CC BY
6©Коллектив авторов, 2020 Вопросы онкологии, 2020. Том 66, № 1
УДК 616-006.44
Е.В. Харченко1, т.Ю. Семиглазова12, А.С. Артемьева1, г.С. Киреева1, и.л. Поляцкин1 и.С. Зюзгин1, л.В. Филатова1, Ю.А. чудиновских1, М.С. Моталкина1, Ю.А. олейник1
прогностическая значимость иммуногистохимических и молекулярно-генетических характеристик диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы
1ФгБу «НМиЦ онкологии им. Н.Н. петрова» Минздрава россии 2ФгБОу ВО «северо-западный государственный медицинский университет им. и.и. Мечникова»
Минздрава россии, санкт-петерубург
Цель: определение частоты встречаемости и влияния на прогноз заболевания экспрессии различных игХ и молекулярно-генетических маркеров двккл.
Методы: проанализировано 215 пациентов с диагнозом ДВККл, проходивших лечение в период с 2008 по 2016 гг. Была выполнена оценка ряда игХ маркеров, разделение на подтипы GCB, nonGCB при помощи Hans-алгоритма, а также анализ FISH с определением транслокаций в генах MYC, BCL2 и BCL6 для оценки влияния на прогноз заболевания.
результаты: Медиана времени наблюдения за пациентами составила 29 месяцев. Non-GCB подтип ДВККл был установлен в 44 случаях (62,9%), GCB-подтип в 26 случаях (37,1%). Медиана ВБп у non-GCB ДВККл составила 46,0 мес., в группе GCB ДВККл медиана ВБп и 75% квартиль не были достигнуты (p=0,171). посредством FISH-анализа у 10/48 (20,8%) пациентов выявлены транслокации в генах MYC или BCL2 или BCL6. Экспрессия c-myc и bcl-2 наблюдалась у 21/71 пациентов (29,6%). Экспрессия CD5 была обнаружена у 19/55 (34,5%), CD30 — у 24/66 пациентов (36,4%). В группе без экспрессии CD 10 ВБп составил 6,0 мес., в группе с экспрессией медиана не была достигнута (р=0,122). пациенты с экспрессией CD 10 имели меньший риск рецидива в сравнении с больными без экспрессии (р=0,049). при мультивариантном анализе независимым предиктором, негативно влияющими на ВБп оказалось отсутствие экспрессия CD10 (р=0,015).
Заключение: пациенты с ДВККл NOS, GCB-подтипом имеют тенденцию к благоприятному прогнозу за счет более высоких показателей ВБп и к низкому риску рецидива в сравнении с non-GCB-подтипом ДВККл NOS. определение типов ДВККл в зависимости от происхождения опухолевой клетки (GCB или non-GCB), а также идентификация других игХ маркеров помогает выделить группу пациентов с ДВККл неблагоприятного прогноза.
ключевые слова: Диффузная крупноклеточная B-клеточная лимфома, GCB, non-GCB, c-myc, bcl-2
Введение
Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (ДВККЛ) - это самая часто встречающаяся неходжкинская лимфома (НХЛ), на долю которой приходится около 30-58% всех случаев НХЛ [1]. Несмотря на успехи в лечении ДВККЛ после внедрения в практику моноклонального антитела ритуксимаб, у половины больных развивается рецидив заболевания, а в трети случаев — летальный исход [2]. Эти данные делают очевидным тот факт, что ДВККЛ — это разнородная группа заболеваний с различными иммуногистохимическими [ИГХ], молекулярно-генетическими характеристиками, клиническим течением и ответом на терапию. Необходимость комплексной оценки ИГХ и молекулярно-гене-тических параметров опухоли, определение прогностических маркеров и разделение ДВККЛ на подтипы согласно новой классификации Всемирной организации здравоохранения 2016 г. (ВОЗ), должно войти в рутинную клиническую практику [3]. Это поможет не только определить прогноз заболевания, но и с учетом биологических особенностей применить новые персонализированные подходы в лечении.
