CC BY
116
УДК 618.11-006.6-091.8
ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ 0-КАТЕНИНА
ПРИ РАКЕ ЯИЧНИКОВ
А.В. Шульга, В.А. Басинский, С.Э. Савицкий, О.Е. Кузнецов УО «Гродненский государственный медицинский университет» УОЗ «<Гродненская областная клиническая больница»
В 65 случаях первичного рака яичников иммуногистохимическим методом изучена экспрессия fi-катенина. Выявлена зависимость уровня экспрессии от степени дифференцировки, стадии FIGO, наличия метастазов и пятилетней выживаемости.
Ключевые слова: рак яичников, иммуногистохимия, fi-катенин, прогноз.
Expression of ¡5-catenin was investigated with immunohistochemical method in 65 cases of primary ovarian carcinoma. в-catenin levels depended on the degree of cell differentiation, FIGO stage, presence of metastases andfive-year survival. Key words: ovarian cancer, immunohistochemistry, ¡3-catenin, prognosis.
Введение
Одним из перспективных направлений оценки инва-зивного и метастатического потенциала новообразований является изучение взаимодействия клеток между собой и с внеклеточным матриксом, которое регулируется молекулами клеточной адгезии. К важнейшим из них относятся кадхерины и связанные с ними катенины, ин-тегрины, адгезионные молекулы из суперсемейства иммуноглобулинов, селектины, клеточный детерминант CD 44 [1]. Особый интерес на сегодняшний день представляет ß-катенин, поскольку, помимо влияния на адгезивные свойства клетки, он активно участвует и в других процессах, включая клеточный цикл и пролиферацию. Ген ß-катенина CTNNB1 локализован в 3p21 хромосоме, молекулярный вес этого многофункционального внутриклеточного протеина составляет 92 kDa. В клетке он присутствует в трех формах: мембранной, цитоплазматической и ядерной. В мембране ß-катенин формирует адгезивный комплекс с Е-кадхерином и актиновым цитоскеле-том с участием а-катенина [8, 11]. Известно, что ß-кате-нин является важным компонентом типичного (канонического) Wnt-сигнального пути [13]. Цитозольный пул, не связанный с Е-кадхерином, очень нестабилен и при отсуствии Wnt сигнала происходит фосфорилирование ß -катенина с участием мультимолекулярного комплекса, который включает в себя GSK-3ß (glycogen synthase kinase 3ß), СК1а (casein kinase 1а), структурный белок аксин и опухолевый супрессор АРС (adenomatosis polyposis coli). Данный протеин, включенный в этот комплекс, фосфорилированный GSK-3ß и СК1а, затем расщепляется убиквитиновыми протеосомами [15], но при активации Wnt-пути сигнальной трансдукции происходит ингибирование разрушения ß-катенина и он транспортируется в ядро, где в составе комплекса TCF/LEF (T cell factor/Leucocyte enhancer factor) активирует транскрипцию гена циклина D1 и супрессирует ген CDH1 [17]. Результат этих взаимодействий - редукция Е-кадхерин-зависимой адгезии и пролиферация. При заживлении язв, например, пролиферирующая клеточная популяция с редуцированной клеточной адгезией будет замещать разрушенный эпителий, а в опухолях - определять злокачественный фенотип [1]. Исследования последних лет доказывают, что ß-катенин играет принципиальную роль в канцерогенезе. В 80% колоректального рака нарушение экспрессии ß-катенина связано с мутацией в гене АРС [12], а также в самом гене CTNNB1 и AXIN1. Подобные мутации также обнаружены при меланоме, гепатоцел-люлярной карциноме, раке тела матки и других опухолях.
