CC BY
42
7. Коваленко В.Н., Калинкина Н.В., Ватутин Н.Т. Повреждение сердца цитостатиками. - Донецк: УкрНТЭК, 2002. - 349с.
8. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием EXCEL. - К.: Морион, 2001.- 408 с
9. Максютина Н. П., Мойбенко А. А., Пилипчук Л.Б. Корвитин для инъекций - кардиопротектор нового поколения // Материалы конф. «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармации». - С.Пб., 1999. - С. 130.
10. Науково-практичш рекомендаций з утримання лабораторних тварин та роботи з ними / Ю.М.
Кожем'яшн, О.С. Хромов, М.А. Фшоненко, Г.А. Сай-фетдшова.-К.: Вид. д1м "Авщена", 2002.-155с.
11. Повреждения сердца, вызванные применением антрациклинов. Новые данные / Ватутин Н.Т., Кетинг Е.В., Калинкина Н.В. и др. // Укр. мед. альманах. -2003. - Т.3, №4. - С.229-235.
12. Чевари С., Чаба И., Секей Й. Роль супер-оксиддисмутазы в окислительных процесах клетки и методы ее определения в биологическом материале // Лаб. дело. - 1988. - №11. - С. 678-681.
13. Hollman P., van Trijp J.M.P., Buysman M.N. Relative bioavailability of the antioxidant flavonoid quercitin from various foods in man // FEBS Lett. -1997. - Vol. 418, N 1-2. - Р. 152-156.
УДК 618.146-006:616-008.9:577.218-037-07
1.С. Шпонька*, О.В. Дорохова*, О.В.Шпонька**
ПРОГНОСТИЧНЕ ТА Д1АГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ ЕКСПРЕСП МАРКЕР1В Б1ОЛОГ1ЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ТКАНИН ПРИ ДИСПЛАСТИЧНИХ ТА НЕОПЛАСТИЧНИХ ПРОЦЕСАХ ШИЙКИ МАТКИ
Дтпропетровська державна медична академiя кафедра патологiчноi анатома* (зав. - д. мед. н., проф. 1.С. Шпонька)
Полешка Днiпропетровськоi державно'1'медично'1' академИ**
Ключовi слова: рак шийки матки, дисплазИ шийки матки, iмуногiстохiмiя, тканинт маркери, eipym папшоми людини Key words: uterine cervix cancer, cervical intraepithelial dysphasia, immunohistochemistry, tissue markers, human papilloma viruses
Резюме. В работе рассматриваются актуальные вопросы использования маркеров биологических свойств тканей, таких как р16, р53, Ki-67, cyclin-D1, при диспластических и неопластических процессах шейки матки. Обсуждается диагностическая и прогностическая ценность каждого маркера и определена сфера их возможного использования. Рассматриваются теоретические вопросы онкогенеза при персисти-рующей инфекции вирусом папилломы человека высокой степени риска. Детально была рассмотрена клиническая ценность определения белка р16. Были определены 2 варианта окрашивания р16 - фокальный и диффузный - и была подчеркнута значимость именно диффузного варианта для ранней диагностики диспластических и неопластических процессов шейки матки. В аспекте практического использования им-муногистохимии в данной области подчеркнута важность исследования целого комплекса маркеров, таких как р16, р53, Ki-67, cyclin-D1, с обязательным изучением экспрессии р16, показывающего запуск он-когенного потенциала вирусов папилломы человека высокой степени риска в эпителии шейки матки и Ki-67, универсального маркера пролиферации.
Summary. The actual questions of usage of markers of biological tissue properties, such as p16, p53, Ki-67, cyclin-D1 in dysplastic and neoplastic processes of uterine cervixes are reviewed in this article. The diagnostic and prognostic value of each marker is discussed and the area of their possible usage is determined. Theoretical problems of oncogenesis in persistent infection with a high risk human papilloma viruses are discussed. Clinical value of determination of protein p16 staining is reviewed in detail. Two different types of p 16 staining - focal and diffuse were assessed, the significance
namely of diffuse type for early diagnostics of dysplastic and neoplastic processes of uterine cervixes epithelium was pointed out. In the aspect of practical usage of immunohistochemistry in the given area, the importance of assessment of the whole complex of markers, such as p16, p53, Ki-67, cyclin-D1 with mandatory analysis of p16 expression, showing initiation of oncogenic expression of high risk human papilloma viruses and Ki-67 - a universal marker of proliferation, is underlined.
Рак шийки матки (РШМ) залишасться одшею з найбшьш розповсюджених форм новоутворень, займаючи 7-е мюце серед ушх злоякюних пухлин i 3-е мюце серед ушх раюв жшок (пюля раку молочно! залози i товсто! кишки). РШМ складае 9,8% ушх раюв у жшок. За даними Мiжна-родного агентства по вивченню раку, щорiчно у свт рееструеться 371 000 нових випадкiв РШМ i щорiчно вiд нього умирають 190 тис жiнок [5]. Бшьшють випадкiв РШМ (78%) зустрiчаеться в кра!нах, що розвиваються, де вш складае 15% вiд усiх раюв у жiнок i е другою з найбшьш частих причин смерт вщ новоутворень, тодi як у роз-винених кра!нах вiн складае тшьки 4,4% вiд нових випадюв раку.
Ступiнь поширення пухлинного процесу мае основне значення у визначенш прогнозу зах-ворювання. За даними В.1. Чиссова [2], п'ятирiчна виживанють при лiкуваннi хворих iз дисплазiями шийки матки складае 100%, прешвазивним раком - 99,1%, мшрошвазивним раком - 96,8%. При швазивному рацi цi результати iстотно нижче. Наведенi данi з великою переконливютю пока-зують першочергове значення ранньо!' дiагнос-тики i своечасного лшування хворих iз диспла-зiями i преiнвазивними раками, що е реальним та найбiльш ефективним способом вторинно! про-фiлактики iнвазивного РШМ.
