Прогнозирование вероятности гиперкоагуляционного состояния во время беременности путем анализа генетического статуса женщин с привычным невынашиванием беременности Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

УДК 616.151.511-07:618.3 ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ВЕРОЯТНОСТИ ГИПЕРКОАГУЛЯЦИОННОГО СОСТОЯНИЯ ВО ВРЕМЯ БЕРЕМЕННОСТИ ПУТЕМ АНАЛИЗА ГЕНЕТИЧЕСКОГО СТАТУСА

ЖЕНЩИН С ПРИВЫЧНЫМ НЕВЫНАШИВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ

Гриневич Т. Н. (tgnnevich@yandex.by), Ляликов С. А. (lalikov@tut.by), Степуро Т. Л. (mikhno_t@yahoo.com) УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь

Наличие наследственной тромбофилии сопряжено с повышенным риском развития осложнений беременности, в том числе привычным невынашиванием. Большинство видов тромбофилий характеризуются гиперкоагуляционным состоянием, являющимся основой механизма развития тромбогенных гестационных осложнений.

Целью исследования являлась разработка способа прогнозирования вероятности гиперкоагуляционного состояния во время беременности путем анализа генетического статуса женщин.

Материал и методы. На полиморфизмы, ассоциированные с невынашиванием, обследовано 117 женщин. Интегральную оценку системы гемостаза проводили с помощью системы ротационной тромбоэластоме-трии.

Результаты. Генетические маркеры тромбофилий встречаются с одинаковой частотой как у женщин с привычным невынашиванием, так и у женщин с реализованной репродуктивной функцией. Поэтому для оценки комбинации генов и количества, одновременно выявленных мутаций с помощью дискриминантного анализа нами была построена модель прогнозирования развития гиперкоагуляционного состояния во время беременности.

Выводы. 1. Предложенная модель позволяет с чувствительностью 75,0%, специфичностью 85,7% прогнозировать возникновение гиперкоагуляционного состояния во время беременности. 2. Использование данной модели даст возможность формировать группу женщин высокого риска по развитию тромбогенных геста-ционных осложнений для своевременной диагностики и коррекции выявленных нарушений во время беременности.

Ключевые слова: привычное невынашивание беременности, тромбофилия, гиперкоагуляция.

Тромбофилия (от гр. thrombos — ком, сгусток, рЫ1ео — люблю) - состояние, характеризующееся чрезмерной (неадекватной) коагуляцией крови и тромбообразованием, ведущими к ишемии тканей и органов. Наличие наследственной тромбофилии сопряжено с повышенным риском развития осложнений беременности, в том числе с привычным невынашиванием беременности (ПНБ) [4]. На данный момент исследован аллельный полиморфизм более 90 генов, относящихся к генной сети патологии беременности. Наибольший интерес представляет изучение полиморфизмов генов гемостаза (БУ, FП, FXШ, FGB), генов, влияющих на фолатный статус (MTHFR), генов, принимающих участие в процессах имплантации и плацентации (РА1-1) и генов тромбоцитарных рецепторов ^РШа) [2].

Результаты исследований роли наследственной тромбофилии в проблеме привычного невынашивания беременности крайне противоречивы. Эти противоречия могут являться следствием популяционной специфичности или некорректного выбора обследуемых, малым объемом исследований, отсутствием учета так называемых «ген-генных взаимодействий» - неблагоприятных сочетаний аллельных вариантов разных генов. Кроме того, необходимо учитывать тот факт, что носительство полиморфных вариантов разных генов вносит неодинаковый вклад в формирование осложнений беременности, отличающийся как по направленности действия (протективное или негативное), так и по

его выраженности. Соответственно, при оценке риска развития осложнений беременности необходимо включать в анализ гены, имеющие разнонаправленный эффект (как промоторный, так и протективный) и учитывать функциональную значимость (направление действия, степень его проявления) каждой из аллелей исследуемых генов. Следует отметить, что, несмотря на стремительно увеличивающиеся возможности ДНК-тестирования, до настоящего времени отсутствуют четкие алгоритмы анализа результатов генетического обследования для оценки риска акушерских осложнений беременности у женщин с ПНБ.

