CC BY
3Ветеринарный врач. 2023. № 6. С. 10 - 14 The Veterinarian. 2023; (6): 10 - 14
Научная статья УДК 619
DOI: 10.33632/1998-698Х_2023_6_10
ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В ДИАГНОСТИКЕ СПОНТАННЫХ ДЕРМАЛЬНЫХ МАСТОЦИТОМ У СОБАК
Меликова Юлия Николаевна, кандидат ветеринарных наук, melikovayn@mgupp.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Российский биотехнологический университет», Москва, Россия
Автор, ответственный за переписку: Меликова Юлия Николаевна
Аннотация._В статье представлен научно-обоснованный подход к диагностике и
прогностическому анализу иммунногистохимических исследований спантанных дермальных мастоцитом у собак. В работе использован комплексный методический подход, включающий методы клинического, патоморфологического, инструментального исследований. В исследованиях принимали участие 198 собак с различными злокачественными новообразованиями кожи, из которых 64 составляли мастоцитомы, в том числе в области лицевой части черепа 42 случая.
Определено, что у собак мастоцитомы в области лицевой части черепа по сравнению с другими локализациями имеют более неблагоприятный прогноз в лечении из-за сложностей в соблюдении правил хирургического вмешательства. Чаще всего мастоцитомы области лицевой части черепа локализуются на брылях и в области подбородка, реже в области век, на слизистой ротовой полости. При использовании двух иммуногистохимичексих маркеров CD117 (KIT) и ki-67, было выявлена прогностически важная взаимосвязь со степенью злокачественности, сложностью лечения и прогрессирования мастоцитом в процессе лечения. Показано, что интерпритация этих маркеров была достоверной во всех случаях наблюдения за больными животными. Анализ данных выявил корреляцию между повышенной экспрессией ю-67, также аберрантной иммуноэкспрессией CD117 (KIT) и морфологической степенью злокачественности, что является неблагоприятным прогностическим фактором (медиана выживаемости сокращается) у собак со спонтанными дермальными мастоцитоми. Таким образом, иммунногистохимические исследования с использованием маркеров CD117 (KIT) и ю67 могут иметь прогностическую значимость и ценность в дополнение к другим специальным исследованиям спонтанных дермальных мастоцитом у собак.
Ключевые слова. собака, новообразование, мастоцитома, морфологические исследования, иммуногистохимические исследования, CD117 (KIT), ki-67, прогноз.
Для цитирования: Меликова Ю.Н. Прогностическая ценность иммуногистохимических маркеров в диагностике спонтанных дермальных мастоцитом у собак // Ветеринарный врач. 2023. №6. С.10-14. DOI: 10.33632/1998-698Х_2023_6_10
PROGNOSTIC VALUE OF IMMUNOHISTOCHEMICAL MARKERS IN THE DIAGNOSIS OF SPONTANEOUS DERMAL MASTOCYTOMA IN DOGS
Melikova Yulia Nikolaevna, candidate of veterinary sciences, melikovayn@mgupp.ru
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Russian Biotechnological University", Moscow, Russia
Corresponding autor: Melikova Yulia Nikolaevna
Abstract. The article presents a scientifically based approach to the diagnosis and prognostic analysis of immunohistochemical studies of spontaneous dermal mastocytomas in dogs. The work uses a comprehensive methodological approach, including methods of clinical, pathomorphological, instrumental research. The research involved 198 dogs with various malignant neoplasms of the skin, of which 64 were mastocytomas, including 42 cases in the area of the facial part of the skull.
It was determined that in dogs mastocytomas in the area of the facial part of the skull, compared with other localizations, have a more unfavorable prognosis in treatment due to difficulties in complying with the rules of surgical intervention. Most often, mastocytomas of the facial part of the skull are localized on the ribs and in the chin area, less often in the eyelid area, on the oral mucosa. When using two immunohistochemical markers CD117 (KIT) and ki-67, a prognostically important relationship was revealed with the degree of malignancy, complexity of treatment and progression of mastocytomas during treatment. It is shown that the interpretation of these markers was reliable in all cases of observation of sick animals. Data analysis revealed a correlation between increased ki-67 expression, as well as aberrant CD117 immunoexpression (KIT) and morphological malignancy, which is an unfavorable prognostic factor (median
survival is decreasing) in dogs with spontaneous dermal mastocytomas. Thus, immunohistochemical studies using CD117 (KIT) and ki67 markers may have prognostic significance and value in addition to other special studies of spontaneous dermal mastocytomas in dogs.
Keywords: Dog, neoplasm, mastocytoma, morphological studies, immunohistochemical studies, CD117 (KIT), ki-67, prognosis.
Введение. Тучноклеточные опухоли являются наиболее распространенными злокачественными новообразованиями кожи у собак. К ним относятся мастоцитомы, не имеющие доброкачественных аналогов и составляющие 16-21% всех спонтанных кожных новообразований собак с распространенностью 0,27% в популяции животных. Этиопатогенез этих опухолей имеет дискутабельный характер, но предрасположенность некоторых пород к развитию заболевания предполагает наличие генетической причины [4,5].
Гистологическая классификация мастоцитом, определяющая степень злокачественности заболевания, играет важную роль в прогнозировании тучноклеточных опухолей кожи собак, но указывает на различное биологическое поведение каждой опухоли, что требует использования дополнительных маркеров. В то же время в качестве прогностических факторов было предложено множество иммуногистохимических маркеров, в настоящее время лишь немногие из них применяются в диагностике спонтанных дермальных мастоцитом у собак [1-3].