В новой классификации лимфопролифератив-ных заболеваний ВОЗ, вышедшей в 2016 году, подчеркивается необходимость проведения ИГХ анализа и молекулярно-генетических исследований для полноценной диагностики опухоли. Например, на основании анализа профиля экспрессии генов ДВККЛ без дополнительного уточнения (not otherwise specified-NOS) была разделена на 2 подтипа в зависимости от происхождения опухолевой клетки: лимфома с фенотипом клеток герминального центра (GCB) и активированных В-клеток (АВС) [3].
В ежедневной клинической практике разделение ДВККЛ на ABC и GCB подтипы посред-
ством анализа профиля экспрессии генов малодоступен и, поэтому, в новой классификации ВОЗ 2016 рекомендовано разделение на GCB и non-GCB подтипы ДВККЛ с помощью ИГХ-Hans-алгоритма.
Суррогатная модель оценки происхождения клетки (Hans-алгоритм) включает в себя определение экспрессии белков CD10, bcl-6, mum-1. Non-GCB подтип включает в себя «не-классифицируемые» случаи и ABC-подтипы ДВККЛ. В мировых исследованиях non-GCB подтип ДВККЛ продемонстрировал худшие показатели выживаемости в сравнении с GCB-подтипом ДВККЛ [4] и согласно имеющимся данным, в 79% случаев результаты разделения на группы при помощи ИГХ Hans-алгоритма сопоставимы с анализом профиля экспрессии генов [5].
Помимо разделения ДВККЛ NOS на GCB и ABC подтипы, новая классификация ВОЗ выделила редкую группу В клеточных лимфом высокой степени злокачественности, встречающуюся менее, чем в 3% случаев: лимфома с перестройками в генах MYC, BCL-2 и/или BCL-6, или Double-hit (DH) и Triple-hit (TH) лимфомы [3].
Наличие перестроек в вышеупомянутых генах определяет агрессивность течения болезни, резистентность к стандартной терапии и неблагоприятный прогноз. Клиническими особенностями DH и TH лимфом являются: высокая частота выявления болезни в III-IV стадиях, тяжелое общее состояние больных (ECOG 2-4) в период манифестации болезни, поражение костного мозга, повышение уровня ЛДГ [6]. Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) позволяет определить наличие перестройки в генах MYC, BCL2 и BCL6. Однако, в связи с низкой доступностью в условиях современной лаборатории нередко исследование ограничивается ИГХ-анализом, что является недостаточным для полноценной диагностики ДВККЛ. В нашей работе был предложен алгоритм дифференциальной диагностики ДВККЛ NOS от B-клеточной лимфомы высокой степени злокачественности с транслокацией генов MYC, BCL-2 и/или BCL-6 с использованием ИГХ маркеров и FISH ^м. ниже).
не только молекулярно-генетические характеристики опухоли могут влиять на прогноз заболевания, но и различные ИГХ маркеры опухоли. Помимо ИГХ маркеров, входящих в Hans-алгоритм (CD10, bcl-6, and IRF4/MUM1), потенциальную прогностическую значимость могут также иметь с-myc, bcl-2, CD 5, p53, CD 30 [7].
Все вышеуказанное демонстрирует необходимость оценки ИГХ и молекулярно-генетиче-
ских маркеров не только с целью улучшения диагностики и оценки прогноза заболевания у больных ДВККЛ, но и разработки персонализированных подходов в терапии с учетом биологических особенностей опухоли. Это определяет актуальность данного исследования, направленного на разрешение имеющихся вопросов. Целью настоящего исследования является анализ прогностической значимости ИГХ и молекулярно-генетических характеристик ДВККЛ и их влияния на клиническое течение заболевания, ответ на терапию и показатели ВБП.
Материалы и методы
В исследование было включено 215 пациентов. Гистологическое исследование проводилось на архивном материале фрагмента опухоли или лимфатического узла.
