CC BY
16
™ DOI: 10.17650/2313-805X-2022-9-1-48-56
О
сч
(«D]
- Производные 3-гидроксихиназолина, § аналоги эрастина, индуцируют ферроптоз в клетках карциномы молочной железы
о
и
о
сс <
Л.М. Борисова, В.Н. Осипов, И.С. Голубева, М.П. Киселева, Д.А. Хоченков, А.А. Вартанян
ш ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; О Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24 Ж.
ю
<
Контакты: Лариса Михайловна Борисова iarib@inbox.ru
Введение. Программы раннего выявления опухоли заметно повысили выживаемость больных раком молочной > железы, однако итоги лекарственной терапии данной патологии не всегда эффективны. Обнаруженная недавно
< железозависимая гибель клетки - ферроптоз - позволяет надеяться на продление ремиссии заболевания.
Цель исследования - изучение индукции ферроптоза в клетках рака молочной железы MCF7 производными 3-ги-_ дроксихиназолина, синтезированными в Научно-исследовательском институте экспериментальной диагностики
s и терапии опухолей Национального медицинского исследовательского центра онкологии им. Н.Н. Блохина Мин-
Q здрава России, и оценка его противоопухолевой активности на перевиваемой карциноме молочной железы Са-755.
^ Материалы и методы. В экспериментах in vitro использовали 2D-культивирование клеток, фазово-контрастную
ü и флуоресцентную микроскопию. Исследования in vivo проведены на модели экспериментального роста карциномы
^ молочной железы у самок гибридов иммунокомпетентных мышей Fl (C57BL/6 х DBA/2).
Результаты. В работе были исследованы 5 производных 3-гидроксихиназолина - аналогов эрастина. Чистота всех О соединений составила более 95 %. Гибель опухолевых клеток по типу ферроптоза идентифицировали по уровню
^ перекисного окисления липидов при IC50: 1/3 и 1/5. Уровень перекисного окисления липидов в клетках MCF7, ин-
ое дуцируемый соединением 3, был сравним с активностью эрастина как при 1/3, так и при 1/5 IC. Активность
остальных 4 производных 3-гидроксихиназолина составляла 50-70 % активности эрастина. В экспериментах in vivo на карциноме молочной железы Са-755 при использовании соединения 3 в дозе 30 мг/кг его противоопухолевый эффект был выше, чем у эрастина, применяемого в той же дозе.
Заключение. Полученные предварительные результаты позволяют предположить, что соединение 3 может рассматриваться в качестве перспективного противоопухолевого средства для лечения рака молочной железы.
>
О
ж.
и >
Ключевые слова: производные 3-гидроксихиназолина, ферроптоз, рак молочной железы, противоопухолевая активность
Для цитирования: Борисова Л.М., Осипов В.Н., Голубева И.С. и др. Производные 3-гидроксихиназолина, аналоги эрастина, индуцируют ферроптоз в клетках карциномы молочной железы. Успехи молекулярной онкологии 2022; 9(1): 48-56. Э01: 10.17650/2313-805Х-2022-9-1-48-56.
BY 4.0
3-Hydroxyquinazoline derivatives, analogues of erastin, induced ferroptosis in breast cancer cells
L.M. Borisova, V.N. Osipov, I.S. Golubeva, M.P. Kiseleva, A.A. Vartanyan
N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia
Contacts: Larisa Mikhailovna Borisova larib@inbox.ru
Introduction. Early malignant tumor detection programs have significantly increased the survival rate of breast cancer patients but the results of drug therapy for this pathology are not always highly effective. Recently discovered iron-dependent cell death, ferroptosis, makes it a promising therapeutic target to reduce the recurrence rates. Objective - to study the induction of ferroptosis in breast cancer cells MCF-7 by quinazoline derivatives synthesized at the Research Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors of the N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia and to evaluate its antitumor activity on transplanted breast carcinoma Ca-755.
Materials and methods. Derivatives of 3-hydroxyquinazoline were obtained by chemical synthesis and have a purity of at least 95 %. In this study 2D cultivation of MCF7 cells, phase-contrast and fluorescence microscopy, and a model
of experimental growth of breast carcinoma Ca-755 in female hybrids of immunocompetent mice F1 (C57BI/6 x DBA/2) were used.
Results. Five derivatives of 3-hydroxyquinazoline, analogues of erastine, were studied in this work. The ferroptotic cell death was identified by the level of lipid peroxidation at the concentrations of 1/3 and 1/5 IC. The level of lipid peroxidation induced by compound 3 was comparable with the activity of erastin in MCF7 cells at both 1/3 and 1/5 of IC50, the activity of the other four quinazoline derivatives was 50-70 % of the activity of erastin. In in vivo experiments at a dose of 30 mg/kg the antitumor efficacy of the compound 3 was higher than that of erastin at the same dose. Conclusion. The data obtained suggest that quinazoline derivative 3 might be considered as a promissisng antitumor agent to treat breast cancer.
Key words: 3-hydroxyquinazoline derivatives, ferroptosis, breast cancer, antitumor activity
For citation: Borisova L.M., Osipov V.N., Golubeva I.S. et al. 3-Hydroxyquinazoline derivatives, analogues of erastin, induced ferroptosis in breast cancer cells. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2022; 9(1): 48-56. (In Russ.). DOI: 10.17650/2313-805X-2022-9-1-48-56.