РШМ е одшею з нозолопчних форм злояюсних новоутворень, що задовольняють ушм ви-могам для проведення популяцiйного скринiнгу. Це захворювання широко розповсюджене i е важливою проблемою охорони здоров'я, мае на-дiйно розшзнавану преклiнiчну фазу i тривалий перюд розвитку. 1снують широкi можливостi для подальшо! верифшацп дiагнозу i методи ефек-тивного лiкування, i, нарешп, використовуеться скринiнг-тест iз цитологiчного дослщження маз-кiв, взятих iз екзоцервшсу та цервiкального каналу. Широке та якiсне використання цитоло-пчного методу обстеження жiнок дае, у певнш мiрi, гарантованi результати виявлення хворих iз передраком i початковими стадiями раку, що зумовлюе можливють лiкування хворих "менш радикальними" методами, скоротити термши !х лiкування, знизити випадки швалщизацп i смертности що мае також економiчний ефект.
Незважаючи на iснування певних стандарта,
цитолопчний скринiнг i3 ПАП-тестом мае ютотш обмеження. Метод мае високу специфiчнiсть, але також досить низьку чутливють i вщтворюва-нiсть i3 численними помилково негативними та помилково позитивними результатами (до 20 %, внаслщок суб'ективних морфолопчних критерпв, як використовуються для розпiзнавання i шд-рахунку дискарiотичних клiтин). Цi обмеження при застосуванш традицiйноl цервiкально! цитологи приводять до невиправданих витрат при некоректному застосуванш лшувальних заходiв, психологiчного стресу жшок, якi одержали помилково позитивш чи помилково негативш результати, та зумовлюють необхiднiсть пошуку та полiпшення дiагностичних засобiв для скринiнгу патологи шийки матки [4].
Дослщження останнього часу довели взаемо-зв'язок мiж персистуючою iнфекцiею, що викли-кана вiрусами папiломи людини високого сту-пеня ризику, i розвитком штрацервшальних нео-плазiй. Досягнутий iстотний науковий прогрес у розумiннi молекулярних механiзмiв розвитку раку шийки матки. Використання молекулярних бiомаркерiв, таких як р16, р53, циклiн D1, Ki-67 i бiлкiв родини-тст як варiант визначення й штерпретацн диспластичних клiтин, дозволяе значно зменшити "людський фактор", властивий при стандартному морфолопчному пiдходi. Зав-дяки використанню прогностичних маркерiв можна вщбирати контингент хворих iз шдви-щеним ризиком розвитку iнвазивного раку, що значно знизить вартють подальших дiагностич-них чи терапевтичних процедур, маючи на увазi, що бшьшють цервшальних iнтраепiтелiальних неоплазiй легкого та середнього ступеня (CIN I та II) регресують спонтанно.
Вiруси папшоми людини (HPV) складають своерiдну групу ДНК-вiрусiв, якi характеризую-ться тротзмом до епiтелiю i викликають суб-клiнiчнi форми шфекцп, що, однак, може приво-дити до такого серйозного наслщку, як рак шийки матки [9, 17, 29]. Тому невипадково одним iз найважливших досягнень у вивченнi етюлогп раку прийнято вважати встановлення факту причинного зв'язку мiж HPV-iнфекцiею i РШМ [46]. У наш час вживаються значш зусилля, спря-моваш на пошук нових методiв ранньо! i точно! дiагностики передпухлинних i пухлинних захво-
рювань шийки матки, для бшьш раннього та менш радикального лшування ще! групи хворих [16], а також методи дiагностики шфекци, що викликана HPV високого ступеня ризику, для створення ефективних профшактичних i лшу-вальних вакцин проти дано! групи вiрусiв [6, 8,
9].
При РШМ у 90-100% випадюв у пухлинному матерiалi виявляеться ДНК HPV, у той час як середня шфшованють у популяци здорових жь нок не перевищуе 5-20% [8]. Дослiдження остан-шх рокiв показали, що 95% неоплазм шийки матки мютять рiзновиди HPV, що належать до так званих титв "високого ризику" (HPV 16, 18, 31, 33 та 45).
Не викликае сумнiвiв, що висновок про етю-лопчну роль HPV при РШМ мае не тшьки важ-ливе теоретичне, але також i безпосередне прак-тичне значення. По-перше, стае актуальним фор-мування груп ризику, у яю, насамперед, повиннi попадати постшш носительки HPV-шфекцп, у той час як рiзноманiтнi соцiально-економiчнi фактори, яким рашше давали провiдну роль, повинш розглядатися як другоряднi. По-друге, основш превентивнi заходи повиннi бути спря-мованi на боротьбу з HPV-шфекщею, i саме в цьому контекст варто розглядати впровадження в дану галузь сучасних технологiй.
Варто шдкреслити, що, незважаючи на високу потенцшну небезпеку, HPV е умовними патогенами. Носшство HPV свiдчить не про злоя-кiсний процес як такий, а про багаторазово шд-вищений ризик виникнення останнього [9]. Фактори, що модифшують патогеншсть HPV i, як наслiдок, провокують пухлинний рют у шф> кованих жшок, залишаються невiдомими. На думку деяких авторiв, дiагностика HPV-шфекци мае високу клшчну значущiсть та дозволяе окреслити групу онкологiчного ризику, тобто виявити серед здорових жiнок тих, кому в першу чергу необхщне проведення активних, ком-плексних заходiв, спрямованих на профiлактику i ранню дiагностику РШМ [13, 26].
Ведуча роль у канцерогенному процес на-лежить бiлкам Е1, Е2, Е6 i Е7. Процес реалiзацil туморогенного потенщалу HPV складаеться з де-кшькох послiдовних генетичних подiй. Iмовiрно, як iнiцiюючi фактори виступають мутаци в рiз-них дiлянках гена Е1, що у нормi вiдповiдае за ешсомальний статус HPV-ДНК. У результат уш-кодження Е1 вiдбуваеться штегращя генома HPV у хромосоми кттини-хазяша. Процес вбу-довування генома HPV може супроводжуватися iнактивацiею ще одного вiрусного гена - Е2. У результат втрати функцюнально! активностi
гена Е2 збшьшуеться експресiя гешв Е6 i Е7, що безпосередньо запускають процеси пухлинно! трансформаций Онкогенш властивостi продуктiв Е6 i Е7 зумовлеш !х здатнiстю утворювати ком-плекси з негативними регуляторами кттинного росту - бiлками р53 (для Е6) i Rb (для Е7) [20, 42]. Бшки Е6 i Е7 рiзних типiв HPV можуть вiдрiзнятися один вiд одного за сво!ми бюхь мiчними властивостями i трансформуючим по-тенцiалом.
