CC BY
62
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ СЫВОРОТОЧНЫХ... 1G3
УДК 616-006.81-036:615.373:577.112 Н.В. Голубцова1, И.Н. Михайлова1, В.В. Новиков2, КА. Парсункова3, И.В. Самойленко1,
Н.Н. Петенко1, Е.В. Огородникова1, В.Н. Тазаев1, ЕА. Черемушкин1, КА. Барышников1,
Е.В. Коржевская1, Н.Б. Преснякова2, Г.З. Чкадуа1, Л.В. Демидов1, А.Ю. Барышников1 ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ СЫВОРОТОЧНЫХ УРОВНЕЙ РАСТВОРИМЫХ МОЛЕКУЛ HLA I КЛАССА И
АНТИГЕНА CD8 У БОЛЬНЫХ ДИССЕМИНИРОВАННОЙ МЕЛАНОМОЙ
гРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород 3ГУП «МНКЦ «Интермедбиофизхим»», Москва
Контактная информация:
Голубцова Наталья Валерьевна, научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(499)612-96-16; e-mail: [email protected]
Статья поступила: 16.09.2010, принята к печати 01.11.2010.
Резюме
Исследовано относительное содержание S-100 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии дендритными клетками. В зависимости от исходных уровней пациенты делились на две группы (с повышенными значениями и пониженными значениями сывороточного уровня S-100) относительно показателей в контрольной группе доноров. Проведенный анализ выживаемости выявил статистически значимые различия в выживаемости больных в зависимости от начального уровня относительного содержания S-100 в образцах сыворотки крови пациентов в обеих группах. Медиана выживаемости пациентов с исходно повышенными значениями S-100 составила 22,0+7,8 мес. В группе с пониженными значениями S-100 медиана выживаемости составила 54,0+25,2 мес. (р=0,045). В сыворотке крови больных с исходно повышенным уровнем растворимых молекул HLA I класса и пониженным растворимым антигеном CD8 выявлено менее интенсивное повышение уровня S-100, чем у больных с пониженным изначально сывороточным содержанием растворимой формы HLAI и повышенным растворимым CD8, у которых. отмечено более значительное повышение сывороточного уровня S-100 в ходе вакцинотерапии дендритными клетками. Изменение сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса и антигена CD8 является прогностически значимым.
Ключевые слова: меланома белок S-100 , иммунная система, дендритные клетки, растворимые антигены.
N.V. Golubzsova1,I.N. Mikhailova1, V. V Novicov2, K.A. Parsunkova3,1.V. Samoylenko1, N.N. Petenko1, E.V. Ogorodnikova1, V.N. Tazaev1, E.A. Cheriomychkin1, K.A. Baryshnikov1, Е.V. ^rzhevskaya1, N.B. Presniakova2, G.Z. Chkadua1, L.V. Demidov1, A.Yu. Baryshnikov1 PROGNOSTIC SIGNIFICANT
OF SOLUBLE MHC I SERUM LEVEL AND CD8 ANTIGEN 1IN PATIENTS WITH DISSEMINATED MELANOMA
1N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
2Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod
3«Intermedbiophyshem», Moscow
Abstract
In this study we have estimated the serum level of S-100 marker in patients with disseminated melanoma during dendritic cell vaccination. Before vaccinotherapy, the patients were divided into two subgroups with high and low level of S-100 marker in compare with healthy donors. Median survival of patients with high level of S-100 marker were 22,0±7,8 months, whereas in group with low level of S-100 marker median survival were 54±25,2 months (p=0,045 ). We have observed that S-100 marker level increased in less degree in seum of patients with initial high level of soluble MHC I class molecule and high level of soluble CD8 during dendritic cell vaccination. The data obtained indicate that the alteration in MHC I class molecule and CD8 antigen level in patents with disseminated melanoma treated with dendritic vaccine could be considered of prognostic significance.
Key words: melanoma, S-100, immune system, dendritic cells.
Введение
Клетки иммунной системы характеризуются большим разнообразием поверхностных антигенов, экспрессирующихся на разных этапах гемопоэза и характеризующих направление дифференцировки. Поверхностные антигены являются маркерами различных клеточных популяций. Тридцать лет назад было обнаружено, что у белков, присутствующих на мембране клеток иммунной системы, могут быть
растворимые гомологи. Последние обнаруживаются в биологических жидкостях, в том числе - в крови в разных концентрациях [9; 11].
Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы образуются путем шед-динга (протеолитическое отщепление с мембраны клетки) или альтернативного сплайсинга матричной РНК, приводящего к образованию укороченного транскрипта, соответствующего растворимой форме мембранного антигена.
Растворимые формы мембранных антигенов участвуют в регуляции иммунологических механизмов на разных этапах реализации иммунного ответа [2; 11]. Они выступают в роли межклеточных коммуникаторов, связываясь с лигандами мембранных гомологов на поверхности клеток. В норме растворимые формы мембранных антигенов находятся в равновесном состоянии. Изменения их концентрации в крови и других биологических жидкостях организма обнаружены при различных нарушениях гомеостаза, что отражает активность патологических процессов, протекающих в организме [9; 11]. В настоящее время охарактеризовано более 240 диффе-ренцировочных антигенов лейкоцитов, классифицированных на международных семинарах [10].
Антигены главного комплекса гистосовместимости, как и многие другие мембранные белки клеток иммунной системы, имеют растворимые формы. Экспериментально показано, что растворимые молекулы HLA I класса модулируют реактивность Т-клеток и стимулируют апоптоз in vitro. Так, сывороточный HLA I класса может связываться с 008-молекулами на поверхности цитотоксических Т-клеток, препятствуя распознаванию презенти-руемых антигенных пептидов и вызывая продукцию растворимого Fas-лиганда. Секретирующийся растворимый Fas-лиганд, выступая в роли ауток-ринного фактора, способен взаимодействовать с мембранным Fas (0095) антигеном на этих же клетках с последующей инициацией апоптоза цито-токсических 008- положительных Т-лимфоцитов. Кроме того, растворимые молекулы HLA I класса способны вызвать апоптотическую гибель натуральных киллеров, которые, подобно 008+ цито-токсическим Т-лимфоцитам, служат важными эффекторами противоопухолевого иммунитета [7; 9; 11; 16; 17].Растворимую форму сывороточного HLA-1 секретируют in vivo как Т- так и В-лимфоциты. Увеличение концентрации сывороточного HLA I происходит в случаях, когда активированы популяции Т-лимфоцитов. Изменение сывороточного уровня растворимых молекул HLA I класса наблюдается в организме человека при различных патологиях. Высокая концентрация растворимых молекул HLA I класса и растворимого Fas-лиганда обнаружены в крови больных ОМЛ [15]. Получены данные о повышении уровня растворимой формы HLA I, 008-антигена, а также комплекса HLA-I-008 при ХМЛ у пациентов, получавших препараты Р-интерферона в качестве предшествующей Гливеку™ терапии [7]. Уровень сывороточного HLA I является важным показателем для мониторинга больных после трансплантацией костного мозга. Увеличение уровня растворимых молекул HLA I выявлено при остром и хроническом гепатите [11]. Выявлено пониженное по сравнению с нормой содержание сывороточного HLA I у больных инсулинзависимым сахарным диабетом, изменения сывороточного содержания HLA I при инфекционных заболеваниях урогенитального тракта. Изменения в сывороточном уровне HLA I обнаружены при ожоговой и черепно-мозговой травме [11]. Установлено, что развитие рака легкого сопровождается понижением растворимых молекул HLA I класса [1]. Выявлено снижение повышенного сывороточного HLA у больных раком молочной железы на фоне озонотерапии совместно с ПХТ [1]. Уровни молекул HLA I класса повышены у пациентов, страдающих ЛХ и НХЛ. Обнаружено снижение сывороточного HLA I при раке желудка по мере прогрессирования заболевания [11].
Ранее мы показали изменение сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса и растворимого антигена 008 у больных диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками [6].
008-антиген является поверхностным гликопротеином, найденным на мембране большинства цитотоксических Т-лимфоцитов и части натуральных киллеров. Он обеспечивает эффективное взаимодействие клеток при презентации антигенов цитотоксическим Т-лимфоцитам, является коре-цептором Т-клеточного рецептора и обеспечивает распознавание антигенов, презентируемых в контексте молекул главного комплекса системы гистосовместимости I класса. Растворимый 008-антиген продуцируется активированными 008+ цитотокси-ческими клетками. Сывороточный уровень растворимого 008-антигена служит маркером активации цитотоксических клеток. В то же время, взаимодействуя с молекулами HLA I класса, он тормозит цитотоксическое действие клеток, препятствуя их активации и пролиферации. Обнаружено повышение растворимого 008-антигена в сыворотке крови при ВИЧ-инфекции. Повышение сывороточного уровня 008 отмечено при тяжелой механической травме. Изменения сывороточного уровня растворимого антигена 008 обнаружены при многих он-когематологических заболеваниях [9; 11].