СЧ СЧ О СЧ
>-
(J
о
—I
о и z о
ОС <
ВВЕДЕНИЕ
Заболеваемость раком молочной железы (РМЖ) растет не только в России, но и во всем мире. Программы раннего выявления этой опухоли в сочетании с различными методами лечения заметно повысили продолжительность жизни больных с данной патологией [1]. Несмотря на существенное улучшение результатов химиотерапии в последние годы, в большинстве случаев лечение РМЖ сопровождается развитием лекарственной резистентности: опухолевые клетки приобретают устойчивость к апоптозу [2]. Достигнуть реактивации апоптоза в резистентных к терапии опухолевых клетках практически нереально. По всей видимости, нужно искать возможности вовлечения других типов программируемой гибели клетки в их элиминирование. В последние годы появляется все больше сообщений, в которых указывается, что обнаруженный недавно новый тип регулируемой гибели клетки — фер-роптоз [3] — способен вызывать гибель высокозлокачественных клеток, уцелевших после химиотерапии [4].
Ферроптоз сегодня рассматривается как железо-зависимая регулируемая гибель клетки, при которой в ней накапливаются продукты перекисного окисления фосфолипидов клеточных мембран [5]. Этот процесс происходит как в результате запуска реакции Фентона, вызывающего в присутствии железа окисление фосфолипидов, так и вследствие отказа механизмов антиоксидантной защиты клетки. Система антиокси-дантной защиты включает глутатионпероксидазу 4 ^РХ4), которая восстанавливает потенциально опасные гидроперекиси липидов в нетоксичные спирты, и глутатион (субстрат GPX4) — основной внутриклеточный антиоксидант [6, 7].
Недавно было показано, что клетки РМЖ репро-граммируют метаболизм железа, активируя экспрессию рецептора трансферрина (CD71) и подавляя экспрессию ферритина, депонирующего железо в клетки, а также ферропортина-1 ^Р^ — транспортного белка, выводящего железо из клетки [8, 9]. Ферритин на сегодняшний день рассматривается как маркер злокачественного поражения молочной железы [10]. Согласно последним данным, при повреждении клетки
по типу ферроптоза из нее высвобождаются так называемые молекулярные фрагменты, ассоциированные с повреждениями (damage-associated molecular patterns, DAMP), которые во внеклеточной среде выступают сильными провоспалительными факторами [11]. К их числу принадлежат ДНК, аденозинтрифосфат (АТФ), РНК, белки теплового шока, жирные кислоты, лейко-триены, простагландины, активирующие адаптивную иммунную систему и привлекающие к опухоли и метастазам иммунокомпетентные клетки.
Еще одним аргументом важности поиска соединений, индуцирующих ферроптоз в клетках РМЖ, стали опубликованные недавно данные о способности индукторов ферроптоза вызывать гибель клеток тройного негативного РМЖ [12]. Из-за отсутствия эффективной эндокринной и таргетной анти-HER2 (human epidermal growth factor receptor 2, рецептор эпидер-мального фактора роста, тип 2) терапии для пациентов с тройным негативным РМЖ характерны высокая частота развития рецидивов и плохой прогноз.
Ранее нами было показано, что производные 3-ги-дроксихиназолина обладают высокой цитотоксиче-ской активностью [13]: соединение OVN-002 — аналог эрастина — индуцировало ферроптоз в метастатических клетках меланомы [14], а серия производных 3-ги-дроксихиназолина — ферроптоз в клетках рака толстой кишки.
Цель исследования — изучение способности новых производных 3-гидроксихиназолина — аналогов эрастина — индуцировать ферроптоз в клетках РМЖ MCF7 и оценка их противоопухолевой активности на карциноме молочной железы Са-755 мышей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реактивы
C11-BODIPY получен от Thermо Fisher Scientific (США), эрастин был приобретен у Sigma-Aldrich (США).
Синтез производных хиназолина
Производные 3-гидроксихиназолина были синтезированы в Научно-исследовательском институте
о ж.
ю
< >
а
<
о
а.
в;
£
о ж.
и >
сч сч О сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж
ю
< >
а
<
о m
а. те
> m
О
ж.
U >
экспериментальной диагностики и терапии опухолей Национального медицинского исследовательского центра онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России.
Культивирование клеток
В работе были использованы клетки РМЖ MCF7 (ATCCR HTB-22™). Клетки культивировали в полной среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Gibco, США), содержащей 10 % телячью эмбриональную сыворотку (HyClone, США), 2,2 ммоль/мл глутамина («ПанЭко», Россия) и 0,01 мг/мл гентами-цина («ПанЭко», Россия). В экспериментах использовали клетки 70—75 % конфлюэнтности.
Исследование влияния производных in vitro
3-гидроксихиназолина на индукцию
ферроптоза
Клетки РМЖ MCF7 растили в полной среде DMEM в 24-луночном планшете. Через 24 ч роста клеток в СО2-инкубаторе при 37 °С добавляли 1/3 и 1/5 1С50 эрастина или 1/3 и 1/5 1С50 исследуемых соединений и инкубировали в течение 5 ч. В качестве контроля использовали клетки, растущие в полной среде DMEM без индуктора ферроптоза, и клетки, инкубированные с эквимолярным количеством ДМСО (ди-метилсульфоксида). Затем используемую среду заменяли свежей средой, не содержащей сыворотки, и добавляли 5 мкМ C11-BODIPY — флуорофор, который, переходя из тиоэфира в сульфоксид, меняет флуоресцентные характеристики (убывает поглощение красного цвета и нарастает поглощение зеленого). После инкубирования с флуоресцентной меткой в течение 30 мин клетки 3 раза промывали фосфатным буфером. Интенсивность флуоресценции определяли с помощью флуоресцентного микроскопа IN Cell Analyzer (GE Healthcare, США) при 510—550 нм.