Бiлок Е6 HPV-16 шщдае низку важливих процешв, що зумовлюють клiтинну iмморта-лiзацiю. Оскiльки Е6 е одним iз найбiльш раннiх генiв, якi експресуються в ходi HPV-iнфекцil, вiн створюе умови для бшьш штенсивно! продукцп вiрусних часток у клiтинi. Щ змiни внутрi-шньоклiтинного середовища включають пригш-чення апоптозу внаслiдок деградаци бiлка р53, блокування транскрипц^! ряду кттинних генiв, а також подовження тривалостi життя клiтин за рахунок активаци теломерази.
Бiлок Е7 вщграе найбiльш важливу роль у трансформаци клiтин. Описанi рiзнi шляхи взаемоди Е7 iз клiтинними бiлками, багато з яких належать до факторiв, що регулюють пролi-ферацiю кттин [22]. Е7 прискорюе перехiд клггини з G1 у S фазу i взаемодiе з бiлками роду RB-супресора деацетилазами гiстонiв, транс-крипцшним фактором АР-1, циклiнзалежними кiназами i CDK-iнгiбiторами. Цi взаемод^! поя-снюють здатнють Е7 стимулювати пролiферацiю клггин, а також викликати !х iмморталiзацiю.
Отже, бiологiчнi властивостi i молекулярна структура HPV-бшюв вивченi досить повно, проте конкретш шляхи реалiзацil канцерогенного ефекту вiрусу вимагають подальшого уточнення.
Основний шлях передачi генiтальноl HPV-iнфекцil - статевi контакти. Потрапляючи в орга-нiзм, HPV локалiзуеться в базальному клiтин-ному шарi епiтелiю, що являе собою популящю клiтин, якi активно дiляться. В ходi епiтелiальноl диференцiацil геном папiломавiрусiв проходить усi стад^! продуктивно! шфекци i завершуеться в зрiлих кератиноцитах. Така форма шфекци приводить до цитопатичних ефекпв, що виявляеться у формi койлоцитозу, гострих кондилом i т.п. [3]. Як показують численш епiдемiологiчнi дос-лiдження, у бшьшосп випадкiв спостерiгаеться досить тривала персистенщя HPV-ДНК у клiти-нах базального шару ештелда [15]. Подальша динамiка HPV-iнфекцi! може реалiзуватися або в !! регресс, тобто елiмiнацi! вiрусного пулу клi-тин, або, навпаки, у прогреси, що супро-воджуеться включенням HPV-ДНК у клггинний геном i появою характерних для злояюсно!
трансформаци морфолопчних змш епiтелiю [18]. Прогрешя клiтин, уражених BipycoM папiломи людини високого ступеня ризику (HPV), у швазивну карциному - дуже тривалий, стадiйний процес, що займае щонайменше 10-15 рокiв [18, 19]. Слщ зазначити той дуже важливий факт, що на будь-якому етат цей процес може пере-рватися завдяки активаци противiрyсного iмyнi-тету, апоптозу чи спонтанно! регресп. Так, 91 % CIN низького ступеня, що виявлялися у мазках молодих жшок, регресують у межах 36 мюящв, i тiльки 3 % прогресують до дисплазiй бiльш тяжкого ступеня [1].
З того часу, як було показано, що вiрyси папшоми людини високого ступеня ризику зумо-влюють розвиток раку шийки матки, вiрyсоло-пчш тести неодноразово пропонувалися як по-лiпшенi методи для вiдборy жшок iз високим ризиком подальшо! прогреси передракових зах-ворювань. Однак через вщносно високу стрiваль-нiсть HPV шфекци у жшок без диспластичних ушкоджень (50 % yсiх цитолопчно непiдозрiлих жiнок) [38] i незначного вщсотку жшок, у яких ця шфекщя приводить до клiнiчно виражено! цервшально! дисплази (приблизно 10 %), виник-ли сyмнiви щодо ефективносп HR-HPV-тестiв як первинного методу вщбору до групи ризику. Це посилювалося психологiчними проблемами для жiнок, яю отримували позитивний результат без явних клшчних ознак дисплази. Дослiдження останнього часу ч^ко продемонстрували, що тести на HPV високошформативш для жшок iз сyмнiвною цитологiею [38], доцшьш при скри-нiнгy жiнок вшово! групи старше тридцяти рокiв. У молодих жшок (до 30 роюв) розповсюджешсть HPV шфекци занадто висока, щоб виправдати використання вiрyсних теспв як метода вiдборy у початковш скринiнговiй схемi. Не можна не вщзначити, що жоден iз цих тестiв не може надiйно диференщювати транзиторний процес i хронiчнy шфекщю. Через це, коли тести для виявлення вiрyсiв папiломи людини використо-вуються на популяци з низьким ризиком розвит-ку пухлинних захворювань, вони показують низьку специфiчнiсть у виявленш злоякiсних захворювань. Використання ж 1'х тiльки в заз-начених вiкових групах чи з додатковими тестами, такими як цитолопчне чи пстолопчне до-слiдження, приводить до вщносно високо! специфiчностi з високою чyтливiстю, що вiдбито в недавшх змiнах до скринiнгових рекомендацш.
Молекyлярнi маркери, що вказують на кон-версiю HPV iнфiкованих кл^ин у диспластичнi клiтини, ймовiрно, полшшать i чyтливiсть, i спе-цифiчнiсть засобiв для скринiнга раку шийки
матки [44, 45] i в такий спошб оптим1зують клшчну терашю. Початковi спроби видiлити продукти вiрусних генiв не довели користi через низький рiвень експреси цих гешв навiть у перетворених клiтинах, гетерогеншсть антитiл усiх типiв HPV, експресда цих генiв також у про-мiжних чи поверхневих клiтинах в ушкоджен-нях, що вказують на гостру шфекщю HPV, а не на дисрегульовану експресда вiрусних онкогешв в епiтелiальних базальних клiтинах.