В мониторинге онкологических больных активно используются онкомаркеры. Определение их уровня до и после проведения операции, в процессе лечения может помочь выявить рецидив, определить прогноз заболевания, ответ на проводимую терапию. Одним из сывороточных маркеров меланомы является недавно описанный опухолеассоциированный антиген S-100 [12; 14; 18]. S-100 белки представляют собой суперсемейство 0a2+-связывающих белков, которые обнаружены в клетках различных тканей. Они активно участвуют в процессах клеточного2+ деления, дифференцировки, гомеостаза ионов 0a2+, проведении внутриклеточного регуляторного сигнала апоптоза.
Увеличение уровня S-100 в спинномозговой жидкости и плазме является маркером повреждения головного мозга. Рост концентрации белка S-100 в сыворотке крови был обнаружен при глиоме, меланоме, нейробластоме. Установлено, что при меланоме белок S-100 проявляет свойства стадиеспеци-фичности, его средние (по группам) значения растут с уровнем инвазии и размером первичного опухолевого очага [12; 13]. Уровень S-100 также коррелирует с числом пораженных органов, наличием метастазов в печени или кости и ответом на химио-или иммунотерапию.
Целью настоящего исследования явилось изучение корреляции между сывороточным содержанием растворимой молекулы HLA I класса, растворимого антигена 008 и белка S-100 как маркера прогрессии опухоли в ходе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками.
Материалы и методы
Материалом для исследования служили образцы сывороток крови больных диссеминированной меланомой (n = 55), полученные до начала вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками и после 5 введения вакцины (интервалы между вакцинациями - 1 мес.). В качестве контроля использовались образцы сывороток крови здоровых доноров (n = 15).
В процессе вакцинотерапии дендритными клетками у всех пациентов был проведен анализ сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса, антигена CD8 и растворимого комплекса HLA-I-CD8 [6].
На основании исходных сывороточных уровней растворимых антигенов, больные диссеминированной меланомой (n=55) , получавшие вакцину, были разделены на две ограниченные группы.
Группу 1 составили пациенты с повышенным начальным уровнем растворимых антигенов в сыворотке крови, а группа 2 состояла из больных с исходно пониженным сывороточным уровнем растворимых антигенов [6].
В качестве лечебного препарата применялась противоопухолевая вакцина на основе аутологичных дендритных клеток (ДК), нагруженных аутологичным опухолевым лизатом.
Определение сывороточного уровня белка S-100 (S-100 A1B и S-100 BB формы) проводилось иммуноферментным методом с использованием диагностической тест-системы CanAg Diagnostics (Швеция). Учет результатов проводился спектрофотометрически при длине волны 405 нм. Результаты выражали в нг/мл.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием методов описательной статистики.
Результаты считались статистически достоверными при уровне значимости р < 0,05. Расчет выживаемости проводили методом Каплан-Майер. Сравнение кривых выживаемости проводили с помощью log-rank критерия, статистический анализ -с помощью пакета программ EXCEL 2003, STATIS-TICA 6.0 и SPSS 13.0.
Результаты и обсуждение
Перед началом вакцинотерапии среднее значение уровня S-100 в сыворотке крови всех больных диссеминированной меланомой (n=55) составляло 95,66+74,64 нг/мл и в ходе лечения достоверно повысилось до 136,83+139,68 нг/мл (р < 0,05). Среднее значение для S-100 в контрольной группе доноров (n=15) составило 69,40+9,84 нг/мл.
Однако значения сывороточного содержания исследуемого антигена у всех пациентов (n=55) колебались от 7,1 до 809,6 нг/мл при нормальных значениях в контрольной группе доноров 69,40+9,84 нг/мл. Мы проанализировали полученные результаты и перевели их в относительные в зависимости от нормы (контроль).