Исследования in vivo
Животные. Исследования in vivo выполняли на самках мышей — гибридов F1 (C57Bl/6 х DBA/2) массой 20—22 г. Животных содержали в виварии при естественном освещении, на стандартном рационе питания и при свободном доступе к воде [15].
Опухолевая модель. Первичную оценку противоопухолевой активности исследуемого соединения (индуктора ферроптоза) проводили на перевиваемой карциноме молочной железы Са-755 мышей по ранее описанной методике с незначительными модификациями [16—17]. Штамм поддерживали подкожными перевивками каждые 12 дней на самках мышей линии C57Bl/6.
Схема опыта. Группы животных формировали с учетом получения статистически достоверных результатов. Контрольная группа состояла из 10 мышей, каждая из 4 опытных групп — из 6. Мышам 1-й и 2-й опытных групп вводили соединение 3 в дозах 30 мг/кг
и 50 мг/кг соответственно, мышам 3-й и 4-й опытных групп — эрастин в дозах 30 мг/кг и 50 мг/кг соответственно.
Схема введения. Действие исследуемого соединения 3 сравнивали с эффектом эрастина. Эрастин и соединение 3 вводили мышам внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 дней с интервалом в 24 ч. Начало времени введения — через 48 ч после трансплантации карциномы молочной железы Са-755.
Критерии оценки противоопухолевого эффекта
Противоопухолевый эффект соединений оценивали по торможению роста опухоли (ТРО) и увеличению продолжительности жизни (УПЖ) леченых мышей по сравнению с контрольными животными [17]. Наблюдение за мышами проводили до их гибели. Минимальные критерии активности — ТРО >50 %, УПЖ >25 %. Эффективными считали дозы, вызывающие ТРО >70 % продолжительностью не менее 7 дней после окончания лечения [17].
Полученные данные обрабатывали статистически с использованием компьютерной программы Statistica 6.0. Различия между сравниваемыми группами считали статистически достоверными прир <0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Синтез производных 3-гидроксихиназолина
Производные 3-гидроксихиназолина (замещенные 3-гидрокси-2-(3,5-диметил-1Н-пиразол-1-ил)-хиназолин-4(3Н)-оны) (рис. 1), в которых к атому кислорода в 3-м положении присоединены различные бензиловые эфиры уксусной кислоты, были синтезированы по ранее описанной методике [13, 14]. Полученные соединения охарактеризованы данными спектров спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 'Н и масс-спектрометрии. Чистота всех соединений по результатам высокоэффективной жидкостной хроматографии составила более 95 %. Характеристика синтезированных соединений 1—5 представлена в табл. 1. и на рис. 1. Подробную информацию об этих соединениях можно найти в дополнительном материале к статье в приложении к журналу «Успехи молекулярной онкологии»: https://umo.abvpress.ru/jour/ issue/archive.
R
O O
R
R
Рис. 1. Общая структура производных 3-гидроксихиназолина Fig. 1. General structure of 3-hydroxyquinazoline derivatives
Таблица 1. Характеристика синтезированных соединений 1—5 Table 1. Characteristics of synthesized compounds 1—5
Соединение Заместители Молекулярная масса Масса молекулярного иона в масс-спектре (вид иона) Спектр ЯМР 1H
Compo-- R2 R3 R4 Molecular The weight of a molecular ion in the mass spectrum (type of ion) NMR Щ spectrum
1 OMe OMe H H 464,48 465,2 (M + H)+ 7,49 (с, 1H), 7,30-7,44 (м, 5H), 7,20 (с, 1H), 6,13 (с, 1H), 5,14 (d, J = 16,9 Гц, 4H), 3,92 (д, J = 1,2 Гц, 6H), 2,39 (с, 3H), 2,09 (с, 3H)
2 OMe OMe F H 482,47 483,2 (M + H)+ 7,37-7,51 (м, 3H), 7,16-7,30 (м, 3H), 6,11 (с, 1H), 5,22 (с, 2H), 5,11 (с, 2H), 3,88-3,95 (м, 7H), 2,39 (с, 3H), 2,09 (с, 3H)
3 H Br H H 483,33 483,2 (M + H)+ 8,26 (д, J = 2,3 Гц, 1H), 8,04 (дд, J = 8,7; 2,4 Гц, 1H), 7,65 (д, J = 8,7 Гц, 1H), 7,34-7,49 (м, 4H), 6,16 (с, 1H), 5,16 (д, J = 6,9 Гц, 4H), 2,41 (с, 3H), 2,09 (с, 3H)
4 H H H OMe 434,46 435,2 (M + H)+ 8,14-8,23 (м, 1H), 7,90 (ддд, J = 8,5; 7,2; 1,6, 1H), 7,71 (дт, J = 8,1; 0,9 Гц, 1H), 7,62 (ддд, J = 8,2; 7,2; 1,2 Гц, 1H), 7,25-7,37 (м, 2H), 6,87-6,98 (м, 2H), 6,15 (д, J = 1,1 Гц, 1H), 5,10 (д, J = 1,4 Гц, 4H), 3,75 (с, 3H), 2,41 (д, J = 0,8 Гц, 3H), 2,10 (с, 3H)
5 H Br H Cl 517,0 517,2 (M + H)+, 539,1 (M + Na)+ 8,26 (д, J = 2,3 Гц, 1H), 8,04 (дд, J = 8,7, 2,4 Гц, 1H), 7,65 (д, J = 8,7 Гц, 1H), 7,34-7,51 (м, 4H), 6,16 (с, 1H), 5,16 (д, J = 7,2 Гц, 4H), 2,38-2,44 (с, 3H), 2,09 (с, 3H)
СЧ СЧ
о
сч
>-
(J
о
-J
о и z о
ОС <
о ж
to ш и
Z <
>
а
<
Примечание. ЯМР — ядерный магнитный резонанс. Note. NMR — nuclear magnetic resonance.