Сведения о ß-катенине и его участии в Wnt-сигналь-ном пути при раке яичников (РЯ) немногочисленны и противоречивы. Некоторыми авторами подтверждается плохой прогноз новообразования, а также связь с его клинико-морфологическими параметрами при снижении экспрессии ß-катенина [7, 9, 14]. Вместе с тем, в других исследованиях не было найдено взаимосвязи между гистологическим типом, степенью дифференцировки, метастатическим потенциалом и данным маркером [5, 6, 10]. Интересно, что прогностическое значение ядерной экспрессии ß-катенина оценивается по-разному: имеются данные как об ухудшении исхода заболевания [4], так и о благоприятном прогнозе у больных [2]. Некоторыми исследователями сообщается о цитоплазмати-ческой гиперэкспрессии данного протеина в злокачественных аденокарциномах, по сравнению с доброкачественными опухолями яичников [16]. Таким образом, сведения о важной роли ß-катенина в осуществлении межклеточной адгезии и Wnt-сигнальном пути, а также противоречивость данных о его прогностической значимости при РЯ диктует необходимость дальнейшего изучения этого биомолекулярного маркера.
Цель исследования: провести сравнительный анализ экспрессии ß-катенина опухолевыми клетками в РЯ разных гистологических типов, степени дифференцировки и клинической стадии.
Материал и методы
Исследование выполнено на архивном гистологическом материале 65 больных, оперированных по поводу РЯ в Гродненском областном онкологическом диспансере в период с 1999 по 2002 гг. Анализ гистологических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, проводился согласно классификации ВОЗ (2003).
Наиболее частым гистологическим типом РЯ был серозный (72,3%), в 8 наблюдениях выявлена эндометри-оидная аденокарцинома, а также по 5 случаев муциноз-ного и светлоклеточного вариантов новообразования. При этом в 13 случаях степень дифференцировки рака была отнесена к G1, в 32 - к G2, а в 20 - к G3. Первая стадия, согласно классификации FIGO, была установлена у 23,1% женщин, вторая - у 16,9%, а генерализация процесса наблюдалась в 60% случаев (третья стадия - 52,3%, четвертая - 7,7%). Общая пятилетняя выживаемость в исследуемой группе составила 26,15%.
Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование материала проводили на парафиновых срезах по стандартной методике с использованием антител к ß-катенину (ß-Саtenin-1, 1 : 200, «Dako»). Демаскировку антигена осу-
Журнал ТрТМУ2009 № 3
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ществляли при 98°С в водяной бане в течение 40 мин., применяя цитратный буфер рН=6,1. В качестве детекци-онной системы использовали Еп\^юп с ДАБ-хромоге-ном. Проводились положительные и отрицательные контрольные реакции.
Оценка мембранной экспрессии р-катенина проводилась полуколичественно в 6 случайных полях зрения при увеличении 400 по методике, предложенной С. Gamallo и соавторами [3]. Результаты ИГХ реакций оценивали, исходя из процента и интенсивности положительно окрашенных опухолевых клеток. Процент (п) положительно окрашенных клеток отражал степень экспрессии маркера, выраженную в баллах (отсутствие экспрессии или окрашено менее 5% клеток - 0 баллов, п менее 25% -1 балл, п от 26% до 50% - 2 балла, п от 51% до 75% - 3 балла и п более 75% - 4 балла). Критерии балльной оценки степени интенсивности окрашивания: отсутствие реакции - 0 баллов, слабое окрашивание -1 балл, умеренная и выраженная реакция - 2 и 3 балла, соответственно. Кроме того, при учете реакций с антителами к р-катени-ну отдельно оценивались цитоплазматический и ядерный тип окрашивания (при наличии более 5% окрашенных клеток).
Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программы Statistica 6.0.
Результаты и обсуждение
Анализ данных ИГХ исследования показал, что положительная реакция с антителами к р-катенину выявлена в 59 случаях РЯ, а ее отсутствие наблюдалось в 6 опухолях. При этом в подавляющем большинстве наблюдений преобладала мембранно-цитоплазматическая экспрессия р-катенина, в 7 новообразованиях обнаружено только цитоплазматическое окрашивание, а в 4 эндометрио-идных аденокарциномах с плоскоклеточной метаплазией I клинической стадии выявлялась ядерная экспрессия р-катенина, в 1 серозном раке также имелась ядерная локализация продуктов реакции с данными антителами, но она была в менее 5 % клеток.