Средний возраст в исследуемой группе составил 51,29±14,55 лет. Количество мужчин несколько превалировало над количеством женщин (54,9% vs 45,1%, соответственно). В подавляющем большинстве случаев (порядка 90%) в первой линии полихимиотерапии пациенты получали CHOP-подобные схемы с ритуксимабом (R-CHOP, R-EPOCH). Пациенты с ДВККЛ, которым ранее установили диагноз с использованием классификации ВОЗ 2008 были реклассифицированы по новым требования ВоЗ 2016. Перед началом лечения пациентам проводилось полное обследование, согласно действующими рекомендациям по лечению и диагностике ДВККЛ [8].
ИГХ анализ был также выполнен для оценки экспрессии ряда потенциальных прогностических маркеров, таких как с-тус, bcl-2, CD 5, CD 30, p53, а также маркеров, входящих в Hans-алгоритм (CD 10, bcl-6, MUM1), для разделения на GCB и non-GCB подтипы ДВККЛ.
ИГХ анализ был выполнен 123 пациентам. оценка экспрессии белков с-тус и bcl-2 осуществлялась с учетом опубликованных рекомендаций для данных маркеров. Применялись те же пороговые значения: с-тус > 40 % и bcl-2 > 50 %. Пороговыми значениями для p-53 считались > 75 %, bcl-6 и CD 10 > 30 % позитивных клеток [3]. Ряду пациентов (n=48) был выполнен анализ FISH c целью оценки наличия транслокаций MYC, BCL-2, BCL-6.
Результаты
Экспрессия CD20 выявлена в подавляющем большинстве случаев (96,7%). После выполнения Hans-алгоритма, non-GCB подтип ДВККЛ был установлен в 44 случаях, (62,9%). Высокая пролиферативная активность с уровнем Ki-67>89% была обнаружена у 51 пациента (48,6%). Экспрессия маркера CD10 была выявлена у 19/61 пациентов (31,1%), экспрессия bcl-2 — у 73/108 пациентов (67,6%). У большинства пациентов наблюдалась экспрессия bcl-6- в 78 из 118 случаев (66,1%) и экспрессия маркера MUM-1 отсутствовала у 41/60 (68,3%). Экспрессия с-myc была обнаружена у 21/74 пациентов (28,4%). 21/71 пациентов (29,6%) имели двойную экспрессию с-myc и bcl-2 (DE лимфома). Экспрессия CD5 наблюдалась у 19/55 (34,5%),
CD30 — у 24/66 пациентов (36,4%), р53 обнаружена у 8/47 (17%) пациентов. Частота встречаемости различных ИГХ маркеров у проанализированной группы пациентов представлена в табл. 1.
Медиана ВБП в группе non-GCB ДВККЛ составила 46,0 мес. (95% ДИ 30,1-59,3), в группе GCB ДВККЛ медиана и 75% квартиль не были достигнуты (p=0,171), 0Р=0,505, 95% ДИ [0,183-1,393], p=0,107 (рис. 1).
При сравнении ВБП в группах пациентов в зависимости от наличия экспрессии CD10 (рис. 2, 3) медиана не была достигнута в обеих группах. 75% квартиль в группе отсутствия экспрессии CD10 составил 6,0±1,3 мес., в группе с наличием экспрессии 75% квартиль достигнут не был (р=0,122) (рис. 4). При сопоставлении рисков рецидива в подгруппах обнаружены статистически значимые различия в ВБП между группами — пациенты с экспрессией CD 10 имели меньший риск рецидива в сравнении с пациентами без экспрессии, ор=0,397,95% ДИ [0,115-0,983], р=0,049.
При анализе ВБП пациентов в группах в зависимости от наличия двойной экспрессии белков c-myc, bcl2 или их отсутствия, медиана не была достигнута. 75% квартиль в группе пациентов с отсутствием двойной экспрессии составил 7,0±2,5 мес., в группе c наличием двойной экспрессии c-myc, bcl-2 75% квартиль достигнут не был. Статистически значимых различий между группами обнаружено не было (р=0,605). При сопоставлении рисков рецидива в группах: 0Р=0,750, 95% ДИ [0,249-2,262], р=0,610 (рис. 5).