О
a.
в;
£
о ж.
и >
Исследование влияния соединений 1—5, производных 3-гидрохиназолина, на индукцию ферроптоза in vitro
Цитотоксичность соединений на клетках MCF7 изучали с помощью МТТ-теста. Антипролифератив-ную активность препаратов оценивали по величине IC50 При инкубировании клеток MCF7 с соединениями в диапазоне концентраций от 1 до 100 мкМ в течение 24 ч наблюдалось ингибирование роста клеток на 30—80 %. Выбранное нами время инкубирования клеток с аналогами эрастина в течение 24 ч для определения IC50 согласуется с литературными данными [6]. Значения 1С50 соединений представлены в табл. 2. Для верификации полученных результатов мы определяли также 1С50 для доксорубицина (DOX). Наибольшей цитотоксической активностью обладало соединение 3.
Ранее нами было показано, что инкубирование клеток меланомы и рака толстой кишки с производными гидроксихиназолина — аналогами эрастина — в течение 24 ч при 37 оС не вызывает фрагментации ядра, что является итогом апоптоза, генетически программируемой клеточной гибели I типа. Также на гибель клеток, индуцированную производными гидро-ксихиназолина, не оказывало влияния присутствие
Таблица 2. Результаты определения цитотоксической активности производных 3-гидроксихиназолина, эрастина и доксорубицина на клетках рака молочной железы MCF7
Table 2. Results of determination of cytotoxic activity of 3-hydroxyquinazoline derivatives, erastin and doxorubicin on breast cancer cells MCF7
Исследуемые образцы IC50, мкМ
Tested samples щц
Эрастин 40
Соединение 1 20
Соединение 2 24
Соединение 3 19
Соединение 4 48
Соединение 5 22
Доксорубицин 2,1
50 мкМ панкаспазного ингибитора апоптоза zVAD-fmk или 20 мкМ ингибитора аутофагии хлорокина. Для исключения индукции других типов гибели клетки в MCF7-клетках соединениями 1—5 мы исследовали индукцию ими ферроптоза при 1/3 и 1/5 1С50. В качестве контроля использовали эрастин также при
сч сч О сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж
ю
< >
а
<
о m
а. те
> m
1/3 и 1/5 1С50. О гибели клеток MCF7 по типу ферроптоза судили по интенсивности перекисного окисления липидов, которое фиксировали после инкубирования клеток с флуоресцентной меткой C11-BODIPY (581/591 нм). В контрольных экспериментах без добавления соединений уровень перекисного окисления липидов был незначительным (рис. 2, а).
Уровень перекисного окисления липидов, индуцированного 1/ 3 1С50 соединения 3, был сравним с уровнем перекисного окисления липидов, индуцированного 1/3 1С50 эрастина (рис. 2, б, в). Уровень пе-рекисного окисления липидов, индуцированного остальными 4 соединениями при 1/3 1С , составил 50—70 % уровня перекисного окисления липидов, индуцированного 1/3 1С50 эрастина (рис. 2, г). В клетках, инкубированных с эквимолярным количеством ДМСО, интенсивность флуоресценции была невысокой и равнялась значениям интенсивности флуоресценции
контрольных клеток. Уровень перекисного окисления липидов, индуцированного эрастином или соединениями 1—5 при 1/ 5 1С , менялся незначительно по сравнению с уровнем этого показателя при 1 /3 1С50. Интенсивность флуоресценции C11-BODIPY при 1/5 1С50 была также наибольшей для соединения 3 (см. рис. 2г). Чувствительность клеток РМЖ MCF7 к действию соединения 3 позволила инициировать исследование его противоопухолевой активности на модели перевиваемой карциномы молочной железы мышей.
Исследование влияния соединения 3 на индукцию
ферроптоза in vivo
Ранее мы подобрали оптимальные условия растворения эрастина: ДМСО в сочетании с 0,05 М фосфатным буфером (рН 4,5) или 25 % раствором коллидона. Соединение 3 плохо растворялось в этой системе
о Ж.