К особенностям экспрессии р-катенина также следует отнести большую степень ее мембранной выраженности в муцинозных аденокарциномах, где она меньше зависела от степени дифференцировки опухоли.
По проценту клеток, экспрессирующих р-катенин в мембране, опухоли распределились следующим образом: в 19 наблюдениях окрашивалось от 5 до 25% (1 балл), в 24 - от 26 до 50% (2 балла), в 7 - от 51% до 75% (3 балла), в 2 случаях - более 75% клеток. В большинстве наблюдений (52,5%) в аденокарциномах доминировала умерен-
ная интенсивность окраски, в 20 случаях (33,9%) преобладала слабая интенсивность окрашивания, в 8 случаях (13,6%) - выраженная. Сохранение мембранного типа экспрессии и высокая степень ее выраженности были более характерны для высокодифференцированных аде-нокарцином. В РЯ с низкой степенью дифференцировки реакция с антителами к данному антигену характеризовалась преобладанием цитоплазматической локализации, неравномерной распространенностью и слабовыражен-ной интенсивностью окрашивания. Результаты теста Крускала-Уоллиса (рис. 1а) свидетельствовали о наличии статистически значимой связи между экспрессией ß-катенина и степенью дифференцировки РЯ (H=7,4, p=0,025).
Также установлено, что уровень экспрессии ß-катенина в злокачественных новообразованиях яичников достоверно зависит от клинической стадии (FIGO) (рис. 1б).
Из рисунка 1б видно, что в I стадии 75% аденокарци-ном характеризовались величиной экспрессии 3 и более баллов, такой же процент опухолей в IV стадии был оценен 3 и менее баллами (тест Крускала-Уоллиса: H=8,95, p=0,03).
Существенные различия в экспрессии ß-катенина были обнаружены между группами больных с наличием и отсутствием метастазов. Чаще отсутствие белка отмечалась при наличии отдаленных метастазов, которые обнаружены у 14 женщин (21,5%). Сохранение мембранного окрашивания клеток РЯ было более характерно для группы пациентов без метастазов (тест Крускала-Уолли-са: H=10,98, p=0,0041). В 100% случаев при наличии отдаленных метастазов и в 75% - регионарных метастазов интенсивность экспрессии ß-катенина в клетках опухоли была 4 и менее баллов (рис. 2а). При отсутствии метастазов в 75% случаев она оценивалась в 4 и выше баллов.
Исследование общей пятилетней выживаемости больных РЯ с помощью метода Каплана-Мейера (рис. 2б) показало, что в группе пациентов с выраженной мембранной экспрессией ß-катенина (5-7 баллов) отмечалось более благоприятное течение заболевания, чем в группе с отсутствием или редуцированной реакцией с данными антителами (p=0,008).
Заключение
Приведенные данные свидетельствуют о самостоятельном прогностическом значении экспрессии ß-кате-нина клетками рака яичников, ее высокой информативности для определения метастатического потенциала и прогноза новообразования.
Преобладание мембранно-цитоплазматической экспрессии ß-катенина и небольшой процент случаев с толь-
Рисунок 1 - Взаимосвязь уровня экспрессии Р-катенина в раковых клетках с дифференцировкой новообразования (а) и
его клинической стадией (б)
Рисунок 2 - Связь уровня экспрессии Р-катенина в раковых клетках с развитием метастазов (а) и общей 5-летней выживаемостью (б) (пунктирная линия характеризует выживаемость при оценке экспрессии р-катенина 5-7 баллов,
непрерывная - 0-4 балла)
ко цитоплазматической или ядерной экспрессией свидетельствует о ведущей роли в прогнозе новообразования нарушения свойств межклеточной адгезии, которая обеспечивается р-катенином в комплексе с Е-кадхерином. Вместе с тем, полученные данные не позволяют отрицать существенную роль р-катенина в Wnt-сигнальном пути и его влияние на клеточный цикл.
