeneration in a hemorrhagic stroke model / J. Kim, S. Lee, K. Chu, K.H. Jung, E.C. Song, S.J. Kim, D.I. Sinn, J.H. Kim, D.K. Park, K.M. Kang, N H.Hong, H.K. Park, C.H. Won, K.H. Kim, M. Kim, S. K.Lee, J.K. Roh // Brain Res. — 2007. — V.1183. — P.43-50.
7. Применение мультипотентных мезенхимальных стромаль-
ных клеток жировой ткани человека для компенсации неврологического дефицита у крыс, вызванного введением 3-нитропропионовой кислоты / А.В. Куликов, М.С. Степанова, С.Л. Стволинский, Р.М. Худоерков, Д.Н. Воронков, А.А. Ржанинова, Д.В. Гольдштейн, А.А. Болдырев // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2008.
— №2. — С.83-89.
8. Kim S. Motor function recovery after adipose tissue derived mesenchymal stem cell therapy in rats with cerebral infarction / S. Kim, D. Lee, Y. Bae // J. Korean Neurosurg. Soc. — 2006. — V.40, N4. — P.267-272.
9. Adipose-derived mesenchymal stem cells ameliorate chronic
experimental autoimmune encephalomyelitis / G. Constantin, S. Marconi, B. Rossi, S. Angiari, L. Calderan, E. Anghileri, B. Gini, S.D. Bach, M. Martinello, F. Bifari, M. Galie, E. Turano, S. Budui, A. Sbarbati, M. Krampera, B. Bonetti // Stem Cells.
— 2009. — V.27, N10. — P.2624-2635.
10. Adipose stromal cells secreted neuroprotective media against neuronal apoptosis / X. Wei, L. Zhao, J. Zhong, H. Gu, D. Feng, B.H. Johnstone, K.L. March, M.R. Farlow, Y. Du // Neurosci. Lett. — 2009. — V.462, N1. — P.76-79.
11. Репин В.С. Эмбриональная стволовая клетка: от фундаментальных исследований в клинику / В.С. Репин // Патол. физиология и эксперим. терапия. — 2001. — №2.
— С.3-8.
12. Zavan B. Neural Potential of Adipose Stem Cells / B. Zavan // Discovery Med. — 2010. — N50. — P.37-43.
13. Isolation of multipotent stem cells from mouse adipose tissue / N. Yamamoto, H. Akamatsu, S. Hasegawa, T. Yamada, S. Nakata, M. Ohkuma, E. Miyachi, T. Marunouchi, K. Matsunaga // J. Dermatol. Sci. — 2007. — V.48, N1. — P.43-52.
14. Морфология, кинетика роста и фенотип мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и жировой ткани человека / М.М. Зафранская, Н.В. Ламовская, Д.Б. Ниже-городова, М.Ю. Юркевич, С.С. Багатка, С.Ю. Мечковский, Г.И. Иванчик // Иммунопатология, аллергология, инфек-тология. — 2010. — №4. — С.86-93.
Семенова В.М.1. Л/сяний М.1.2, Стайно Л.П.1, Бельська Л.М.2, Егорова Д.М.1
1 Лабораторiя культивування тканин, 1нститут нейрохiрурпT iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украши, КиТв, УкраТна
2 Вщдш нейроiмунолопT, 1нститут нейрохiрурпT iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН УкраТни, КиТв, УкраТна
Пролiферативний та диференцiювальний потенцiал мезенхiмальних стовбурових клiтин з жирово! тканини в умовах культивування
Мета. Культивування мезенхiмальних стовбурових клiтин (МСК) з жировоТ тканини (ЖТ) експериментальних тварин i людини для вивчення шдукцм нейрогенного диференцiювання. Матер1али i методи. Для культивування МСК використана ЖТ вщ 30 експериментальних тварин та 5 пащен^в. Культури МСК дослщжеш протягом 5 пасажiв. Для шдукування нейрогенного диференцiювання використанi ретиноева кислота (1 мкмоль) та/або 5-азацитидин (1 мкмоль). Культури вивчеш прижиттево, а також за даними цитолопчного та iмуногiстохiмiчного дослiджень. Результати. В культурах кл^ин з ЖТ вiдзначений рют фiбробластоподiбних МСК. У присутностi факторiв специфiчного диференцiювання вони набувають нейроноподiбного або астроцитоподiбного фенотипу з позитивною реакшею на GFAP.
Висновки. В культурах ^тин з ЖТ експериментальних тварин та людини отримана фракшя МСК, здатних до шдукованого нейрогенного диференшювання пiд впливом ретиноевоТ кислоти та/або 5-азацитидину, що тдтверджують данi iмуногiстохiмiчних дослiджень.
Ключовi слова: мезенх/мальн/ стовбуровi клтини, жирова тканина, культура, нейрогл'альне диференц/ювання.
Укр. нейрохiрург. журн. — 2014. — №3. — С. 24-29.
Над/йшла до редакцп 05.03.14. Прийнята до публ/кацп 25.04.14.
Адреса для листування: Семенова В/ра Михайл/вна, Лаборатор/я культивування тканин, 1нститут нейрох/рургп iM. акад. А.П. Ромоданова, вул. Платона Майбороди, 32, Ки/в, УкраУна, 04050, e-mail: [email protected]
Semenova V.M.1, Lisianiy M.I.2, Stayno L.P.1, Belska L.M.2, Yegorova D.M.1
1 Tissue Culture Laboratory, Institute of Neurosurgery named after acad. A.P. Romodanov NAMS Ukraine, Kiev, Ukraine
2 Neuroimmunology Department, Institute of Neurosurgery named after acad. A.P. Romodanov NAMS Ukraine, Kiev, Ukraine
Proliferative and differentiated potential of mesenchymal stem cells from adipose tissue under cultivation conditions
The purpose. Cultivation of mesenchymal stem cells (MSCs) from adipose tissue (AT) of experimental animals and humans to study induction of neurogenic differentiation.
Materials and methods. AT samples from 30 experimental animals and 5 patients were used. MSCs cultures were studied for 5 passages. To induce neurogenic differentiation retinoic acid (1 mkM) and/or 5-azacytidine (1 mkM) were used. Cultures were observed in vivo, also according to cytological and immunohistochemical studies.
Results. Fibroblast-like MSCs growth was observed in cell cultures from AT. At presence of specific differentiation factors they acquired neuron-like or astrocyte-like phenotype with positive staining to GFAP.
Conclusions. In cultures of animal and human AT cells fraction of MSCs was derived, capable to induce neurogenic differentiating under the influence of retinoic acid and/or 5-azacytidine, as confirmed by immunohistochemistry.
Key words: mesenchymal stem cells, adipose tissue, culture, neuroglial differentiation. Ukr Neyrokhir Zh. 2014; 3: 24-9.
Received, March 5, 2014. Accepted, April 25, 2014.
Address for correspondence: Vera Semenova, Tissue Culture Laboratory, Institute of Neurosurgery named after acad. A.P. Romodanov, 32 Platona Mayborody St., Kiev, Ukraine, 04050, e-mail: [email protected]