При сравнении ВБП в зависимости от наличия экспрессии CD 5 (рис. 6, 7) медиана ВБП не была достигнута в обеих группах. 75% процен-тиль в группе без экспрессии CD 5+ составил 46,0±30,2 мес. против 11,0±3,9 мес. в группе c наличием экспрессии (р=0,189); при сравнении рисков рецидива в группах ор=1,978, 95% ДИ [0,692-5,649], p=0,203 (рис. 8)
При унивариантном анализе ВБП в группах наличия/отсутствия экспрессии CD30 (рис. 9, 10) выявлено, что медиана не была достигнута в обеих группах. 75% квартиль в группе без экспрессии CD30 составил 15,0±12,2 мес. vs 32±23,4 мес. в группе с наличием экспрессии (p=0,798). При сравнении рисков в группах ОР=1,113, 95% ДИ [0,430-2,983], р=0,801 (рис. 11).
При мультивариантном анализе независимыми предикторами, негативно влияющими на выживаемость, оказалось отсутствие экспрессии CD10. Экспрессия CD 10 является независимым предиктором благоприятного прогноза (0Р=0,397, 95% ДИ [0,115-0,983], р=0,015).
Таблица 1. ИГХ анализ ДВККЛ у пациентов, включенных в исследование, номинативные параметры
Таблица 2. FISH-характеристики ДВККЛ пациентов, включенных в исследование
Параметр N=48 %
реаранжировка в гене BCL2 2 4,1%
реаранжировака в гене BCL6 6 12,5%
реаранжировка в гене MYC 2 4,1%
single-hit лимфомы 2 18,7%
Double-hit лимфомы 0 0%
Частоты % по столбцу
Экспрессия CD20 есть 2 3,3%
нет 59 96,7%
Всего 61 100,0%
Подтип дЛБКЛ GCB vs non-GCB non-GCB подтип 44 62,9%
GCB-подтип 26 37,1%
Всего 70 100,0%
Ю-67 0-89 vs 91-100 0-89 62 50,4%
90-100 61 49,6%
Всего 123 100,0%
Экспрессия CD10 нет 42 68,9%
есть 19 31,1%
Всего 61 100,0%
Экспрессия Ь^-6 нет 40 33,9%
есть 78 66,1%
Всего 118 100,0%
Экспрессия 1^1^-1 нет 41 68,3%
есть 19 31,7%
Всего 60 100,0%
Экспрессия C-MYC нет 53 71,6%
есть 21 28,4%
Всего 74 100,0%
двойная экспрессия c-myc и Ь^-2 нет 50 70,4%
есть 21 29,6%
Всего 71 100,0%
Экспрессия CD5 нет 36 65,5%
есть 19 34,5%
Всего 55 100,0%
Экспрессия CD30 нет 42 63,6%
есть 24 36,4%
Всего 66 100,0%
рис. 1. ВБП в зависимости от подтипа дВККЛ
рис. 2. дВККЛ без экспрессии CD 10. Увеличение х 40
рис. 3. дВККЛ c экспрессией ОЭ 10. Увеличение х 40
рис. 4. ВБП в зависимости от наличия/отсутствия экспрессии 0Э10 у пациентов с ДВККЛ
Рис. 5. График ВБП в зависимости от наличия/отсутствия экспрессии с-myc и bcl-2 у пациентов с дВККЛ
рис. 6. дВККЛ без экспрессии СD 5. Увеличение Х40
рис. 7. дВККЛ с экспрессией СD 5. Увеличение Х 50
рис. 8. График ВБП в зависимости от наличия/отсутствия экспрессии CD5 у пациентов с дВККЛ
Рис. 9. ДВККЛ без экспрессии СЭ 30. Увеличение Х 50
Рис. 10. ДВККЛ с экспрессией СЭ 30. Увеличение Х 50
рис. 11. График ВБП в зависимости от наличия/отсутствия экспрессии СD30 у пациентов с дВККЛ
рис. 12. Алгоритм для диагностики DH-лимфом при отсутствии возможности рутинного использования FISH
рис. 13. Транслокация MYC, FIsH
рис. 14. Транслокация BCL-6, FIsH
Рутинное проведение анализа FISH всем пациентам с ДВККЛ достаточно трудоемкий и дорогостоящий процесс, в связи с чем в настоящей работе был предложен алгоритм диагностики DH и TH лимфом посредством поэтапного выполнения ИГХ анализа c последующим выполнением FISH (рис. 12). Первым этапом в данном алгоритме является морфологическая оценка опухоли, затем разделение ДВККЛ на подтипы GCB и non-GCB. Следующий шаг — определение экспрессии c-myc и bcl-2, при подтверждении коэкспресии — анализ FISH на транслокацию в гене MYC. При положительном тесте необходимо оценить наличие или отсутствие транслокации в генах BCL2, BCL6. Предложенный алгоритм в условиях невозможности выполнения FISH всем пациентам c ДВККЛ может помочь выделить прогностически неблагоприятную группу больных, которым потенциально необходим более агрессивный подход в терапии.