В наблюдениях эндометриоидного рака яичников имеет место ядерная экспрессия р-катенина, которая связана с относительно благоприятным прогнозом.
Литература
1. Введение в молекулярную биологию канцерогенеза: учеб. пособие / А.А. Новик [и др.]; под ред. Ю. Л. Шевченко. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 224 с.
2. B-catenin expression, DNA ploidy and clinicopathological features in ovarian cancer: a study in 253 patients / W. Kildal [et al.] // European journal of cancer. - 2005. - Vol. 41. - P. 1127-1134.
3. B-Catenin expression pattern in stage I and II ovarian oarcinomas relationship with р-catenin gene мutations, clinicopathological features, and clinical outcome / C. Gamallo. [et al.] // American Journal of Pathology. - 1999. - Vol. 155. - P. 527536.
4. Beta-catenin nuclear localization is associated with grade in ovarian serous carcinoma / C.M. Lee [et al.] // Gynecol. Oncol. -2003. - Vol. 88. - P. 363-368.
5. Elevated expression of E-cadherin and alpha-, beta-, and gamma-catenins in metastatic lesions compared with primary epithelial ovarian carcinomas / T. Imai [et al.] // Hum. Pathol. - 2004. -Vol. 35. - P. 1469-1476.
6 . Expression of E-cadherin and beta-catenin in primary and peritoneal metastatic ovarian carcinoma / T. Fujioka [et al.] // Oncol. Rep. - 2001. - Vol. 8. - P. 249-255.
7. Faleiro-Rodrigues, C. Title-loss of р-catenin is an independent prognostic factor in ovarian carcinomas: а multivariate analysis / C. Faleiro-Rodrigues, I. Macedo-Pinto, D. Pereira // Gene Ther. and Mol. Biol.- 2006. - Vol. 10. - P. 179-184.
8. Hirohashi, S. Cell adhesion system and human cancer morphogenesis / S. Hirohashi, Y. Kanai // Cancer Sci. - 2003. - Vol. 94. - P. 575-581.
9 . Immunoexpression of Beta-catenin-E-cadherin complex in primary serous ovarian tumors / P. Stawerski [et al.] // Pol. J. Pathol.
- 2008. - Vol. 59. - P. 27-32.
1 0 . Immunohistochemical patterns for alpha- and beta-catenin, E- and N-cadherin expression in ovarian epithelial tumors / F.R Marques [et al.] // Gynecol. Oncol. - 2004. -Vol. 94. - P. 16-24.
11. Mareel, M. Clinical, Gellular, and мolecular аspects of Gancer invasion / M. Mareel, A. Leroy // Physiol. Rev. - 2003. - Vol. 83. -P. 337-376.
1 2 . Mutational analysis of the APC/beta-catenin/Tcf pathway in colorectal cancer / A.B. Sparks [et al.] // Cancer Res. -1998. - Vol. 58. - P. 1130-1134.
1 3 . Paul, S. Wnt signaling and cancer development: therapeutic implication / S. Paul, A. Dey // Neoplasma. - 2008. - Vol. 55. - P. 165-176.
1 4. Prognostic significance of E-cadherin-catenin complex in epithelial ovaian cancer / K.A. Voutilainen [et al.] // J. Clin. Pathol. -2006. - Vol. 59. - P. 460-467.
15. Wnt4 inhibits в-catenin/TCF signalling by redirecting р-catenin to the cell membrane / P. Bernard [et al.] // Biol. Cell. - 2008.
- Vol. 100. - P. 167-177.
16. Xiao, L. Expression of beta-catenin and APC protein in ovarian epithelial tumor and its implication / L. Xiao, Li Yu, Mi Can // Chin. J. of Canc. Res. - 2007. - Vol. 19. - P. 72-75.
17. Xu, W. Mechanistic insights from structural studies of р-catenin and its binding partners / W. Xu, D. Kimelman // Journal of Cell Science. - 2007. - Vol. 120. - P. 3337-3344.
Поступила 10.02.09