В качестве контроля было принято среднее значение исследуемого показателя S-100 в группе здоровых доноров - 69,40+ 9,84 нг/мл. Относительное содержание сывороточного уровня (СУ) маркера S-100 рассчитывали по формуле:
Су _ (опыт - контроль) Ю0 контроль
В зависимости от исходного уровня относительного содержания S-100 в образцах сыворотки крови всех пациентов (n=55) относительно контроля (среднее значение исследуемого показателя в группе здоровых доноров) больные были разделены на 2 группы. Группу 1 составили пациенты с изначально повышенным относительным содержанием исследуемого показателя в сыворотке крови, а группу 2 -больные с пониженным содержанием уровня S-100
относительно средних значений данного маркера в сыворотке крови здоровых доноров (табл. 1).
Анализ относительного содержания S-100 выявил, что исходный уровень маркера у пациентов группы 1 (n=24) был достоверно повышен в 2 раза по сравнению с контролем (здоровые доноры) и достоверно повысился в 3 раза относительно показателей в контрольной группе в ходе лечения.
В образцах сыворотки крови больных группы 2 (31) исходный уровень относительного содержания S-100 был снижен в 1,4 раза в сравнении с контролем и достоверно повысился в 1,1 раза в процессе вакцинотерапии.
Был проведен анализ выживаемости пациентов в этих группах больных (рис. 1). Выявлены статистически значимые различия: медиана выживаемости в группе 1 составила 22,0+7,8 мес.; в группе
2 - 54,0+25,2 мес. (р=0,045).
В процессе вакцинотерапии дендритными клетками у всех пациентов был проведен анализ относительного содержания сывороточных уровней растворимых молекул HLA I класса и растворимого антигена CD8 [6].
Больные разделены на две группы. Группу 1 составили пациенты с повышенным начальным уровнем растворимых антигенов в сыворотке крови, а группа 2 состояла из больных с исходно пониженным сывороточным уровнем растворимых антигенов [6] (табл. 2) .
Был проведен анализ относительного содержания сывороточного уровня S-100 в ходе вакцинотерапии у больных групп 1 и 2, распределенных относительно исходного уровня сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса и растворимого CD8-антигена.
Выявлено повышение относительного содержания сывороточного уровня S-100 в обеих группах больных по сравнению с контролем (группа здоровых доноров) в процессе лечения (табл. 3).
Из табл. 3 видно, что уровень относительного содержания S-100 в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой повысился в ходе лечения в обеих группах больных.
В группе 1 относительное содержание S-100 до лечения было в 1,3 раза выше показателей уровня данного маркера в контрольной группе; в ходе вакцинотерапии отмечено дальнейшее повышение S-100 - в 1,6 раза относительно нормальных значений у доноров, однако статистически достоверных различий выявлено не было.
В группе 2 относительное содержание уровня S-100 до лечения было повышено в 1,5 раза по сравнению с контролем; в ходе вакцинотерапии отмечено дальнейшее достоверное повышение уровня S-100 в 2,5 раза относительно нормальных значений исследуемого показателя в контрольной группе доноров.
Относительное содержание сывороточного уровня S-100 в группе 1 до начала вакцинотерапии было повышено в 1,4 раза относительно контроля. В процессе лечения выявлено достоверное повышение S-100 - в 2,1 раза относительно нормальных значений в контрольной группе.
В сыворотке крови пациентов группы 2 до начала вакцинотерапии уровень относительного содержания S-100 был сопоставим со значениями в контрольной группе доноров и в ходе лечения отмечено повышение относительного сывороточного содержания уровня S-100 в 1,2 раза относительно контроля, однако различия не имели статистически достоверного подтверждения.
1G6 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ СЫВОРОТОЧНЫХ...
Таблица 1
Относительное содержание Б-100 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками (Ы+ш), %______________________________________________________________
Группы Среднее содержание S-100 (%)
До лечения В процессе лечения
1. Все пациенты (55) 1З7,8З+107,55* 19б,8З+201,27*
2. Группа 1 (24) 204,б5+12З,18 *, **, *** 294,Зб+251,40 *, **, ***
3. Группа 2 (31) 72,бб+28,З9 * *** 111,4З+б4,40 * ***
4. Контрольная группа (15) 99,99+24,9З *** -
* статистически достоверные различия внутри группы до и в процессе лечения (р < 0,05); **по сравнению с контрольной группой (р < 0,05); ***между группами 1 и 2 (р < 0,05).