U >
ф о
8.1
о .5
t g _п У
о
m 3
s
I
<и
3000
2000
1000
с о
о t
£ с
К / C К1 / C1 A1 A2 A3 A4 A5
К2 / C2 В1
В2
В3 В4
В5
Рис. 2. Гибель клеток MCF7по типу ферроптоза, индуцированная соединениями 1—5. Флуоресценция C11-BODIPYв клетках MCF7: а — контроль с 5 %-ным диметилсульфоксидом; б — инкубация клеток MCF7с 1/3 IC5g соединения 3; в — инкубация клеток MCF7с 1/5IC5g эрастина; г — уровень перекисного окисления липидов, индуцированного соединениями 1—5 при 1/3 IC5g(А1—А5) и 1/5 IC5g (В1—В5). у-200. p <0,05 для всех опытных групп по сравнению с контролем. К — контроль (без добавления соединений или эрастина); К1 и К2 — перекисное окисление липидов, индуцированное 1/3IC50 и 1/5 IC5g эрастина; А1 — 1/3 IC5g соединения 1; А2 — 1/3IC50 соединения 2; A3 — 1/3 IC5g соединения 3; А4—1/3IC50 соединения 4; А5 — 1/3 IC5g соединения 5; В1 — 1/5 IC5g соединения 1; В2 — 1/5IC50 соединения 2; В3 — 1/5IC50 соединения 3; В4 — 1/5IC50 соединения 4; В5 — 1/5 IC50 соединения 5
Fig. 2. MCF7 cell death by ferroptosis type induced by compounds 1—5. Fluorescence of C11-BODIPY in MCF7 cells: а — control with 5 % dimethyl sulfoxide; б — growth of MCF7 cells with 1/3IC50 of the 3 compound; в — growth of cells with 1/5IC50 of erastin; г — the level of lipid peroxidation induced by compounds 1—5: 1/3IC50 (A1—A5) and 1/5IC50 (B1—B5). у200. p <0.05 for all groups compared to control. C — control (without adding compounds or erastin); C1 and C2 — lipid peroxidation induced by 1/3IC50 and 1/5 IC5g of erastin; A1 — 1/3IC50 connection 1; A2 — 1/3IC50 connection 2; A3 — 1/3IC50 connection 3; A4 — 1/3IC50 connection 4; A5 — 1/3IC50 connection 5; B1 — 1/5IC50 connection 1; B2 — 1/5IC50 connection 2; B3 — 1/5IC50 connection 3; B4 — 1/5 IC5g connection 4; B5 — 1/5IC50 connection 5
г
0
Таблица 3. Сравнение противоопухолевой активности соединения 3 и эрастина (при его внутрибрюшинном введении) на Са-755у мышей Table 3. Comparison of antitumor activity of 3 compound and erastin (with its intraperitoneal administration) on Ca-755 mice
Группа Group Соединение, доза (мг/кг)/интервал (час) х число введений отроипямвитщвя Торможение роста опухоли, % Гибель от токсичности, n/n tDfn
1-й день после лечения 4-й день после лечения 8-й день после лечения 12-й день после лечения 16-й день после лечения 20-й день после лечения 24-й день после лечения
1st day after treatment 8th day after treatment 12th day after treatment 16th day after treatment 20th day after treatment 24th day after treatment
1 Соединение 3, 30/24 х 5 74*Л 87*л 3 compound, 30/24 х 5 85*л 96*Л 63*л 60*Л 0/6
2 Соединение 3, 50/24 х 5 7рЛ 86*л 85*л 3 compound, 50/24 х 5 66*л 96*л 93*л 86*л 0/6
3 Эрастин, 30/24 х 5 69*л 60*л 8]*л 3 Erastin, 30/24 х 5 62 60 81 71*л 74*л 78*л 76*л 0/6
4 Эрастин, 50/24 х 5 8]*л 92*л 92*л 4 Erastin, 50/24 х 5 81 92 92 92*л 87*л 79*л 63*л 0/6
*p <0,05;различия достоверны по отношению к контролю. >0,05;различия недостоверны между 1-й и 3-й, 2-й и 4-й группами.
*p <0,05; differences are significant in relation to control. Лр >0,05; differences are insignificant between groups 1 and3, 2 and 4.
СЧ СЧ
о
СЧ
>-
(J
о
-J
о и z о
ОС <
о ж
to
LU
и
z <
>
a
<
à a
60
50
40
30
20
10
Контроль / Соединение 3, 30 мг/кг / Соединение 3, 50 мг/кг / Эрастин, 30 мк/кг / Control Compound 3,30 mg/kg Compound 3,50 mg/kg Erastin, 30 mg/kg
Эрастин, 50 мк/кг / Erastin, 50 mg/kg
Рис. 3. Сравнение продолжительности жизни мышей с перевитой карциномой молочной железы Ca-755 в группе лечения соединением 3, эрасти-ном и в группе контроля. *p <0,05по отношению к контролю. **p >0,05между группами
Fig. 3. Comparison of the life expectancy of mice with transplanted breast carcinoma Ca-755in the treatment group with compound 3, erastin and in the control group. *p <0,05 versus control. **p >0,05 between groups
растворителей. Нам удалось повысить его растворимость следующим образом: субстанцию растворяли в ДМСО, далее добавляли кремофор, а затем воду для инъекций (до достижения необходимой конечной концентрации соединения 2,5 мг/ мл и содержания ДМСО не более 10 %). В процессе растворения раствор подогревали на водяной бане до 60 оС для лучшей растворимости соединения. По этой же схеме растворяли и эрастин.
В дозе 30 мг/кг как соединение 3, так и эрастин оказали длительный высокий противоопухолевый эффект при карциноме молочной железы Са-755 (табл. 3), но без значительного УПЖ животных, которая составила 9 и 22 % соответственно (рис. 3).
При лечении опухоли соединением 3 максимальный противоопухолевый эффект (ТРО 87—96 %; р <0,05 по отношению к контролю) отмечался до 16-го дня наблюдения. Противоопухолевый эффект эрастина
о m
а.
в;
m
о ж.
и >
0
сч сч О сч
>-
и о
-J
о и Z
о
ОС <
о ж
ю
< >
а
<
о
а. те
>
О
ж.
и >
при использовании той же дозы был недостоверно ниже в эти же сроки наблюдения: ТРО 64—74 % (p <0,05 по отношению к контролю;p >0,05 между группами). Далее до 24-го дня после окончания лечения эффект эрастина был недостоверно выше эффекта соединения 3: ТРО 76—78 и 60—63 % соответственно (p <0,05 по отношению к контролю; p >0,05 между 1-й и 3-й опытными группами) (см. табл. 3).