Цитолопчш i гiстологiчнi дослiдження iз зас-тосуванням бiомаркерiв мають двi важливi переваги: по-перше, це значно зменшуе скринiн-говий час, указуючи на дискарютичш клiтини, що розширюе локаторну можливють скринiнга. Також це зменшуе кшьюсть клiтин, необхiдних для оцшки. Крiм того, використання бiомаркерiв дозволяе зменшити суб'ективнiсть оцiнки про-цесу, показуючи саме ri клiтини, що е важли-вими для прогнозу та постановки дiагнозу, а саме - експресують онкоген, чи клгтини з пору-шенням будови хромосом, наприклад, з анеупло-iдiею, що морфолопчно нелегко розпiзнати [12], [13].
У зв'язку з цим увагу дослщниюв, як мож-ливий бiомаркер, привернув бшок р16INK4a, що представляе собою шпб™р циклiнзалежних кi-наз Cdk 4,6 [30, 32]. У нормальних, недисплас-тичних клiтинах, бiлок р16ШК4а експресуеться на дуже низькому рiвнi i не визначаеться iмуногiстохiмiчним методом [36, 37, 40]. Даний бшок, що е негативним регулятором пролiфера-ци кттин, бере участь у сигнальному шляху Cdk-Rb-E2F, що контролюе перехвд клiтини з фази Gi у S-фазу клiтинного циклу [30]. Як i iншi супресори пухлинного росту, ген, що кодуе р16INK4a у пухлинах самих рiзних локалiзацiй нерщко iнактивуеться в результатi точкових мутацш, делецiй чи метилiрування. Вибiр саме р16ШК4а, як потенцiйно перспективного маркера для ранньо! дiагностики раку шийки матки зумовлений наступними обставинами. Насам-перед, це те, що вщповщний ген утягнутий у той же самий сигнальний шлях, що i ген схильносп до ретинобластоми Rb, бшковий продукт якого, у свою чергу, вибiрково iнактивуеться продуктом онкогену Е7 HPV [42]. Продемонстровано зворотну корелящю мiж станом p16INK4a i pRb як in vitro, у тому чи^ в цервшальних клiтинах людини [20], так i в клiтинах первинних пухлин рiзних локалiзацiй [20, 42]. Визначена також здатшсть pRb здiйснювати негативну регуляцiю синтезу р16INK4a.
Таким чином, гшерекспреая бiлка р16INK4a, який блокуе перехщ клiтини в S-фазу i на пер-
ший погляд е парадоксальним для пухлинних кл^ин фактом, у випадку карцином шийки матки, де етiологiчним агентом е HPV i, як наслщок, пiд дiею Е7 iнактивуеться pRb, в дiйсностi може служити шдикатором злоякiсного перетворення клiтин епiтелiю шийки матки [20].
У робот Danielle та спiвавторiв [22] повщо-мляеться, що експресiя вiрусного онкогена E7 у кл^инах, що збертають здатнiсть реплiкуватися, веде до значно! експреси продуктiв гена p16INK4a, найбшьш ймовiрно, внаслiдок вза-емоди з функщею негативного контролю, що регулюе транскрипщю p16INK4a класичного гена, що вважаеться супресором пухлини. Надви-сокi рiвнi p161NK4a, зумовленi впливом E7, були визначеш в прешвазивних i iнвазивних раках шийки матки [21, 23]. У цервшальних дисплазiях низького ступеня (CIN I) p161NK4a-позитивнiсть спостерiгалась у пролiферуючих базальних кль тинах приблизно в 60% випадюв, тодi як у 40% спостережень клггини не фарбувалися на р16INK4a, хоча факт iнфiкованостi HPV було тдтверджено [24].
Надмiрна експресiя р16INK4a притаманна тiльки перетвореним клiтинам, яю реплiкують HPV i характеризуються розрегульованою екс-пресiею гена. Тому саме цей маркер було запро-поновано як визначений маркер для щенти-фшацп диспластичних клiтин у пстолопчних зразках для значного скорочення варiабельностi у тлумаченнi гiстологiчних змiн, а також полш-шення дiагностичноl чутливосп i специфiчностi цитологiчних дослiджень [24, 25, 27]. Деяю занепокоення виникли, однак, у вщношенш валiдностi визначення p16INK4a у цитологiчних мазках, тому що невелика кшьюсть неперет-ворених клiтин, що експресують р16INK4a, мо-жуть зустрiчатися в препаратах зi статевих шляхiв [31]. Вони можуть давати шдвищення кiлькостi помилково позитивних результата. Дшсно, iснують деякi епiтелiальнi клiтини, що фарбуються позитивно на р16INK4a певними моноклональними антитiлами без очевидних оз-нак дискарiозу. У пстолопчних зрiзах цi клiтини можна легко вiдрiзнити через характерну ядерну архтектуру i локалiзацiю в епiтелiальному шарi. Це привело до визначення двох титв пози-тивностi на р16INK4a. Фокальний тип (пози-тившсть) - нечисленнi або поодинокi р161NK4a позитивнi клiтини, що визначаються в промiж-ному чи поверхневому кштинному рiвнях атро-фiчного епiтелiю чи в метапластичному ештели; дифузний тип - характерний для диспластичних чи пухлинних ушкоджень, що викликанi персис-туючою шфекщею онкогенних HPV [35]. В ос-
танньому тит значна експрешя продyктiв гена р16ШК4а викликана блокадою негативного транскрипцшного зворотного зв'язку регуляци RB-E2F комплексу, що був перерваний продуктами онкогена - HPV E7.
Дифузна надмiрна експреая у погано ди-ференцiйованих кл^инах, якi розмножуються у базальному чи парабазальному шарах, розцшю-еться як сурогатний маркер експреси вiрyсних онкогешв у пролiферyючих епiтелiальних базальних кл^инах [36, 37]. I навпаки, фокальна експрешя p16INK4a у поверхневих плоскокль тинних шарах вiдбивае кттинш механiзми вщ-повiдi на змшений процес диференцiювання, наприклад, при епiтелiальнiй атрофи, особливо у ж1нок похилого вшу, а також при плоско-клггиннш метаплаз^'. У даному випадку пору-шення диференцiювання епiтелiальних кттин зумовлено, можливо, як реакцiя на метаплас-тичнi й атрофiчнi змши. Клiтини при цьому зупиняють кттинний цикл шляхом експресп' одного з найбшьш могутшх iнгiбiторiв прогрес^' клггинного циклу - И нормального кттинного компонента, циклiнзалежного iнгiбiтора кiнази p16INK4a [40]. Зупинка клiтинного циклу i вi-зyалiзyеться фокальним типом p161NK4a експресп' в гiстологiчних зрiзах. Розгляд цих фундамен-тальних механiзмiв пояснюе той факт, що ктти-ни, якi експресують p16INK4a унаслщок транс-формац^' онкогенних HPVs, е активно пролiфе-руючими, тодi як кттини, що експресують р16INK4a в результат порушення процесiв ди-ференщювання, мають зупинений клiтинний цикл i припинили подальшу пролiферацiю.