Большинство видов тромбофилий, в том числе и наследственных, характеризуются повышением свертываемости крови, т.е. гиперкоагуляционным состоянием. Уже с самых ранних сроков физиологическая беременность сама по себе является тромбофилическим состоянием, при котором уже в 5-6 раз повышается риск венозных тромбозов. Наследственные тром-бофилические дефекты гемостаза усугубляют физиологическую гиперкоагуляцию во время беременности и нередко активизируют процессы внутрисосудистого тромбогенеза с последующим неблагоприятным исходом беременности [5]. В настоящее время единственным глобальным коагулогическим методом, позволяющим диагностировать большинство нарушений гемостаза, в том числе при наследственных тромбо-филиях, является ротационная тромбоэластоме-трия (ROTEM, Pentapharm GmbH), позволяющая

комплексно оценить различные дефекты свертывания крови, а также выявить гипо- и гипер-коагуляционное состояния [1]. Оценка системы гемостаза методом ротационной тромбоэласто-метрии совместно с анализом разных вариантов аллельных генов, ассоциированных с невынашиванием, позволит оценить их вклад в развитие гиперкоагуляционного состояния.

Целью настоящего исследования являлась разработка способа прогнозирования вероятности гиперкоагуляционного состояния во время беременности путем анализа генетического статуса женщин с привычным невынашиванием беременности, что позволит формировать группы риска и осуществлять продуктивную преграви-дарную подготовку с последующим проведением своевременной коррекции нарушений, выявленных во время беременности.

Материалы и методы

Исследование проводилось на базе УЗ «ГК БСМП» г. Гродно. Обследованы 117 женщин с привычным невынашиванием беременности. Возраст наблюдаемых женщин составил от 22 до 46 лет, медиана (Ме) - 30,0 лет, нижняя квартиль ^25) - 26,0, верхняя квартиль ^75) - 32,0 года. В процессе работы сформировались две исследовательские группы: I группа - 50 небеременных пациенток с привычным невынашиванием беременности, Ме - 30 лет, Q25 - 22 лет, Q75

- 43 лет, II группа - 67 беременных с привычным невынашиванием беременности в анамнезе, Ме

- 30,2 лет, Q25 - 22 лет, Q75 - 46.

Критериями включения были привычное невынашивание беременности, т.е. наличие в анамнезе женщины подряд трех и более самопроизвольных прерываний беременности в сроках до 22 недель, и наличие информированного согласия на проведение исследования. Критерием невключения были отказ от участия в исследовании, наличие в течение двух недель, предшествующих обследованию, острых или обострения хронических заболеваний, анатомических дефектов матки, эндокринных нарушений. Клиническое обследование включало детальное изучение соматического анамнеза, акушерско-гине-кологического анамнеза (характер становления и нарушения менструальной функции, репродуктивная функция), семейного и тромботиче-ского анамнеза.

Контрольную группу составили 34 женщины с двумя и более физиологическими родами в анамнезе, не имеющие клинических проявлений повышенного тромбообразования. У женщин этой группы были известны благоприятный акушерский анамнез, отсутствие самопроизвольных выкидышей и других акушерских осложнений. Возраст женщин контрольной группы составил от 24 до 48 лет, медиана (Ме) - 37,2 года, нижняя квартиль ^25) - 28,0 лет, верхняя квартиль ^75) - 42,0 года.

Молекулярно-биологическое обследование заключалось в выявлении полиморфизмов генов: коагуляционного фактора V (Лейденская мутация) Arg506Gln, протромбина (коагуляционный

фактор II) G20210A, метилентетрагидрофола-тредуктазы (MTHFR) - полиморфизмы C677T и А1298С, ингибитора активатора плазминогена I типа (PAI-1) 675 4G/5G, коагуляционного фактора XIII (F13A1) Val35Leu, фибриногена (бета FGB) 455G-A, альфа-субъединицы тромбоци-тарного гликопротеина 1b, (GPIba) Thr145Met с помощью метода ПЦР.

