CC BY
74
84
Украгнський нейрохгрурггчний журнал, №4, 2006
УДК 616.831-089.843-031:611.813.3.018.032
Потенциальные свойства нейроклеток из обонятельной луковицы человека в условиях культивирования
Зозуля Ю.А.,Семенова В.М., Лисяный Н.И, Любич Л.Д., Высоцкий Н.С., Стайно Л.П., Медведев В.В.
Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова АМН Украины, г. Киев, Украина
В условиях длительного культивирования изучены потенциальные свойства нейроклеток обонятельной луковицы (ОЛ) человека. Установлена возможность фенотипической идентификации нейральных стволовых клеток (НСК) в гистоструктуре нативной ткани и диссоциированных культурах этого образования. Показано модифицирующее влияние культивационной среды различного состава на процессы пролиферации и дифференци-ровки нейроклеток ОЛ.
Ключевые слова: нейральные стволовые клетки, обонятельная луковица, культивирование нейроклеток.
Вступление. Разработка методов лечения различных заболеваний человека с применением стволовых клеток (СК) является одним из прогрессивных направлений современной медицины. Внедрение клеточных технологий с использованием СК различного генеза позволит принципиально изменить существующие подходы к лечению и поддерживающей терапии некоторых тяжелых и неизлечимых болезней человека, оптимизировать решение проблем геронтологии в плане увеличения продолжительности и улучшения качества жизни пациентов пожилого и старческого возраста.
В области неврологии и нейрохирургии клеточная терапия с применением эмбриональных и постнатальных НСК перспективна для повышения эффективности лечения болезней Пар-кинсона, Альцгеймера, рассеянного склероза, ишемических, постинсультных и посттравматических состояний и даже опухолей мозга, что экспериментально подтверждено на многих моделях церебральной и спинальной патологии. В настоящее время во всех развитых странах мира это направление является интенсивно развивающимся разделом реконструктивной нейрохирургии.
Важное практическое значение имеет изучение биологии и потенциальных свойств ней-роклеток из ОЛ человека. Обращение к этому объекту обусловлено тем, что ядро ОЛ взрослых млекопитающих и человека считают возможным источником получения НСК для их дальнейшего использования в нейротрансплантации при некоторых дегенеративных заболеваниях ЦНС [8, 10]. ОЛ представляет объект для реального получения НСК у взрослых пациентов в связи с ее ограниченным объемом и анатомически автономной топографией. Эти преимущества
ОЛ по сравнению с другими регионами генерации НСК в головном мозге взрослых пациентов обеспечивают относительную доступность хирургического удаления ОЛ и последующего культивирования клеточного материала.
Установлено, что ОЛ постнатального мозга, будучи завершением рострального миграционного тракта, сформированного астроцитами, аккумулирует популяцию НСК, которые из субвентрикулярной зоны (СВЗ) мигрируют в ОЛ и дифференцируются в нервные и глиальные клетки [14, 15]. Вновь реплицированные нейроны дают иммуногистохимически положительную реакцию на нестин (маркер нейроэпителиаль-ных стволовых клеток) и ТиС4 (маркер пост-митотических клеток). При этом постоянное обновление обонятельных нейронов в ОЛ млекопитающих и человека обеспечивает базисный механизм постнатального нейрогенеза за счет НСК. В связи с этим ОЛ рассматривают как резервуар прогениторных/стволовых нейрокле-ток, представляющий динамическую клеточную микросистему с нейрогенераторными свойствами [8]. В условиях культивирования НСК из ОЛ способны генерировать нейросферы, что является классическим признаком полноценных НСК [9, 11]. Основной фактор роста фиброблас-тов (bFGF) потенцирует самообновление НСК, полученных из ОЛ, а Р-фактор роста нервов стимулирует их дифференциацию в зрелые нейроны и разные типы глии [10].
Целью работы явилось изучение фенотипи-ческих особенностей и потенциальных свойств нейроклеток из ОЛ человека в диссоциированных культурах при использовании питательной среды различного состава.