При увеличении дозы соединения 3 до 50 мг/кг высокий противоопухолевый эффект на уровне ТРО от 71—85 до 86—96 % отмечали в более продолжительный период: до 24-го дня после окончания лечения (p >0,05 между 1-й и 2-й опытными группами).
В дозе 50 мг/кг противоопухолевая активность соединения 3 была недостоверно ниже активности эра-стина в той же дозе: ТРО 71—85 и 81—92 % соответственно, с 1-го по 8-й день после окончания лечения (p >0,05 между 2-й и 4-й опытными группами). Однако далее, с 16-го до 24-го дня наблюдения, активность соединения 3 превзошла активность эрастина: ТРО 86—96 и 63—87 % соответственно (p <0,05 между 2-й и 4-й опытными группами).
Применение соединения 3 в дозе 50 мг/кг увеличивало продолжительность жизни животных на 36 % (см. рис. 3), что выше минимального критерия активности (УПЖ >25 %), тогда как эрастин не показал эффективности по этому критерию (УПЖ — 11 %) (p <0,05 по отношению к контролю;p >0,05 между всеми опытными группами).
ОБСУЖДЕНИЕ
Рак молочной железы встречается у женщин любого возраста после достижения половой зрелости. Программы раннего выявления этой опухоли заметно повысили выживаемость больных, однако итоги лекарственной терапии данной патологии не всегда эффективны. В большинстве случаев лечение РМЖ сопровождается развитием лекарственной резистентности, что переводит болезнь в терминальную, более агрессивную фазу роста [18]. Утрата программы клеточной гибели дает возможность опухолевой клетке сохранять жизнеспособность в присутствии высоких концентраций противоопухолевых лекарств. По всей видимости, нужно искать новые методы лечения, направленные на запуск альтернативных типов клеточной смерти.
Интерес к исследованиям, посвященным изучению возможности использования ферроптоза в терапии рака, в последние годы заметно возрос. Кроме эрастина, блокирующего транспорт цистина в клетку, синтезированы и охарактеризованы и другие индукторы ферроптоза, вызывающие истощение GPX4 в опухолевых клетках, например RSL3 (RAS-selective lethal 3) [19]. И те, и другие индукторы ферроптоза малорастворимы в воде, нестабильны, плохо проникают через плазматическую мембрану. Показана также их высокая токсичность для нормальных клеток [20, 21].
Эрастин — классический индуктор ферроптоза — был синтезирован в 2012 г. в лаборатории Брента Стоквелла. В его молекуле содержится структурный фрагмент хиназолина, который, очевидно, важен для индукции ферроптоза. Мы синтезировали аналоги эрастина с модифицированной структурой с заменой заместителей во 2-м и 3-м положениях хиназо-линового цикла. Предполагалось, что такая замена приведет к усилению активности данных соединений по сравнению с эрастином и улучшит их растворимость.
Исследование in vitro способности соединений 1—5, производных 3-гидроксихиназолина, индуцировать ферроптоз в клетках MCF7 показало, что активность соединения 3 была сравнима с эффектом эрастина. Эти результаты подтверждены на экспериментальной модели карциномы молочной железы Са-755 мышей. Соединение 3 показало высокий продолжительный противоопухолевый эффект в дозах 30 и 50 мг/кг при внутрибрюшинном ежедневном введении в течение 5 дней. При использовании этого соединения в дозе 50 мг/кг продолжительность жизни животных увеличилась на 36 % по сравнению с применением эрастина (УПЖ - 11 %;p <0,05).
Полученные недавно данные о репрограммирова-нии метаболизма железа опухолевыми клетками чрезвычайно важны [22]. Стремительный рост опухоли требует намного большего расхода железа, чем метаболизм нормальных клеток. Одной из причин такого активного поглощения железа опухолевыми клетками является необходимость этого элемента для биосинтеза ДНК [23]. Железо также входит в состав дыхательных ферментов в качестве кофактора (при его недостатке ткани не могут усваивать кислород) [24] и участвует в генерации биологической энергии в живых организмах [25]. Можно предположить, что ферроптоз возникает из-за дисбаланса клеточных метаболических процессов (например, метаболизма липидов и кратковременного повышения уровня железа).
Следует отметить, что активация ферроптоза представляет собой энергетически менее затратную систему гибели клетки в отличие от апоптоза и других форм программированной гибели клеток. Индукция фер-роптоза не требует процессинга эффекторов смерти, например, каспаз или газдерминов. Несмотря на несомненную перспективность активации ферроптоза в опухолевых клетках, к настоящему времени в клинической практике нет препарата, индуцирующего его. Полученные нами данные об индукции гибели клеток РМЖ и первичная оценка противоопухолевой активности аналога эрастина - соединения 3 - могут служить основанием для продолжения поиска индукторов ферроптоза в этом классе соединений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В процессе химиотерапии не всегда удается убить все опухолевые клетки. Оставшаяся клеточная попу-
ляция приобретает новые мутации, что делает опухоль нечувствительной к предыдущему лечению. Опубликованные недавно данные о способности индукторов ферроптоза вызывать гибель резистентных к терапии опухолевых клеток привели нас к поиску низкомолекулярных активаторов ферроптоза. Мы основывались на результатах исследования блокирования апоптоза хелаторами железа [26] и соединениями, ингибирую-щими ферроптоз [27]. Так, кардиотоксичность доксо-рубицина в клинической практике сегодня снижают соединениями, которые нейтрализуют ионы железа
или предотвращают образование радикалов кислорода [28].