Геномную ДНК из лейкоцитов цельной крови пациенток с привычным невынашиванием выделяли согласно инструкции производителя в асептических условиях с использованием набора комплекта реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-экспресс-кровь» (НПО «Литех»).

Исследование генетических полиморфизмов в генах коагуляционного фактора V Arg506Gln 1691G/A (Лейденская мутация) и гена протромбина (коагуляционный фактор II) 20210G/A проводилось аллель специфической полимеразной цепной реакцией с последующей детекцией методом горизонтального электрофореза в 3% ага-розном геле с использованием комплекта реагентов «SNP-экспресс» производства НПФ «Литех» (Россия) согласно инструкции по применению.

Для качественного анализа наличия или отсутствия мутации в генах MTHFR Ala222Val (C677T), MTHFR Glu429Ala (А1298С), мутации ингибитора активатора плазминогена I типа-675 4G/5G, гена коагуляционного фактора XIII F13A1 Val35Leu производилась полимеразная цепная реакция <^№-экспресс^НОЪ> с использованием реагентов фирмы «Литех» (Россия) согласно инструкции по применению. Качественный анализ наличия или отсутствия мутации в гене фибриногена, бета FGB -455G-A проводили с помощью комплекта реагентов для амплификации «SNP-экспресс-РВ» (НПФ Литех). Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) детектировались в режиме реального времени на амплификаторе Rotor-Gene 6000/Q.

Интегральную оценку системы гемостаза проводили с помощью системы ротационной тром-боэластометрии (ROTEM Pentapharm GmbH) в соответствии с рекомендациями производителя. Были выполнены основные, скрининговые тесты и определены параметры свертывания цельной крови при инициации тромбообразо-вания факторами внешнего (рекомбинантный тканевый фактор) - EXTEM тест и внутреннего (контактная активация эллаговой кислотой) пути - INTEM тест. При проведении указанных тестов определяли следующие параметры: время свертывания крови (СТ), время формирования сгустка (CFT), угол альфа (ALP), амплитуда тромбоэластограммы в разное время (A10, A20, А30), максимальная плотность сгустка (MCF), максимальная эластичность сгустка (MCE), индекс фибринолиза (LI30), максимальный лизис (ML). Образцы для анализа были получены путем венепункции локтевой вены в пробирки VACUETTE с буферным раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 (9NC Coagulation sodium citrate 3,2%) согласно стандартам NCCLS [6]. Исследования на ROTEM проводились в течение

4 часов после забора крови. До проведения анализа образцы хранились при комнатной температуре. Непосредственно перед пипетированием пробирки с образцом осторожно несколько раз переворачивались для предотвращения осаждения форменных элементов крови. Тесты на анализаторе ROTEM были выполнены согласно инструкции изготовителя с использованием соответствующих программ и прилагающихся к прибору фирменных реактивов.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 10.0 (SN AXAR207F394425FA-Q).

Результаты и обсуждение

Генетическая предрасположенность к нарушениям гемостаза у женщин с ПНБ как фактора риска гестационных и перинатальных осложнений оценивалась согласно выявленным генетическим детерминантам тромбофилии (гомозиготным и/или гетерозиготным генотипам) с учетом комбинаций исследуемых генов и подсчетом количества одновременно выявляемых мутаций. Генетические формы тромбофилии были выявлены у 114 из 117 обследованных женщин с ПНБ (97,4%). Распределение частот генотипов по полиморфным вариантам исследуемых генов в группе женщин с привычным невынашиванием, контрольной группе и в группе сравнения представлены в таблице 1. В группу сравнения были выбраны средние результаты распространенности обследуемых полиморфизмов, полученные разными авторами с учетом потенциальной этнической схожести обследованных популяций.