Материалы и методы исследования. Диссоциированные культуры получены из 14
ОЛ, удаленных во время нейрохирургических операций, при доступе к базальным внемозго-вым опухолям (менингиомам). Использованы общепринятые методики культивирования, разработанные для нервной ткани [1]. Благодаря щадящей механической диссоциации ткани ОЛ содержание живых нейроклеток в 1 мл полученной суспензии составило в среднем 2-10х106, что считают удовлетворительным показателем их жизнеспособности для последующего культивирования, которое проводили: 1) в питательной среде стандартного состава (среда DMEM, эмбриональная телячья сыворотка — 40%, глюкоза — 8 г/л, инсулин 0,2 ед/мл); 2) в бессывороточной питательной среде для подавления пролиферации нейроклеток; 3) в присутствии ретиноевой кислоты (2х106 моль/л, Retinoic acid, Sigma) для изучения способности нейроклеток ОЛ к нейробластной дифференцировке. Культуры содержали в углекислотном инкубаторе при постоянной температуре (36°С), влажности (90%) и концентрации СО2 (5%). Через каждые 3-4 сут питательную среду обновляли и определяли количество и жизнеспособность ней-роклеток в 1 мл суспензии (стандартный тест с трипановым синим). Иммуногистохимическое исследование препаратов с окраской на вимен-тин проводили с помощью наборов "Sigma" (Германия). Культуры наблюдали прижизненно в инвертированном микроскопе (БИОЛАМ П-3 производства ЛОМО, Санкт-Петербург), изучали на фиксированных цитологических препаратах (на покровных адгезивных стеклах), окрашенных гематоксилином Караччи или тионином. Микроскопию препаратов проводили на цито-анализаторе изображения Ibas-2000 (Германия) с последующей фоторегистрацией. При цитологическом анализе переживающих культур ОЛ в динамике наблюдений учитывали количество жизнеспособных нейроклеток, характер их пролиферации, дифференцировки и дегенерации, а также особенности формирования пространственной архитектоники клеточных ансамблей. Для адекватной оценки фенотипа культивируемых нейроклеток предварительно изучали структуру нативной ткани ОЛ, полученной у 3 пациентов при патологоанатомическом исследовании и обработанной с помощью общепринятых гистологических методов.
Результаты и их обсуждение. При гистологическом исследовании в структуре нативной ткани ОЛ обнаружены нейроклетки различной степени дифференциации. В центральных отделах ОЛ определяли преимущественно мульти-полярные крупные нейроциты с базофильной гранулярной субстанцией Ниссля в цитоплазме и характерными пузырьковидными ядрами с крупными единичными ядрышками. Такие ней-
роциты имели хорошо развитые множественные отростки различной длины. Более мелкие нейроциты угловатой формы имели широкое основание в виде митры и содержали гранулы Ниссля в цитоплазме. По данным классической нейрогистологии, такие типы нейроцитов обозначают как митральные клетки, специфичные для микроструктуры ОЛ [2]. Глиальный компонент в ткани ОЛ представлен астроцитами и олигодендроцитами вокруг нейроцитов. Помимо дифференцированных нейроклеток, в ткани ОЛ обнаружены диффузно рассеянные немногочисленные безотростчатые нейроклетки округлой формы с узкой цитоплазмой и светлыми ядрами (рис. 1 цветной вкладки). Упрощенную микроструктуру таких нейроклеток в литературе определяют как „минимальный фенотип", характерный для СК различного генеза [3]. Полученное представление о клеточном составе ОЛ стало основополагающим для цитологической идентификации нейроклеток в условиях культивирования.
По данным прижизненных наблюдений культур ОЛ в первые 1-2 сут культивирования клеточной суспензии происходило массовое прикрепление к субстрату большинства округленных безотростчатых нейроклеток с опалес-цирующей цитоплазмой, которые располагались изолированно или в виде микроагрегатов различной плотности. На 3-4-е сутки среди них различали отдельные клетки угловатой и ромбовидной формы с начальными признаками формирования коротких конусовидных отростков. На 5-7-е сутки, по мере разрыхления микроагрегатов, между такими отростками местами устанавливались межклеточные контакты. Учитывая особенности клеточного состава исходной ткани ОЛ, правомерно предположить, что эти нейроклетки представляют фракцию исходно присутствующих в ОЛ нейроцитов, которые выдержали механическую диссоциацию, адаптировались к условиям жизнедеятельности in vitro и сохранили способность к регенерации отростков. В дальнейшем эти предсуществовав-шие нейроциты, лишенные глиального сопровождения, подвергались спонтанной дегенерации и к 10-12-м суткам десквамировались.