1ншу групу бiомаркерiв, що придатнi до використання в цито- i гiстологiчнiй дiагностицi патолог^' шийки матки, складають маркери визначення пролiферативноl активностi, яю широко використовуються при гiстологiчнiй оцшщ злоякiсних новоутворень як прогностичнi i про-вiснi фактори. Найбiльший штерес становлять антитiла Ki-67 (клон М1В-1) та PCNA [41, 43]. Протешовий комплекс, що виявляеться за допо-могою антитiла Ki-67, е субстанщею, яка дуже швидко розпадаеться i знаходиться тiльки в клiтинах, що подшяються, визначае пролiфе-рyючi клггини, що знаходяться на рiзних фазах циклу, i, таким чином, вщбивае весь пул клiтин, що пролiферyють. Ki-67, на наш погляд, е найбшьш надшним i чггким маркером пролiферацil. PCNA (ядерний антиген пролiферyючих клiтин) -проте!н, що представляе компонент ДНК-пол> мерази i також виявляеться у бiльшостi пролiфе-руючих клiтин.
Про використання Ki-67 у цервшальнш цито-
логп i пстологи повiдомлено в цшй низцi публiкацiй [10,15,33]. Високий рiвень пролiфе-раци у новоутворенiй тканиш прямо пов'язаний з патогенезом i реалiзуеться через мутацiю в генах, що регулюють клiтинний цикл, р53 чи pRb, та зустрiчаеться в бшьшост злоякiсних ново-утворень. У раках шийки матки обидва iз зазна-чених ключових шляхiв м^огенного керування можуть уражатися онкогенними бшками НРУ -Е6 i Е7 (Е7 блокуе pRb, Е6 - р53). Таким чином, надлишкова експрешя Кi-67 може служити шди-катором гiперпролiферативного стану, що пов'язаний з непластичними трансформацiями, проте може "неспецифiчно" супроводжувати рiзнi реак-тивш стани. Цi недиспластичнi пролiферуючi клггини, однак, нiколи не експресують р16ШК4
[41].
Як було частково зазначено вище, не менш важливу роль у забезпеченш мiтогенного потен-щалу клiтин вiдiграють бiлки, що регулюють кл^инний цикл, - циклiни, експрешя яких змшю-еться протягом цього циклу. При досягненш критичного рiвня вiдповiдних бiлкiв вiдбуваеться фосфорилювання ключових компонента м™-тичного комплексу в результат взаемоди цик-лiнiв зi спецiальними клiтинними кiназами. 1снуе кшька класiв циклiнiв (вiд А до Е), що регулюють рiзнi фази клггинного циклу [7].
Циклш D1 регулюе перехiд кттини вiд фази G1 у S-фазу. Ген, що кодуе циклiн D1, е про-тоонкогеном, вiдомим як PRAD/CCND/bcll, i локалiзуеться в 11-й хромосомi [7]. У механiзмi ди циклiнiв важлива роль належить циклш-залежним кiназам (cdk), якi притаманш практично всiм клiтинам i регулюються шляхом спе-цифiчного фосфорилювання (позитивно) i шляхом асощацп з iншими бiлками (негативно). Вони присутш тiльки пiд час певних фаз клiтинного циклу: так, при переходi вiд Gl-фази до S-фази активуються cdk2 i cdk4. Комплекс циклш D1-cd4 фосфорилюе ряд регуляторних бiлкiв, у тому числi i так званий онкопроте!н ретинобластоми (pRB) [11]. Певну роль у цих процесах вщшрають бiлки-iнгiбiтори циклшза-лежних кiназ. Вони блокують циклiнзалежну кшазу стереометричним зв'язуванням, зупиняю-чи кл^ини у фазi G1. До цих iнгiбiторiв належать бiлки р21, р27 i бiлки сiмейства р161пк4А, про що було наведено вище. Останш, як при-пускаеться, являють собою гени-супресори пух-лин. Циклш D1 функцiонально зв'язаний з бш-ком-iнгiбiтором р161пк4 [7, 11]. Milde-Langosch iз спiвавторами [21] визначили зв'язок експреси циклiна D1 з папiломавiрусною iнфекцiею. Гомо-логiчнiсть вiрусного бшка Е7 i циклiна D1, який
впливае на експресiю пухлинного супресора бш-ка ретинобластоми, вiдiграе ключову роль у naToreHe3i HPV-асоцшовано! цервшально! карци-номи.
Роль циклiна D1 вивчалась у цшй низщ до-слiджень i3 використанням у якост моделi рiзних типiв пухлин. Було визначено кореляцда мiж експресiею циклша D1 та iншими показниками пролiферацi! [21], онкогенами р53 i Ьс1-2, параметрами функцiонального стану i ступеня дифе-ренцiювання клiтин, наприклад, рецепторами естрогешв. В останнiй час з'являються роботи, в яких дослщжено роль цього регулятора м^отич-ного циклу при рiзних типах карцином шийки матки [32]. У нормальному багатошаровому плоскому ештели та при дисплазiях низького ступеня вщзначаеться низький рiвень експреси циклша D1, у той час як при значнш дисплази чи у випадках швазивного рака - високий. Суттева експресiя циклiна D1 спостершалася в 77% шва-зивних плоскокттинних карцином, 40% адено-карцином in situ, 15% швазивних аденокарци-ном, 40% дрiбноклiтинних недиференцiйованих карцином шийки матки [32].