Таблица 2
Относительное содержание сывороточных уровней растворимых молекул HLA I класса и растворимого антигена CD8 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками (M±m), %
Антиген Группа 1 (п=ЗЗ) Группа 2 (n=22)
До лечения После лечения До лечения После лечения
HLA I 20З,0З+210,б*** 165,80+97,2*** бб,б0+б5,1*** 77,47+46,4***
CD 8 1З7,54+92,Зб* 1З1,51+72,1* 88,0+З8,7 (n=9) 57,25+8,6*(п=9)
* статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой (р < 0,05); ** статистически достоверные различия между группами 1 и 2 (р < 0,05).
Таблица 3
Относительное содержание сывороточного уровня Б-100 в группах 1и 2 в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками (Ы+ш), %_____________________________________________ _____________
Группы Относительное содержание уровня S-l00(M+m), %
До лечения В процессе лечения
1. HLA I - группа 1 (п=ЗЗ) группа 2 (n=22) 1З0,0б+11б,58 150,19+9З,45* 159,18+ 148,4З 256,62+258,59* **
2. CD8 - группа 1 (n=46) группа 2 (n=9) 145,99+11З,01* 94,7З+б0,б7 211,41+214,56* 119,75+76,40
* статистически достоверные различия внутри группы (до и в процессе лечения) (р < 0,05); **по сравнению с группой доноров (р < 0, 05).
Заключение
Белок Б-100 является сывороточным маркером меланомы. Уровень Б-100 коррелирует с наличием метастазов в печени или кости, ответом на химио- и иммунотерапию. Повышение его уровня коррелирует с низкой продолжительностью жизни [17]. Согласно имеющимся в литературе данным, концентрация растворимых мембранных АГ сыворотке крови может выступать как показатель тяжести течения и прогноза некоторых заболеваний, в том числе онкологических [9; 11]. Растворимые молекулы ИЬА I класса, взаимодействуя с мембранным С08-АГ ызывают апоптоз цитотоксических Т-лимфоцитов 7; 9; 11]. При проведении анализа относительного сывороточного содержания Б-100 у больных диссеминированной мелано-
мой были выявлены изменения между содержанием растворимых АГ LA I и CD8 и уровнем сывороточного S-100 в ходе вакцинотерапии дендритными клетками. У больных с повышенным сывороточным растворимым HLA I и пониженным растворимым CD8 повышение уровня S-100 в ходе лечения было менее выражено, тогда как при пониженных исходных значениях растворимого HLA I и повышенном CD8 в сыворотке крови пациентов отмечено более значительное повышение уровня S-100 в процессе вакцинотерапии. Изучение изменения относительного содержания сывороточного уровня маркера меланомы S-100 и сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса и CD8-AT у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками является актуальным [1; 3-5; 7-9; 11].
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Москвы в рамках научно-технической программы «Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических и других заболеваний».
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
9.
Алясова А.В., Пегов Р.Г., Михайлова ЕМ. и др. Растворимые формы молекул HLA I класса в сыворотке крови больных раком молочной железы и легкого//Нижегородский медицинский журнал. - 2008. - № 4. - С. 98-103. БарышниковАЮ, ТоневицкийА.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. - М.: Медицина, 1997. - 212 с. Барышников АЮ. Принципы и практика вакцинотерапии рака//Бюллетень Сибирского отделения РАМН. - 2004. - Т. 2. Барышников А.Ю. Биотерапия опухолей: неудачи и перспективы // Маммология. - 2007. - № 1. - С. 13-6. Барышников А.Ю., Демидов ЛВ., Кадагидзе З.Г. и др. Современные проблемы биотерапии злокачественных опухолей // Вестник Московского онкологического общества. - 2008. - Т. 1. - С. 6-10.
Голубцова Н.В., Михайлова И.Н., Новиков ВВ. и др. Изменение сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса, антигена CD8 и растворимого комплекса HLA I-CD8 у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, № 3. - С. 41-5.
Гостюжова Е.А., Ликов В.Ф., Караулов АВ., Новиков В.В. Особенности содержания растворимых молекул ЫЬД I класса, СП8-антигена и их комплексов при хроническом миелолейкозе // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2008. - № 3. - С. 33-8.
Михайлова И.Н., Петенко Н.Н., Демидов ЛВ. Вакцинотерапия меланомы дендритными клетками // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т. 6, № 3. - С. 8-18.
Новиков В.В., Караулов А.В., Барышников А.Ю. Растворимые формы мебранных антигенов клеток иммунной системы // Иммунология. - 2007. - №4. - С. 249-53.
(окончание см. на стр. 112)