В последующем при культивировании суспензии ОЛ в полной питательной среде преобладали недифференцированные безот-ростчатые нейроклетки, формировавшие на субстрате небольшие колонии, кластеры и мелкие сфероидные микроагрегаты, постепенно увеличивавшиеся в объеме. Эти многослойные нейросфероподобные структуры содержали недифференцированные нейроклетки и компактные скопления виментин-положительных прогениторных нейроклеток, из них лишь в
некоторых проявлялась тенденция к образованию начальных отростков (рис. 2, а, б, в цветной вкладки).
О пролиферации культивируемых ней-роклеток ОЛ свидетельствовало также часто выявляемое их попарное расположение на субстрате, что косвенно отражает их способность к самовоспроизведению путем прямого симметричного деления.
В динамике прижизненного наблюдения культур ОЛ в питательной среде полного состава без митогенов обнаруживали постепенное уменьшение количества нейроклеток вследствие прогрессирующей дегенерации большинства из них. На 29-30-е сутки прикрепленными к субстрату оставались лишь отдельные, преимущественно мелкие компактные сфероидные структуры, цепочечные клеточные комплексы и единичные нейроклетки с сохранной морфологией недифференцированного фенотипа. Наибольший срок переживания таких нейроклеток в отдельных наблюдениях достигал 62-86 сут.
Помимо фиксированных к субстрату ней-роклеток, во все сроки культивирования ОЛ выявляли также рыхло связанные с подложкой флюктуирующие монослойные пласты безот-ростчатых нейроклеток без каких-либо признаков специфической дифференцировки.
При количественной оценке содержания и жизнеспособности нейроклеток ОЛ, культивируемых в полной питательной среде в течение 30 сут, подтверждается наблюдаемое постепенное уменьшение доли жизнеспособных нейроклеток с 61,9 до 20,8%, т.е. в 3 раза, что может указывать на постепенную элиминацию фракции короткоживущих нейроклеток ОЛ при сохранении пролиферативных способностей немногочисленной популяции, формирующей клоны, кластеры и сфероподобные структуры.
Таким образом, при длительном культивировании нейроклеток ОЛ в питательной среде с наличием сыворотки проявляется способность к самовоспроизведению небольшой части ней-роклеток, предположительно — НСК, которые длительно и стабильно сохраняют недифференцированный фенотип.
В условиях бессывороточного содержания культур ОЛ на 29-30-е сутки отмечали уменьшение количества недифференцированных нейроклеток в 2 раза (до 11,9%). При отсутствии сфероидоподобных комплексов в этих культурах обнаружены мультиполярные нейроциты и глиоциты астроцитарного и олигодендрогли-ального фенотипов (рис. 3, а, б, в цветной вкладки). Местами фибриллярные астроциты продуцировали глиофибриллы, имитирующие участки глиоза.
Таким образом, в условиях бессывороточного культивирования нейроклеток ОЛ подтвержден ожидаемый эффект блокирования их пролиферации и проявления фенотипических признаков их мультипотентной дифференцировки в ней-рональном и глиальном направлении.
В отличие от предыдущих опытов, при культивировании нейроклеток ОЛ в бессывороточной среде с добавлением ретиноевой кислоты во все сроки наблюдения определяли большее содержание жизнеспособных ней-роклеток. Так, через 17 сут культивирования количество "живых" нейроклеток составляло 51,8-42,8%, в период 18-28 сут —29,2%, что было значительно больше, чем в группах сравнения. В то же время, в этих культурах выявляли более многочисленную фракцию нейроклеток с характерным фенотипом нейробластов и зрелых нейроцитов. У них были хорошо выраженные цитоплазматические тела, они содержали характерные ядра с крупными ядрышками, были снабжены многочисленными отростками различной длины с боковым и терминальным ветвлением. В динамике прижизненного наблюдения таких нейроцитов отмечалось постепенное удлинение их новообразованных отростков, что отражает процесс их созревания. На цитологических препаратах этих культур четко прослеживается разнообразие фенотипических форм нейронов с наличием множественных, ветвящихся отростков различной длины (рис. 4, а, б цветной вкладки).