Проведенные нами исследования показали, что производные 3-гидроксихиназолина индуцируют в MCF7-клетках ферроптоз, сравнимый с активностью эрастина. Соединение 3 оказывает более выраженный эффект на рост экспериментальной опухоли Са-755 по сравнению с эрастином. Полученные предварительные результаты демонстрируют перспективность дальнейшего поиска потенциальных индукторов ферроптоза.
сч сч о сч
>-
из о
—I
о и Z
о
ОС <
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
о ж
1. Harbeck N., Gnant M. Breast cancer. Lancet 2017;389(10074):1134-50. DOI: 10.1016/S0140-6736(16)31891-8.
2. Waks A.G., Winer E.P. Breast cancer treatment: a review. JAMA 2019;321(3): 288-300.
DOI: 10.1001/jama.2018.19323.
3. Dixon S.J., Lemberg K.M., Lamprecht M.R. et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell 2012;149(5):1060-72.
DOI: 10.1016/j.cell.2012.03.042.
4. Viswanathan V.S., Ryan M.J., Dhruv H.D. et al. Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway. Nature 2017;547(7664):453-7. DOI: 10.1038/nature23007.
5. Li J., Cao F., Yin H.L., Huang Z.J. et al. Ferroptosis: past, present and future. Cell Death Dis 2020;11(2):88.
DOI: 10.1038/s41419-020-2298-2.
6. Yang W.S., Stockwell B.R. Ferroptosis: death by lipid peroxidation. Trends Cell Biol 2016;26(3):165-76.
DOI: 10.1016/j.tcb.2015.10.014.
7. Gaschler M.M., Stockwell B.R. Lipid peroxidation in cell death. Biochem Biophys Res Commun 2017;482(3):419-25. DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.10.086.
8. Marques O., da Silva B.M., Porto G. Iron homeostasis in breast cancer. Cancer Lett 2014;347(1):1-14.
DOI: 10.1016/j.canlet.2014.01.029.
9. Chang V.C., Cotterchio M., Khoo E. Iron intake, body iron status, and risk of breast cancer: a systemic review and meta-analysis. BMC Cancer 2019;19(1):543-8. DOI: 10.1186/s12885-019-5642-0.
10. Bitonto V., Alberti D., Ruiu R. et al. L-ferritin: a theranostic agent of natural origin for MRI visualization and treatment of breast cancer. J Control Release 2020;319:300-10. DOI: 10.1016/j. jconrel.2019.12.051.
11. Tang R., Xu J., Zhang B. et al. Ferroptosis, necroptosis, and pyroptosis in anticancer immunity. J Hematol Oncol 2020;13(1):110-6.
DOI: 10.1186/s13045-020-00946-7.
12. Yu M., Gai C., Li Z. et al. Targeted exosome-encapsulated erastin induced ferroptosis in triple negative breast cancer cells. Cancer Sci 2019;110(10):3173-82. DOI: 10.1111/cas.14181.
13. Неганова М.Е., Александрова Ю.Р., Пухов С.А. и др. Механизмы цитоток-сического действия ряда циклических гидроксамовых кислот. Биомедицинская химия 2020;66(4):332-8. [Negano-va M.E., Alexandrova Y.R., Pukhov S.A. et al. Mechanisms of cytotoxic action
of a number of cyclic hydroxamic acids. Biomedicinskaya himiya = Biomedical Chemistry 2020;66(4):332-8. (In Russ.)]. DOI: 10.18097/PBMC20206604332.
14. Борисова Л.М., Осипов В.Н., Гусев Д.В. и др. Производное 3-гидроксихиназо-лина, аналог эрастина, индуцирует ферроптоз в метастатических клетках меланомы. Российский биотерапевтический журнал 2021;20(1):67-73. [Borisova L.M., Osipov V.N., Gusev D.V. et al. A derivative of 3 hydroxyquinazoline, an analogue of erastin, induces apoptosis in metastatic melanoma cells. Rossijskij bioterapevticheskij zhurnal = Russian Biotherapeutic Journal 2021;20(1):67-73. (In Russ.)]. DOI: 10.17650/1726-97842021-20-1-67-73.
15. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных.
8-е изд. Пер. с англ. Под ред. И.В. Бе-лозерцевой, Д.В. Блинова, М.С. Кра-сильщиковой. M.: ИРБИС, 2017. 336 c. [Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. Translated from English. Ed. by I.V. Belozertseva, D.V. Blinov, M.S. Krasilschikova. Moscow: IRBIS, 2017. 336 р. (In Russ.)].
16. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР
и США. Под ред. З.П. Софьина, А.Б. Сыркина, A. Голдина, И. Кляйн. М.: Медицина, 1980. 296 c. [Experimental evaluation ofantitumor drugsin the USSR and the USA. Ed. by Z.P. Sofina, A.B. Syrkin, A. Goldin, A. Klein. Moscow: Medicine, 1980. 296 p. (In Russ.)].
17. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. М.: Гриф и К., 2012. С. 642-657. [Treschalina E.M., Zhukova O.S., Gerasimova G.K. et al. Methodical recommendations for the preclinical study of the antitumor activity of drugs. In: Guidelines for conducting preclinical studies of drugs. Part 1. Moscow: Grif and K., 2012. Pp. 642-57. (In Russ.)].