Таблица 1. - Распределение частот генотипов по полиморфным вариантам исследуемых генов в группе женщин с ПНБ, контрольной группе и группе сравнения

Полученные данные свидетельствуют о том, что генетические маркеры тромбофилий встречаются с одинаковой частотой как у женщин с ПНБ, так и у женщин с реализованной репродуктивной функцией, соматический и акушерский анамнез которых не отягощен. Наличие тех или иных аллельных вариантов генов играет роль своеобразного преморбидного фона, в рамках которого могут развиться различные гестаци-онные осложнения, включая ПНБ. Поэтому при определении генетического статуса пациентки важно оценивать не только наличие или отсутствие определенной мутантной аллели, но и учитывать, в каком сочетании находится данная аллель с аллелями других генов, имеющих отношение к невынашиванию беременности. В связи с чем в нашем исследовании мы провели оценку комбинации генов, а также оценили количество одновременно выявленных мутаций.

Мультигенная тромбофилия (два и более полиморфизмов) имела место у 99 (84,6%) женщин с ПНБ и 20 (58,8%) женщин контрольной группы (р=0,001). По одной мутации из восьми исследуемых полиморфизмов выявлено у 11 (32,3%) женщин контрольной группы и у 17 (14,5%) женщин с ПНБ (р<0,02). У 47 (40,2%) пациенток с ПНБ выявлено сочетание двух мутаций, у 35 (29,9%) - трех, у 10 (8,5%) - четырех, у 4 (3,4%) женщин - пяти мутаций. У 10 (29,4%) женщин контрольной группы выявлено сочетание двух мутаций (по сравнению с основной группой р<0,03), у 8 (23,5%) - трех (р>0,05), единичным (2,9%) было сочетание четырех мутаций (р>0,05). Сочетания пяти мутаций в контрольной группе не наблюдалось.

Таким образом, у женщин с ПНБ значительно чаще выявляется комбинация аллельных вариантов нескольких генов и количество одновременно выявляемых мутаций. Поэтому наибольшее клиническое значение имеют мультигенные и комбинированные формы мутаций с наличием патологических гомозигот. Однако вопрос, при каких комбинациях и при каком количестве выявляемых мутаций повышается риск развития осложнений беременности, включая невынашивание, оставался нерешенным.

Поэтому параллельно генетическому исследованию было проведено интегральное исследование системы гемостаза методом ротационной тромбоэластометрии в группах небеременных и беременных с ПНБ. Всем женщинам выполнялись EXTEM и INTEM тесты метода ротационной тромбоэластометрии. Тесты EXTEM (активация рекомбинантным тканевым фактором) и INTEM (контактная активация эллаговой кислотой) являются скрининговыми тестами оценки, соответственно, внешнего и внутреннего пути свертывания крови. В каждом из этих тестов анализировались следующие параметры: время свертывания крови (СТ), время формирования сгустка (CFT), угол альфа (ALP) и максимальная плотность сгустка (MCF). Результаты скринин-говых EXTEM и INTEM тестов метода ротационной тромбоэластометрии в группе небеременных с ПНБ представлены в таблице 2.

Частоты генотипов исследованных

Ген Вариант полиморфизмов, %

генотипа Женщины Контрольная Группа

с ПНБ группа сравнения*

FII 20210 G/A 6,6 0 2-4

FV 1691 G/A 5,7 0 4-7

MTHFR 677 Т/Т 8,4 8,8 10-12

677 C/T 40,2 32,4 35-47,3

MTHFR 1298 С/С 12,1 8,8 7,3-12,1

1298A/C 46,7 41,2 32,7-42,9

PAI-1 675 4G/4G 34,3 23,5 21-29

675 4G/5G 38,1 55,9 47-55

FXIII Val34Leu Т/Т 9,3 8,8 7,3-20

Val34Leu G/T 44,9 38,2 32,7-40

FGB 455 A/A 11,1 - 2,2-7,3

455 G/A 17,5 20-43,6

GP1BA Thr145Met Т/Т 0 0 0,07-0,4

Thr145Met С/Т 16,3 8,8 16,0-27,4

Примечание *((Трифонова Е. А., 2012); (Дубоссарская З. М., 2014); (Воронин К. В., 2013); (Страмбовская Н. Н., 2013)