Важно отметить образование межклеточных связей между нейронами благодаря своеобразным анастомозам между их отростками с формированием гистотипических нейрональ-ных ансамблей в связи с направленным ростом аксонов и межклеточным контактированием дендритов. При этом в присутствии в питательной среде культур ретиноевой кислоты нейроциты сохраняли характерную морфологию зрелых типов на протяжении 46-50 сут (рис. 5 цветной вкладки).
Таким образом, при культивировании ней-роклеток ОЛ в питательной среде с добавлением ретиноевой кислоты моделируется индукция их специфической дифференцировки в ней-робластном и нейрональном направлениях, а также более длительно сохраняется оптимальная выживаемость нейроклеток. Аналогичный эффект дифференцирующего и протекторного влияния ретиноевой кислоты наблюдали в культурах криоконсервированных нейроклеток человека [5].
Заключение. При исследовании потенциальных свойств нейроклеток ОЛ в динамике длительного культивирования установлена возможность идентификации НСК, которые
длительно и стабильно сохраняют недифференцированный фенотип, идентичный таковому в нативной ткани ОЛ (in vivo). По нашим наблюдениям эта малочисленная популяция округленных безотростчатых нейроклеток без каких-либо признаков специфической дифференциации диффузно рассеяна в ткани ОЛ среди многочисленных дифференцированных нейроцитов и глиоцитов и характеризуется минимальным фенотипом. При культивировании в питательной среде с наличием сыворотки такие нейроклетки длительно и стабильно сохраняют недифференцированный фенотип и способны формировать многоклеточные ней-росфероподобные структуры, что является классическим свойством НСК. Это подтверждает стимулирующее влияние сыворотки на пролиферативный потенциал культивируемых клеток, тогда как удаление сыворотки — блокирует их пролиферацию и способствует диф-ференцировке [13].
В динамике культивирования ОЛ в этих условиях выживаемость большинства нейрокле-ток неуклонно снижалась (через 30 сут — в 9-10 раз) вследствие элиминации короткоживующей фракции нейроклеток, а также нарастающей спонтанной инволюции культур, обусловленной дефицитом митогенных стимулов. При этом признаки спонтанной дифференцировки отдельных нейроклеток ограничивались формированием в них коротких примитивных отростков, что отражает начальные проявления дифференци-ровки в соответствии с внутренней клеточной программой, регулирующей этот процесс.
В диссоциированных культурах ОЛ выявлена способность части нейроклеток к специфической дифференцировке, направленность которой зависит от состава питательной среды, т.е. обусловлена влиянием их локального микроокружения. Максимальный дифференцировоч-ный потенциал нейроклеток ОЛ проявляется в модифицированных условиях культивирования, способствующих увеличению популяции специализированных типов нейроклеток. Так, при культивировании нейроклеток в бессывороточной питательной среде ДМЕМ проявляется их способность дифференцироваться в нейроциты и глиоциты; присутствие ретиноевой кислоты — обеспечивает преимущественно нейроблас-тную дифференцировку нейроклеток с терминальным формированием зрелых нейроцитов мультиполярной формы. Для них характерны длинные ветвящиеся отростки и формирование пространственных ансамблей, типичных для нейрональных сетей. Наряду с этим присутствие ретиноевой кислоты обеспечивает выживаемость большего количества нейроклеток по сравнению с таковым при применении других
модификаций их культивирования, что, по-видимому, отражает протекторный эффект этого препарата. Под влиянием ретиноевой кислоты в культуральной среде происходит нейроноподобная дифференцировка мультипо-тентных СК стромы костного мозга [6].
Наши наблюдения согласуются с данными М. Schuldiner и соавторов [12], показавших, что при культивировании нейроклеток в бессывороточной питательной среде, а также в среде, содержащей ретиноевую кислоту, индуцируется нейрональная дифференцировка НСК и экспрессия нейронспецифических молекул. Считают, что ретиноевая кислота, запускающая нейрогенез, является незаменимым индуктором нейрогенинов или NeuroD на пути дифферен-цировки эмбриональных СК в нейроны. Однако пока не разработаны четкие прописи целенаправленного получения холинэргических, ГАМК-или серотонинэргических нейронов на этапе дозревания бластных форм [4, 7].