Не менш щкавим, на наш погляд, е вивчення експреси бiлка р53 при передпухлинних i пух-линних захворюваннях шийки матки. У нормi ген р53 е своерiдним "захисником" геному, ак-тивним "реашматором" ДНК та iндуктором апоп-тозу [34, 39]. При сублетальних ушкодженнях ДНК, що виникають пiд впливом iонiзуючого випромшювання, хiмiчних речовин та вiрусiв, вш припиняе клiтинний цикл у фазi G1, запускае процеси вiдновлення ДНК та в залежност вiд результату "виршуе" подальшу долю клiтини. У випадку усшшно! репараци ДНК з кл^ини знiмаеться блок, i вона може в подальшому дши-тися i функцiонувати в звичайному режима При неможливостi вiдновлення ДНК ген р53 через активацiю каскаду каспаз запускае знищення пошкоджено! клiтини, тобто шщюе процес апоптозу. Таким чином, ген р53 через активацiю апоптозу здшснюе елiмiнацiю мутантно! клiтини i блокуе виникнення злоякiсних новоутворень
[43].
Перетворення нормально! кттини в пухлинну вiдбуваеться у результатi накопичення сукуп-ностi мутацiй у генетичному апарат, якi приз-водять до порушення механiзмiв, що контро-люють розмноження та рiст клiтин. Iнактивацiя онкосупресорно! функцi! гена wр53 ("wild", "дикого", нормального типу) - ушверсальний крок у розвитку пухлин у людини. Рiзноманiтнi мутацi! р53-"дикого" типу й утворення тр53 (мутант-ного) - найбшьш часте генетичне порушення, яке
знаходять у злояюсних пухлинах [43]. Мутащя р53 приводить до надекспреси, що iмуногiсто-хiмiчно виявляеться як ядерне забарвлення [14]. Результатом дослщжень, що проведенi нещо-давно, встановлено, що бшки р53 не виявляються iмуногiстохiмiчними методами в незмшеному екзоцервiксi. В мiру зростання неопластичних процешв в ештели шийки матки вщ Ц1Н I до Ц1Н III експресiя продуктiв цього гена збшьшуеться, i вони визначаються в ядрах нянин з ознаками атипп у всiх епiтелiальних шарах.
Багатьма дослщниками ген wр53 у нор-мальних клiтинах тканин шийки матки був виз-начений як супресор пухлинного росту [15, 22, 28]. У той же час у неопластичних клнинах знач-но збшьшуеться експрешя мутантного тр53. Ыа-ктивацiя функцн гена р53 за рахунок ВПЧ чи шшого типу ушкодження бiлка р53 приводить до розвитку пухлин iз вираженими злоякiсними та iнвазивними властивостями i вiдiграе важливу роль у процесах канцерогенезу в шийцi матки. Iмуногiстохiмiчно показано надлишкову експре-сда р53 при ЦIН III i ЦПК при ураженнi ВПЧ
[28, 34]. При цьому у випадках ЩН I та ЦIН II високий рiвень р53 визначався тшьки у клiтинах базального i парабазального шарiв. У клiтинах цервiкального плоскоклнинного раку регуляцiя циклу порушуеться дiею вiрусних онкопротешв шляхом зв'язування та шактивацп р53 за допо-могою ВПЧ Е6 i зв'язуванням гена ретиноблас-томи (Rb), р21 i р27 за допомогою онкопротешв Е7. Е6 зв'язуеться з р53, що приводить до швидко! деградацп цього пухлинного iнгiбiтора.
Не слiд забувати, що поширення HPV-iн-фекцн тдкоряеться тим же закономiрностям, що характерш для iнших захворювань, якi пере-даються статевим шляхом. Звiдси випливае, що багато заходiв профiлактики HPV-iнфекцi! но-сять соцiально-поведiнковий характер. З шшого боку, сам факт HPV-iнфiкування не е фатальним; рак шийки матки, навнь якщо вiн виникае, розвиваеться через досить тривалi, вщносно без-печнi фази дисплазн i неiнвазивного раку. Таким чином, ретельний мошторинг HPV-носi!в, очевидно, дозволить цшком позбутися життево не-безпечних наслiдкiв HPV-iнфекцi! [4].
СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ
1. Голованова В.А., Новик В.И., Гуркин Ю.А. Частота и факторы риска папилломавирусной инфекции и дисплазии эпителия шейки матки у сексуально активных девушек-подростков // Вопр. онкологи.-1999.- Т. 45.- С. 623-626.
2. Злокачественные новообразования в России в 1999 году: (заболеваемость и смертность) / Под ред. В.И. Чиссова, В.В.Старинского.- М.: 2000.-130с.
3. Клинико-морфологические аспекты церви-кальной папилломавирусной инфекции / Коломиец Л.А., Уразоева Л.Н., Севастьянова Н.В., Чуруксаева О.Н. // Вопр. онкологЦ.- 2002.- Т.48.- С.43-46.
4. Пути повышения эффективности цитологического скрининга рака шейки матки / Новик В.И., Сафронникова Н.Р., Урманчеева А.Ф., Кутуева Ф.Р. // Материалы всерос. симпозиума «Новые информационные технологии в онкологической статистике» / Под. ред. В.М. Мерабишвили.- С.Пб., 2001.- С.195-197.
5. Эпидемиология и диагностика рака шейки матки / Акушерство и гинекологии.- 2001.- Т. XLX, вып. 1.- С. 80-86.
6. A general primer GP5+/GP6+-mediated PCR-enzyme-immunoassay method for rapid detection of 14 high-risk and 6 low-risk human papillomavirus genotypes in cervical scrapings / Jacobs M.V., Snijders P.J.F., van den Brule A.J.C. et al. // J. Clin. Microbiol.-1997.-Vol.35.- P.791-795.
7. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4 / Serrano M., Hannon G.J., Beach D. et al. // Nature.- 1993.-Vol.366.- Р.704-707.
8. A non-radioactive PCR enzyme-immunoassay enables a rapid identification of HPV 16 and 18 in cervical scrapes after GP5+/6+ PCR / Jacobs M.V., van den Brule A.J.C., Snijders P.J.F. et al. // J. Med. Virol.- 1996.-Vol.49.- P.223-229.
9. Application of polymerase chain reaction for screening of Human Papillomaviruses in cytopathologies of the cervix uteri / Walboomers J.M.M., Melkert P.W.J., Van Den Brule A.J.C. et al. // Molecular Diagnostic Pathology. A practical approach / Ed. by: Herrington C.S., McGee J.- Moscow: Mir, 1999.- P.474-495.