Таблица 2. - Результаты EXTEM и INTEM тестов у небеременных с ПНБ

Структурная и/или хронометрическая гиперкоагуляция выявлена у 21 (42%) небеременной с ПНБ. На хронометрическую гиперкоагуляцию указывает укорочение времени свертывания крови (CT), времени формирования сгустка (CFT) и увеличение угла альфа (ALP). Время свертывания крови является важным параметром активации факторов свертывания крови, а также их баланса с соответствующими ингибиторами (антитромбин III, протеин С и др.). Параметр CT показывает, насколько быстро начинается образование фибрина. CFT и ALP отображают кинетику образования сгустка и зависят главным образом от количества и активности тромбоцитов, уровня фибриногена и склонности его к полимеризации. На структурную гиперкоагуляцию указывает увеличение параметра максимальной плотности сгустка (MCF). Параметр MCF является основным параметром тромбоэластограм-мы, дающим интегральную оценку «качества» сгустка. Таким образом, укорочение CT и CFT с увеличением ALP или увеличение MCF указывает на наличие гиперкоагуляционного состояния и может быть следствием наличия у пациенток тромбофилий как причины привычного невынашивания беременности.

Результаты оценки гемостаза у беременных с ПНБ в анамнезе методом ротационной тромбоэ-ластометрии представлены в таблице 3.

Таблица 3. - Результаты EXTEM и INTEM тестов ротационной тромбоэластометрии у беременных с ПНБ в анамнезе

Структурная и/или хронометрическая гиперкоагуляция выявлена у 49 (73,1%) беременных с ПНБ, что превысило частоту ее встречаемости в группе небеременных (42%), потому что сама беременность часто способствует манифестации генетического дефекта при тромбофилии.

Увеличение тромбогенного потенциала крови или гиперкоагуляция лежит в основе механизма развития гестационных и перинатальных осложнений, обусловленных наличием тромбо-филических состояний [3]. С помощью дискри-минантного анализа была построена модель для прогнозирования развития гиперкоагуляционно-го состояния во время беременности по результатам молекулярно генетического исследования. Группирующим признаком было выбрано наличие гиперкоагуляционного состояния, диагностированное методом ротационной тромбоэ-ластометрии (таблицы 2, 3). При использовании прямого пошагового метода получена следующая дискриминантная функция:

у = 0,24*m(MTHFR С677Т) - 0,18*m(MTHFR А1298С)) + 0,115*т(РА1) + 0,63*т^5) + 0,56*т^2) - 0,05*т^13) + 0,37*т^В) -0,85*т^РША) - 0,17,

где: при диком гомозиготном варианте соответствующего гена т=0; гетерозиготном генотипе т=2; мутантном гомозиготном генотипе т=5.

Если у<0, прогнозируют низкую вероятность гиперкоагуляционного состояния при наступлении беременности, а при значении у>0 - высокую.

Чувствительность предлагаемой дискрими-нантной модели составляет 75,0%, специфичность - 85,7%. Прогностическая значимость положительного результата - 95,5%. Прогностическая значимость отрицательного результата - 46,2%. Общая прогностическая значимость 77,1%. Низкая прогностическая значимость отрицательного результата, вероятно, обусловлена тем, что гиперкоагуляционное состояние может быть следствием не только наследственных, но и приобретенных тромбофилий.

Выводы

1. Предложенная модель позволяет с чувствительностью 75,0%, специфичностью 85,7% прогнозировать возникновение гиперкоагуляци-онного состояния во время беременности путем анализа генетического статуса женщин с привычным невынашиванием беременности.

2. Использование данной модели даст возможность формировать группу женщин высокого риска по развитию тромбогенных ге-стационных осложнений для своевременной диагностики и коррекции выявленных нарушений во время беременности.

Заключение Параметры Количество

Норма 18

Всего гиперкоагуляции 49

• хронометрическая гиперкоагуляция |CT и |CFT TALP 1

• структурная гиперкоагуляция TMCF 34

• хронометрическая и структурная гиперкоагуляция |CT и |CFT TALP и|MCF 14

Всего: 67

Заключение Параметры Количество

Норма 29

Всего гиперкоагуляции 21

• хронометрическая гиперкоагуляция |CT и |CFT TALP 1

• структурная гиперкоагуляция |MCF 17

• хронометрическая и структурная гиперкоагуляция |CT и jCFT TALP и TMCF 3

Всего обследованных: 50

Литература

1. Гриневич, Т. Н. Ротационная тромбоэластометрия (ROTEM) / Т. Н. Гриневич, А. В. Наумов, С. В. Лелевич // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. - 2010. - №1. - С. 7-9.