В нашем анализе низкая встречаемость в популяции лимфомы с перестройками в генах
МУС, В^-2 и/или В^- была подтверждена — мы не обнаружили двойные транслокации, но обнаружили 10 лимфом с транслокацией в генах или МУС или В^2 или В^6 (табл. 2)
Были обнаружены 2 реанжировки в гене В^-2, 6 реанжировок в гене В^-6 (рис 14), 2 в гене МУС (рис. 13).
Возможно, недостаточная выраженность некоторых тенденций в показателях выживаемости отчасти связана с тем, что по отношению к различным пациентам, включенным в выборку, практиковался несколько различающийся подход в зависимости от прогноза заболевания — пациенты с более агрессивными лимфомами получали интенсивные схемы лечения — ЕРОСН-Н. либо ВДХТ с аутоТКМ в 1 линии терапии. Для назначения того или иного лечения учитывались принадлежность к GCB/non-GCB подтипам, наличие/отсутствие экспрессии с-тус и Ьс1-2, уровень Ю-67, степень распространенности заболевания. Этот факт мог несколько нивелировать
потенциальные межгрупповые различия в исследованной нами когорте пациентов.
обсуждение
ДВККЛ — потенциально излечимое заболевание и, несмотря на то что большинство пациентов достигают полной ремиссии, у 50% больных развивается рецидив. Эти данные подтверждают, что ДВККЛ является неоднородной группой заболеваний с различным ответом на терапию и прогнозом. Это диктует необходимость внедрения комплексной оценки различных морфологических, ИГХ и молекулярно-генетических параметров [9] при постановке диагноза для определения не только прогноза, но и тактики лечения, в том числе с применением ранней интенсификации, таргетной терапии или возможности включения в клинические исследования.
Выводы
1. Экспресиия CD 20 наблюдалась в 96,7% случаев, Ki-67>89% у 48,6%. Экспрессия маркера CD10 была выявлена в 31,1% случаев, bcl-2 -67,6%, с-тус у 28,4% пациентов, в 29,6% наблюдалась двойная экспрессия с-тус и bcl-2. Non-GCB подтип ДВККЛ был установлен в 63% случаев, GCB в 37 % соответственно.
2. Пациенты с экспрессией CD 10 имеют меньший риск развития рецидива в сравнении с пациентами без экспрессии CD 10 (р=0,049). Пациенты с ДВККЛ и GCB-подтипом ДВККЛ имеют тенденцию к благоприятному прогнозу за счет более высоких показателей ВБП и низкому риску рецидива в сравнении с non-GCB-подтипом ДВККЛ (р=0,107).
ЛИТЕРАТУРА
1. Tilly H., Gomes da Silva M., Vitolo U. et al. Diffuse Large B-Cell Lymphoma: ESMO Clinical Practice Guidelines // Ann Oncol. - 2015. - Vol. 26 (suppl 5). - P. v116-v125.
2. Cohen J.B. Novel therapies for relapsed/refractory aggressive lymphomas // Hematology Am Soc Hematol Educ Program. - 2018. - Vol. 2018(1). - P. 75-82.
3. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L. et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. - Lyon: International Agency for Research on Cancer (IARC), 2016.
4. Schmidt-Hansen M., Berendse S., Marafioti T., McNamara C. Does cell-oforigin or MYC, BCL2 or PCL6 translocation status provide prognostic information beyond the International Prognostic Index score in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab and chemotherapy? A systematic review // Leuk Lymphoma. -2017. - Vol. 58. - P. 2403-2418.
5. Batlle-Lopez A., Gonzalez de Villambrosia S., Francisco M. et al. Stratifying diffuse large B-cell lymphoma patients treated with chemoimmunotherapy: GCB/non-GCB by
immunohistochemistry is still a robust and feasible marker // Oncotarget. - 2016. - Vol. 7 (14). - pp. 18036-18049.
6. Oki Y, Noorani M., Lin P. et al. Double hit lymphoma: the MD Anderson Cancer Center clinical experience // Br. J. Haematol. - 2014. - Vol. 166. - P. 891-901.
7. Shimin Hu., Zijun Y Xu-Monette, Alexander Tzankov et al. MYC/BCL2 protein coexpression contributes to the inferior survival of activated B-cell subtype of diffuse large B-cell lymphoma and demonstrates high-risk gene expression signatures: a report from The International DLBCL Rituximab-CHOP Consortium Program // Blood. -2013. - Vol. 121(20). - P. 4021-4031.
8. Поддубная И.В., Савченко В.Т. и соавт. Российские Клинические Рекомендации по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний // Современная Онкология. - 2014. - C. 9-10.
9. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека 4-е изд., доп. и пере-раб / Под ред. С.В. Петрова, Т.Н. Райхлина-Ка-зань, 2012. - С. 312-338.
Поступила в редакцию 17.09.2019 г.
E.V. Kharchenko1, T.Y. Semiglazova1,2, A.S. Artemyeva1, G.S. Kireeva1, I.L. Polatskin1, I.S. Zuzgin1, L.V. Filatova1,
Y.A. Chudinovskih1, M.S. Motalkina1, Y.A. Oleynik1
Prognostic impact of immunohistochemical and molecular genetic markers in diffuse Large B-cell lymphoma
1FSBI «N.N. Petrov National Medical Research Center of oncology», 2North-Western State Medical University na I.I. Mechnikov, St.Petersburg
Aim: To identify incidence and prognostic impact of different IHC and molecular genetic markers in Diffuse Large B-cell lymphoma.
Methods: We analyzed 215 patients with DLBCL who received treatment from 2008 to 2016. We assess expression of different IHC markers, defined DLBCL to GCB and non-GCB subtypes by Hans-algorithm and performed FISH to evaluate MYC, BCL2 and BCL6 translocations.
Results: Median follow-up was 29 months. Non-GCB DLBCL were identified in 44 pts (62,9%), GCB-subtype in 26 pts (37,1%). Median PFS in non-GCB DLBCL was 46,0 months, in GCB DLBCL median PFS and 75% quartile was not reached (p=0,171). Traslocations of MYC, BCL2 and BCL6 were found in 10/48 pts (20,8%). Double expression of c-myc and bcl-2 was identified in 21 of 71 пацнентов (29,6%). CD5-expression were determined in 19/55 (34,5%), CD30+ DLBCL - in 24/66 pts (36,4%). In pts with DLBCL without CD-10 expression PFS was 6,0 months, in group with CD 10 expression median of PFS was not reached (p=0,122). Pts with CD 10 expression had lower risk of relapse compared to those without expression (p=0,049). Absence of CD 10 expression was negative prognostic factor for PFS in multivariate analysis (p=0,015).
Conclusion: Patients with DLBCL and GCB subtype have tendency to better prognosis in PFS rates and lower risk of relapse compared to non-GCB subtype. Dividing to GCB or non-GCB subtypes in DLBCL and assessment of different IHC markers can potentially determine DLBCL with worse prognosis.
Key words: Diffuse Large B-cell lymphoma, GCB, non-GCB, c-myc, bcl-2