10. Assessment of Ki-67 antigen immunostaining in squamous intraepithelial lesions of the uterine cervix: Correlation with the histologic grade and human papil-lomavirus type / al-Saleh W., Delvenne P., Greimers R. et al. //. Am. J. Clin. Pathol.- 1995.- Vol.104.- P.154-160.
11. Bravo R., Macdonald-Bravo H. Changes in the nuclear distribution of cyclin (PCNA) but not its synthesis depend on DNA replication // EMBO J.- 1995.- Vol.4.-P.655-661.
12. CDKN2 gene silencing in lung cancer by DNA hypermethylation and kinetics of p16INK4 protein induction by 5-aza 2'deoxycytidine / Otterson G. A., Khleif S. N., Chen W. et al. // Oncogene.- 2001.- Vol.11.-P.1211-1216.
13. Cervical adenoid basal tumors comprised of adenoid basal epithelioma associated with various types of invasive carcinoma: Clinicopathologic features, human papillomavirus DNA detection, and P16 expression / Nicholas S., Agoff M.D., Patricia Lin M.P.H., Janice Mo-rihara B.S. et al. // Human Pathol.- 2005.- Vol.36. -P.82-90
14. Cervical squamous dysplasias and carcinomas with immunodetectable p53 frequently contain HPV / Mittal K.R., Lin O., Chan W. et al. // Gynecol. Oncol.-1995.- Vol.58.- P.289-294.
15. Characterization of human papillomavirus infection, P53 and Ki-67 expression in cervix cancer of Mo-zambican women / Carrilho C., Gouveia P., Cantel M. et al. // Pathol. Res. Pract.- 2003.- Vol.199.- P.303-311.
16. Ciardiello F., Tortora G. A novel approach in the treatment of cancer: targeting the epidermal growth factor receptor // Clin. Cancer Res.- 2001.- Vol.7.- P.2958-2970.
17. Co-existence of low and high grade squamous intraepithelial lesions of the cervix: morphologic progression or multiple papillomaviruses / Park J.P., Sun D., Genest D.R. et al. // Gynecol. Oncol.- 1998.- Vol.70.-P.386-391.
18. Co-existent carcinosarcoma and adenoid basal carcinoma of the uterine cervix and correlation with human papillomavirus infection / Y. Takeshima, V.J. Ama-tya, F. Nakayori et al. // Int. J. Gynecol. Pathol.- 2002.-Vol.21.- P.186-190.
19. Comparative analysis of human papillomavirus infections in cervical scrapes and biopsy specimens by general SPF10 PCR and HPV genotyping / Quint W.G.V., Scholte G., van Doom L.J. et al. // J. Pathol.-2001.- Vol.194.- P.51-58.
20. Evaluation of p16INK4a and pRb expression in cervical squamous and glandular neoplasia / Tringler B., Gup C.J., Singh M. et al. // Human Pathol.- 2004.-Vol.35, N6.- P.689-696.
21. Expression of cyclin-dependent kinase inhibitors p16MTS1, p21WAF1, and p27KIP1 in HPV-positive and HPV-negative cervical adenocarcinomas / Milde-Langosch K., Riethdorf S., Kraus-Poppinghaus A. et al. // Virchows Arch.- 2001.- Vol.439.- P.55-61.
22. Expression of p16, Rb, and p53 Proteins in Squamous Cell Carcinomas of the Anorectal Region Harboring Human Papillomavirus DNA / Danielle W. Lu, Samir K., El-Mofty, Hanlin L. Wang // Modern Pathol.- 2003.-Vol.16.- P.692 - 699
23. Expression of p16INK4a and Rb genes in cervical neoplasm / Wong Y.F., Cheung T.K., Chung T.K.H. et al. // J. Lower Genital Tract Dis.- 1997.-Vol.1.- P.240-244.
24. Expression of protein marker p16INK4a in uterine cervical cancer / Volgareva G.M., Zavalishina L.E., Frank G.A. et al. // Arch. Patol.- 2002.- Vol.64,N1.- P.22-24.
25. Expression status of p16 protein is associated with human papillomavirus oncogenic potential in cervical and genital lesions / Sano T., Oyama T., Kashi-wabara K. et al. // Am. J. Pathol.- 1998.- Vol.153.-P.1741-1748.
26. Human papillomavirus DNA testing for cervical cancer screening in low-resource settings / Kuhn L., Denny L., Pollack A. et al. // J. Nat. Cancer Inst.- 2000.-Vol.92. - P.818-825.
27. Human papillomavirus genotyping and p16INK4a expression in cervical intraepithelial neoplasia of adolescents / Hu L., Guo M., He Z., Thornton J. et al. // Modern Pathol.- 2005.- Vol.18,N2.- P.267-73.
28. Human papillomavirus type, proliferative activity, and p53: potential markers of aggressive papillomatosis / Rabah R., Sakr W., Thomas R. et al. // Clin. Cancer Res.- 2001.- Vol.7.- P.3988-3993.
29. Human papillomaviruses of different types in precancerous lesions of the uterine cervix: histologic, im-munocytochemical and ultrastructural studies / Kadish A.S., Burk R.D., Kress Y. et al. // Human Pathol.- 1986.-Vol.17.- P.384-392.
30. Immunohistochemical detection of the cyclin-dependent kinase inhibitor 2/multiple tumor suppressor gene 1 (CDKN2/MTS1) product p16INK4a in archival human solid tumors: correlation with retinoblastoma protein expression / Geradts J., Kratzke R., Niehans G.A., Lincoln C.E. // Cancer Res.- 1995.- Vol.55.- P.6006-6011.
31. Immunohistochemical staining with MIB1, bcl-2 and p16 assists in the distinction of cervical glandular intraepithelial neoplasia from tubo-endometrial metaplasia, endometriosis and microglandular hyperplasia / Cameron R.l., Maxwell P., Jenkins D., McCluggage W.G. // Histopathology.- 2002.- Vol.41.- P.313-21.
32. Inhibition of cyclin D-CDK4/CDK6 activity is associated with an E2F-mediated induction of cyclin kinase inhibitor activity / Khleif S.N., DeGregori J., Jee C.L. et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1996.- Vol.93.-P.4350-4354.