2. Макацария, А. Д. Тромбофилии и противотромботи-ческая терапия в акушерской практике / А. Д. Макацария, В. О. Бицадзе. - М.: Триада-Х, 2003. - 904 с.

3. Тромбофилии в практике врача акушера-гинеколога / В. Н. Серов [и др.]. - Новосибирск, 2007. - 88 с.

4. Сидельникова, В. М. Привычная потеря беременности / В. М. Сидельникова. - М: Триада-Х, 2000. - 304 с.

5. Thromboprophylaxis implementation during pregnancy in women with recurrent fetal losses and thrombophilia / G. MitiC, A. Novakov MikiC, L. Povazan, A. Mitreski, V. Kopitovic, T. Vejnovic // Medicinski pregled. -2011. - Vol. 64 - Р. 471-475.

6. NCCLS. Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture, Approved Guideline — fourth edition // NCCLS Document H3-A4. Wayne, PA: NCCLS. - 1998. - Vol. 18, №7. - Р. 1-28.

Literatum

1. Grinevich, T. N. Rotary thromboelastometry (ROTEM) / T. N. Grinevich, A. Naumov, S. V. Lelevich // Journal of the Grodno State Medical University. - 2010. - №1. - P. 7-9.

2. Makatsaria, A. D. Thrombophilia and antithrombotic therapy in obstetric practice / A. D. Makatsaria, V. O. Bitsadze.

- M.: Triad-X, 2003. - 904 p.

3. Thrombophilia in practice obstetrician-gynecologist / V. N. Serov [et al.]. - Novosibirsk, 2007. - 88 p.

4. Sidelnikov, V. M. The usual pregnancy loss / V. M. Sidelnikov. - M: Triada-X 2000. - 304 p.

5. Thromboprophylaxis implementation during pregnancy in women with recurrent fetal losses and thrombophilia / G. Mitic, A. Novakov Mikic, L. Povazan, A. Mitreski, V. Kopitovic, T. Vejnovic // Medicinski pregled. - 2011. -Vol. 64 - P. 471-475.

6. NCCLS. Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture, Approved Guideline

— fourth edition // NCCLS Document H3-A4. Wayne, PA: NCCLS. - 1998. - Vol. 18, №7. - P. 1-28.

PREDICTION OF HYPERCOAGULABLE STATES DURING PREGNANCY BY ANALYZING GENETIC STATUS OF WOMEN WITH RECURRENT MISCARRIAGE

GrinevichT. N, Lyalikov S. A., Stepuro T. L. Educational Establishment "Grodno State Medical University", Grodno, Belarus

Hereditary thrombophilia is associated with a high risk of pregnancy complications as well as recurrent miscarriage. Most types of thrombophilia are characterized by hypercoagulable state, which is the basic mechanism of developing thrombogenic gestational complications.

The aim of the study was to develop a method of predicting the probability of a hypercoagulable state during pregnancy in women with recurrent miscarriage by analyzing genetic status of women.

Material and methods. We examined 117 women to determine the polymorphisms associated with miscarriage. Integral evaluation of hemostasis was performed using rotational thromboelastometry.

Results Genetic markers of thrombophilia are found with the same frequency in women with recurrent miscarriage and women with physiological reproductive function. So, we have developed a model for predicting the development of a hypercoagulable state during pregnancy to assess the combination of genes and the number of mutations detected at the same time by means of discriminative analysis.

Conclusions

1. The proposed model enables to predict hypercoagulable state during pregnancy with a sensitivity 75.0% and specificity 85.7%.

2. The use of this model will enable to form a group of women with high risk of gestational thrombogenic complications for prompt diagnosis and correction of disorders revealed during pregnancy.

Keywords: recurrent miscarriage, thrombophilia, hypercoagulability.

Поступила: 23.05.2016 Отрецензирована: 27.05.2016