Таким образом, потенциальные свойства нейроклеток ОЛ постнатального мозга взрослого человека, исследованные в динамике длительного культивирования, свидетельствуют об их пластичности и мультипотентности, что является важнейшей характеристикой НСК и обусловлено первостепенной значимостью внеклеточных сигналов локального микроокружения [16].
Список литературы
1. Божкова В.П., Брежестовский Л.А., Буравлев В.М. Руководство по культивированию нервной ткани. Методы. Техника. Проблемы. — М.: Наука, 1988.
— 317 с.
2. Гринштейн А.М. Пути и центры нервной системы.
— М..: Медгиз, 1946. — 328 с.
3. Запорожан В.Н., Бажора Ю.И. Стволовые клетки.
— Одесса: Одес. гос. мед. ун-т, 2004. — 228 с.
4. Репин В.С., Ржанинов А.А., Шаменков Д.А. Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина. — М.: Реметэкс, 2002. — 224 с.
5. Семенова В.М., Лисяный Н.И., Любич Л.Д. и др. Изучение индукции дифференцировки клеток, полученных из эмбрионального и постнатального мозга в условиях культивирования in vitro // Укр. нейрохiрург. журн. — 2004. — №1. — С.4-7.
6. Щегельская Е.А., Микулинский Ю.Е., Ревищин А.В. и др. Индуцированная дифференцировка клеток стромы костного мозга мыши в нервные клетки // Цитология. — 2002. — Т.44, №2.
— С.637-641.
7. Bain G., Kitchens D., Yao M. et al. ESC express neuronal properties in vitro // Dev. Biol. — 1995.
— V.168. — P.342-357.
8. Liu Z., Martin L.J. Olfactory bulb core is a rich source of neural progenitor and stem cells in adult rodent and human // J. Comp. Neurol. — 2003.
— V.459, N4. — P.368-391.
9. Othman M.M., Klueber K.M., Roisen F. J. Identification and culture of olfactory neural progenitors from GFP mice // Biotech. Histochem. — 2003. — V.78, N2. — P.57-70.
10. Pagano S., Impagnatiello F., Girelli M. et al. Isolation and characterization of neural stem cells from the adult human olfactory bulb // Stem Cells. — 2000.
— V.18, N4. — P. 295-300.
11. Roisen F.J., Klueber K.M., Lu C.L. et al. Adult human olfactory stem cell // Brain Res. — 2001. — V.890, N1. — P.11-22.
12. Schuldiner M., Eiges R., Eden A. Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells // Brain Res. — 2001. — V.913, N2. — P.201-205.
13. Skogh C., Eriksson C., Kokaia M. Generation of regionally specified neurons in expanded glial cultures derived from the mouse and human lateral ganglionic eminence // Molec. Cell. Neurosci. — 2001.
— V.17, N5. — P.811-820.
14. Taupin P., Gage F.H. Adult neurogenesis and neural stem cells of the central nervous system in mammals // J. Neurosci. Res. — 2002. — V.69, N6.
— P.745-749.
15. Temple S., Alvarez-Buylla A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system// Curr. Opin. Neurobiol. — 1999. — V.9, N1. — P.135-141.
16. Vescovi A.L., Parati E.A., Gritti A. et al. Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation // Exp. Neurol. — 1999. — V.1.
— P.71-83.
Потенцшш властивосТ нейрокл1тин з нюхово'1 цибулини людини в умовах
культивування Зозуля Ю.П., Семенова В.М., Лжяний М.1., Любич Л.Д., Висоцький М.С., Стайно Л.П.,
Медведев В.В. В умовах тривалого культивування досл^жеш потенцшш властивост нейроклгтин нюхово! цибулини людини. Встановлено можливють фенотипово! вден-тифшацп нейральних стовбурових клггин у структурi нативно! тканини та в дисоцшованих культурах цього утворення. Показаний модифшуючий вплив культивацшного середовища рiзного складу на процеси про-лiферацi! та диференщювання нейроклггин нюхово! цибулини.