33. Ki-67, cyclin E and pl6l4K4A are complimentary surrogate biomarkers for human papilloma virus-related cervical neoplasia / Keating J.T., Cviko A., Riethdorf S., et al. // Am. J. Surg. Pathol.- 2001.- Vol.25.- P.884-891.
34. Kirsch. D. G., Kaslan. M. B. Tumor-suppressor p53: implications for tumor development and prognosis // J. Clin. Oncol.- 1998.- Vol.17.- P.3158-3168.
35. Overexpression of p16 and p14ARF is associated with human papillomavirus infection in cervical squamous cell carcinoma and dysplasia / Sano T., Masuda N., Oyama T., Nakajima T. // Pathol. Int .- 2002.- Vol. 52.-P.375-83.
36. Overexpression of p16(INK4A) as a specific marker for dysplastic and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri / Klaes R., Friedrich T., Spitkovsky D. et al. // Inter. J. Cancer.- 2001.- Vol.92,N2.- P.276-284.
37. P16INK4a as a marker for cervical dyskaryosis: CIN and cGIN in cervical biopsies and Thin Prep smears / Murphy N., Ring M., Killalea A.G. et al. // J. Clin. Pa-thol.- 2003.- Vol.56.- P.56-63
38. P16INK4a expression correlates with degree of cervical neoplasia: a comparison with Ki-67 expression and detection of high-risk HPV types / Agoff S.N., Lin P., Morihara J. et al. // Modern Pathol.- 2003.- Vol.16.-P.665-673.
39. p53 gene mutations in cervix carcinoma / Tashiro H., Isacson C., Levine R. et al. // Am. J. Pathol.- 1997.-Vol.150.- P.177-185.
40. Procedure for immuno-cytochemical detection of P16INWA antigen in thin-layer, liquid-based specimens / Bibbo H., Klump W.J., De Cecco J., Kovatich A. // Acta. Cytol.- 2002.- Vol.46.- P.25-9.
41. Protocol for immunocytochemical detection of SIL in cervical smears using MIB-1 antibody to Ki-67 /
van Hoeven K.H., Kovatich A.J., Oliver R.E. et al. // Modern Pathol.- 1996.- Vol.9.- P.407-412.
42. Rb and p16INK4a expression in resected non-small cell lung tumors / Kratzke R.A., Greatens T.M., Rubins J.B., Maddaus M.A. et al. // Cancer Res.- 1996.-Vol.56.- P.3415-3420.
43. Relations between the expression of P53, c-erbB-2, ki-67 and HPV infection in cervical carcinomas and cervical dysplasias / Bar J.K., Harlozinska A., Sedlaczek P. et al. // Anticancer Res.- 2001.- Vol.21.- P.1001-1006.
44. Ruas M., Peters G. The p16INK4a/CDKN2A
tumor suppressor and its relatives: [review] // Biochim. Biophys. Acta.- 1998.- Vol.1378.- P.115-177.
45. Tam S.W., Shay J.W., Pagano M. Differential expression and cell cycle regulation of the cyclin-depen-dent kinase 4 inhibitor p16INK4a // Cancer Res.- 1994.-Vol.54.- P.5816-5820.
46. The genotypes and prognostic significance of human papillomaviruses in cervical cancer / Chen T. M., Chen C. A., Wu C. C. et al. // Inter. J. Cancer.- 1995.-Vol.57.- P.181-184.
УДК: 616-002:616.8-009.62:615.212.3:615.276:615.038]-092.9
О.В. Макаренко, ВИВЧЕННЯ АНАЛЬГЕТИЧНО1 ТА
ПРОТИЗАПАЛЬНО1 АКТИВНОСТ1 НОВИХ ПОХ1ДНИХ НОРБОРНЕНУ
В.Й. Мамчур
Дтпропетровська державна медична академiя кафедра фармакологи та клiнiчноi фармакологи (зав. - д. мед. н., проф. В.Й.Мамчур)
Ключовi слова: анальгезгя, запалення, бшь, пох1дт норборнену, диклофенак натрт та парацетамол
Key words: analgesia, inflammation, pain, norbornen derivatives, dyclophenak natrium and paracetamolum
Резюме. На основании результатов фармакологических исследований определили достаточно высокую анальгетическую способность новых производных норборнена в условно терапевтических дозах (1/10 ЛД50) снижать ответную болевую реакцию при электрораздражении корня хвоста у крыс и снижать количество корчей у мышей, вызванных химическим агентом, а именно, 0,6% раствором уксусной кислоты. Тем самым выявлена у них способность влиять как на центральный, так и на периферический компонент формирования болевой реакции. По анальгетической активности производные норборнена сопоставимы с таким ведущим нестероидным противовоспалительным средством (НПВС), как диклофенак натрия, и ненаркотическим анальгетиком (ННА) парацетамол. Также в сравнении с известными классическими неопиоидными анальгетиками новые соединения ряда норборнена проявили противовоспалительную активность на модели экспериментального экссудативного воспаления, вызванного 1% раствором кар-рагенина.
Summary. Based on the results of pharmacologic investigation it was determined a reliably high analgesic ability of the new norbornen derivatives in conditionally-therapeutic doses (1/10 LD50) to decrease response pain reaction in electrically-induced irritation of tail root in the rats and to decrease the number of writhes caused by a chemical agent, namely by 0,6% vinegar acid solution. Thereby the ability to affect both central and peripheral component of forming of pain reaction in them was revealed. In analgesic activity norbornen derivatives are comparable with such leading nonsteroid antinflammatory drug (NSAD) as natrium dyclophenak and paracetamolum, a non-narcotic analgetic (NNA). As compared to well-known classic nonopioid analgetics the new combinations of norbornen row showed antiinflammatory activity on the model of experimental excudative inflammation, caused by 1% solution of carragenin.
У даний час неошо!дш анальгетики, а саме нестеро!дш протизапальш засоби (НПВС) i не-наркотичш анальгетики (ННА), належать до числа найважливших «симптоматичних» лшарських засобiв, як широко застосовуються практично у
bcíx роздшах медицини. Це визначаеться уш-кальним поеднанням протизапальних, анальге-тичних, жарознижувальних та антитромботичних властивостей, що перекривають майже весь спектр основних симптомiв, характерних для