18. Ji X., Lu Y., Tian H. et al. Chemoresistance mechanisms of breast cancer and their countermeasures. Biomed Pharmacother 2019;114:108800.
DOI: 10.1016/j.biopha.2019.108800.
19. Weiwer M., Bittker J.A., Lewis T.A. et al. Development of small-molecule probes that selectively kill cells induced to express mutant RAS. Bioorg Med Chem Lett 2012;22(4):1822-6.
DOI: 10.1016/j.bmcl.2011.09.047.
20. Lee H., Zandkarimi F., Zhang Y.et al. Energy-stress-mediated AMPK activation inhibits ferroptosis. Nat Cell Biol 2020;22(2):225-34.
DOI: 10.1038/s41556-020-0461-8.
21. Shibata Y., Yasui H., Higashikawa K. Erastin, a ferroptosis-inducing agent, sensitized cancer cells to X-ray irradiation via glutathione starvation in vitro
and in vivo. PLoS One 2019;14(12): e0225931. DOI: 10.1371/journal.pone. 0225931.
22. Hecht F., Pessoa C.F., Gentile L.B. et al. The role of oxidative stress on breast cancer development and therapy. Tumour Biol 2016;37(4):4281-91.
DOI: 10.1007/s13277-016-4873-9.
23. Zhang D.L., Ghosh M.C., Rouault T.A. The physiological functions of iron regulatory proteins in iron homeostasis - an update. Front Pharmacol 2014;5:124-9.
DOI: 10.3389/fphar.2014.00124.
to
< >
a
<
о m
a.
в;
Ii
m
о ж.
и >
РУБРИКА
ТОМ 9 / VOL. 9
56
сч сч О сч
>-
и о
-J
о
и
24. Kleingardner J.G., Bren K.L. Biological significance and applications of heme proteins and peptides. Acc Chem Res 2015;48(7):1845-52.
DOI: 10.1021/acs.accounts.5b00106.
25. Orth M., Schapira A.H. Mitochondria and degenerative disorders. Am J Med Genet 2001;106(1):27-36. DOI: 10.1002/ajmg.1425.
26. Doroshow J.H. Prevention of doxorubicin-induced killing of MCF-7 human breast cancer cells by oxygen radical scavengers and iron chelating agents. Biochem Biophys Res Commun 1986;135(1):330-5. DOI: 10.1016/0006-291x(86)90981-2.
27. Buranrat B., Connor J.R. Cytoprotective effects of ferritin on doxorubicin induced
breast cancer cell death. Oncol Rep 2015;34(5):2790-6. DOI: 10.3892/or.2015.4250. 28. Gammella E., Maccarinelli F., Buratti P. et al. The role of iron in anthracycline cardiotoxicity. Front Pharmacol 2014;5:25-9.
DOI: 10.3389/fphar.2014.00025.
О
ОС <
о Ж
to
< >
а
<
Вклад авторов
В.Н. Осипов: синтез, очистка и характеристика производных 3-гидроксихиназолина, редактирование текста статьи;
Л.М. Борисова: разработка плана эксперимента in vivo, обработка и анализ результатов исследования in vivo, написание текста статьи, редактирование статьи;
И.С. Голубева, М.П. Киселева: проведение эксперимента in vivo; Д.А. Хоченков: подготовка иллюстрационного материала;
А.А. Вартанян: разработка дизайна исследования, тестирование in vitro эрастина и производных 3-гидроксихиназолина, написание текста статьи.
Authors contributions:
V.N. Osipov: synthesis, purification and characterization of 3-hydroxyquinazoline derivatives, article editing;
L.M. Borisova: development of an in vivo experiment plan, processing and analysis of in vivo research results, article editing, article writing; I.S. Golubeva, M.P. Kiseleva: conducting an in vivo experiment; D.A. Khochenkov: preparation of illustrative material;
A.A. Vartanyan: study design development, in vitro testing of erastin and 3-hydroxyquinazoline derivatives, article writing.
О
ORCID авторов / ORCID of authors
Л.М. Борисова / L.M. Borisova: https://orcid.org/0000-0003-4613-4584 В.Н. Осипов / V.N. Osipov: https://orcid.org/0000-0001-7726-4467 И.С. Голубева / I.S. Golubeva: https://orcid.org/0000-0002-7263-7444 М.П. Киселева / M.P. Kiseleva: https://orcid.org/0000-0002-4309-6722 Д.А. Хоченков / D.A. Khochenkov: https://orcid.org/0000-0002-5694-3492 А.А. Вартанян / A.A. Vartanyan: https://orcid.org/0000 0001 9342 5523
>
О
ж.
U >
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Исследование проведено в рамках государственного задания по теме «Разработка подходов к созданию противоопухолевых агентов на основе соединений — потенциальных индукторов ферроптоза» (№ АААА-А19-119021890101-1, 2019-2021 гг.). Financing. The study was performed in the framework research work No. АААА-А19-119021890101-1 "Development of approaches for search of antitumor agents based on potential inducers of ferroptosis" (2019—2021).
Соблюдение правил биоэтики. Протокол исследования одобрен комитетом по биомедицинской этике ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Исследование выполнено в соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей.
Compliance with the rules of bioethics. The study protocol was approved by the biomedical ethics committee of N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health of Russia. The study was performed in accordance with the ethical standards for the treatment of animals adopted by the European Convention for the protection of vertebrates used for research and other scientific purposes.
Статья поступила: 22.06.2021. Принята к публикации: 13.01.2022. Article submitted: 22.06.2021. Accepted for publication: 13.01.2022.