Potential properties of neural cells from human olfactory bulb in cultivating conditions
Zozulya Yu. A., Semenova V.M., Lisyany N.I., Lyubych L.D., Vysotsky N.S., Stayno L.P., Medvedev V.V.
The potential properties of human olfactory bulb neural cells have been investigated under conditions of long-term cultivation. The authors determined the phenotypic identification of neural stem cells in the histological structure of native tissue and in the dissodated cultures of this formation. The issue shows the modifying influence of culture medium different composition on the processes of proliferation and differentiation of olfactory bulb neural cells.
Коментар
до статт/ Зозул'1 Ю.П., СеменовоТ В.М., Л'сяного М.1 та ¡н. "Потенциальные свойства нейроклеток из обонятельной луковицы в условиях культивирования"
Робота продовжуе цикл започаткованих в 1нститут нейрохiрургN дослщжень з бюлогп нейральних (нейроген-них) стовбурових кл^ин, як передбачають використовувати в майбутньому як замкну кл^инну терашю при деяких нейродегенеративних захворюваннях головного мозку.
Представлен результати експериментального вивчення потенцшних властивостей нейрокл^ин, отриманих з нюховоТ цибулини людини в умовах культивування. Вибiр об'ектом культивування саме нюховоТ цибулини для отри-мання нейрокл^ин зумовлений значним штересом в останнш час до цього утворення у зв'язку з постнатальним нейрогенезом, який вщбуваеться в нш протягом всього життя людини.
Показан вщмшносл пролiферацiйного та диференцшного потенцiалiв культивованих нейрокл^ин з нюховоТ цибулини залежно вщ специфiчного мкрооточення, яке моделювали рiзним складом культивацшного середовища. Авторами встановлено, що наявнють ембрюнально'Т сироватки у складi поживного середовища культур стимулюе пролiферацiю прогежторних вiментин-позитивних нейроклiтин. На вiдмiну вiд цього, у безсироватковому середо-вищi на адгезивному субстрат нейроклiтини культур нюховоТ цибулини виявляють генетично детермшовану муль-типотентнiсть спонтанного диференцiювання у нейробласти та глюцити. За умови додавання до культивацшного середовища ретиноевоТ кислоти вщтворюеться iндукцiя нейрогенного диференцiювання нейрокл^ин у нейробласти та нейроцити з утворенням характерних пстотипових сiткоподiбних структур.
Результати проведених дослщжень добре тюстроваш, детально обговоренi i розширюють уявлення про бюлопю нюховоТ цибулини як джерела нейральних стовбурових кл^ин.
Робота мае як теоретичний, так i практичний штерес.
В./. Цимбалюк, доктор мед. наук, проф., чл.-кор. АМН УкраУни,
зав. кл1н1ки в/'дновноУ нейрох/'рургГУ ¡нституту нейрох/'рургп ¡м. акад. А.П.Ромоданова АМН УкраУни
К статье Зозули Ю.А.,Семеновой В.М., Лисяного Н.И. и др. "Потенциальные свойства нейроклеток из обонятельной луковицы человека в условиях культивирования"
Рис. 1. Клеточный состав нативной ткани ОЛ. Пояснения в тексте. Окраска тионином по Нисслю. Ув.х400.
Рис. 2. а — клеточный микроагрегат-ней-росфера; б — скопление виментин-положитель-ных нейроклеток; в — начальные отростки. Доокраска тионином. Ув.х800.
Рис. 3. Культура нейроклеток ОЛ (через 29 сут): а — мультиполярный нейроцит; б — вере-теновидный олигодендроцит; в — астроциты. Окраска тионином по Нисслю. Ув.х800.
Рис. 4. Культура нейроклеток ОЛ при культивировании в питательной среде с ретиноевой кислотой: а — мультиполярный нейроцит; б — униполярный нейроцит. Окраска тионином. Ув.х800.
Рис. 5. Характерные сетевидные структуры в культуре нейроклеток ОЛ в присутствии рети-ноевой кислоты, 50 сут. Окраска гематоксилином Караччи. Ув.х400.