Степень злокачественности мастоцитом определяется при помощи двух гистологических классификаций, описанных Patnaik и Kupel. Система, предложенная Patnaik et al., учитывала как клеточную морфологию, так и степень поражения тканей и классифицировала мастоцитомы на три определенных класса. [1-2] Впоследствии Kiupel et al. предложили новую классификацию, которая делит мастоцитомы на две категории, а именно на высокую и низкую степень злокачественности, на основе патоморфологических критериев. [4-5]
Несмотря на то, что гистологическая классификация считается основным инструментом в прогностической оценке заболевания, а системы классификации представляют собой усовершенствованные клеточные стандарты, которые обеспечивают практическую применимость при диагностике, их использования может быть недостаточно для установления точного прогноза. [1-2, 6-9]
Учитывая высокое клиническое воздействие спонтанных кожных мастоцитом у собак и большое разнообразие маркеров, которые могут быть предложены в качестве прогностических факторов, существует настоятельная необходимость в точной интерпритации иммуногистохимических маркеров в клинической практике. [1-3]
В норме тучные клетки экспрессируют CD117 (KIT) преимущественно в клеточной мембране, в тоже время неопластические тучные клетки могут экспрессировать CD117 (KIT) в околоядерной области или диффузно в цитоплазме. [3] Таким образов, диагностически целесообразным является выявления области экспрессии этих белков, что может являться предпосылкой для степени злокачественности и прогнозирования заболевания.
Материалы и методы. Исследования проводились на базе кафедры болезней мелких домашних, лабораторных и экзотических животных, лаборатории онкологии, офтальмологии и биохимии животных ФГОУ ВО «РОСБИОТЕХ», а также ветеринарной клиники «Зоогалерея», морфологические и иммунногистохимические исследования проводили в Ветеринарном центре патоморфологии и лабораторной диагностики доктора Н.В. Митрохиной.
Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема №1022060100048-4.3.1 Научно-исследовательская лаборатория офтальмологии, онкологии и биохимии животных).
Объектом исследований являлись 198 собак с различными злокачественными новообразованиями кожи, из которых 64 составляли мастоцитомы, в том числе в области лицевой части черепа 42 случая.
Для проведения работы были сформированы группы животных, подобранные для эксперимента в количестве 42 животных в опытных группах, подобранные по степени злокачественности спонтанных кожных мастоцитом - собаки различных пород, в возрасте 7-12 лет, со схожей клинической картиной и условиями содержания. При сборе анамнеза устанавливали условия содержания, кормления, вакцинации и дегельминтизации, заболевания инфекционными, внутренними и хирургическими заболеваниями и историю болезни (длительность симптомов до обращения в ветеринарную клинику, порядок их появления и выраженность симптомов, наличие в родословной родственников с опухолями). После сбора анамнестических данных приступали к обследованию больного животного: оценивали общее состояние, сознание, состояние шерсти и кожных покровов. При осмотре у собак с предполагаемой мастоцитомой наблюдали на поверхности новообразования заметную самоиндуцированную аллопецию, гиперемию, отечность, иногда выявляли признаки самотравматизации; исследовали состояние регионарных лимфоузлов, их размеры, подвижность, болезненность; исследовали систему органов дыхания, состояние поверхностных органов дыхания, симметричность дыхания, тип дыхания, частоту дыхательных движений за 1 минуту; исследовали систему органов кровообращения - изучали скорость наполнения капилляров, цвет слизистых, определяли верхушечный толчок сердца, частоту сердечных сокращений за 1 минуту; определяли степень напряженности и болезненности брюшной стенки при помощи пальпации - особое внимание обращали на расположение пальпируемых через брюшную стенку внутренних органов. После переходили к инструментальным методам диагностики: проводили рентгенографию органов грудной полости минимум в трех проекциях (латеро-медиальной справа и слева и дорсо-вентральной или вентродорсальной) для исключения или подтверждения предполагаемых метастазов, опухолевого
плеврита или сопутствующей патологии органов грудной полости. У животных опытных групп проводили исследования морфологических и биохимических параметров крови каждые 14 дней для наблюдения за функциональной работой органов. Для осуществления исследования проводили взятие венозной крови объёмом 2 мл в стерильные пробирки. Осуществляли биохимические исследования крови с использованием анализатора Vetscan 2 и морфологические исследования крови на анализаторе MicroCC-20Plus по общепринятым методикам. Для исключения отдаленных метастазов и определения клинической стадии заболевания проводили дополнительные исследования: ультрасонографию органов брюшной полости, рентгенографию органов грудной клетки в трех проекциях, неаспирационную биопсию из новообразований и регионарных лимфатических узлов.
Для получения материала для цитологического исследования использовали тонкоигольную неаспирационную биопсию. Использовали сухой шприц объемом 5 мл и острые тонкие иглы 27 G 44 мм. После обработки поля этиловым спиртом новообразование фиксировали при помощи пальцев на поверхности кожи. Брали иглу без шприца и вводили в новообразование. Убедившись, что игла находится в патологическом очаге, производили 5-6 поступательных движений, не вытаскивая иглу из новообразования. После каждой аспирации шприц отсоединяли для того, чтобы изменить положение иглы в новообразовании. Для получения материала из различных участков новообразования меняли направление иглы во время биопсии. Полученный материал из иглы получали при помощи аспирации шприцем с воздухом на чистые обезжиренные предметные стекла, распределяя клетки тонким слоем.
Результаты исследований и их обсуждение. Результаты анализа по выявлению прогностической ценности иммуногистохимических маркеров в диагностике спонтанных дермальных мастоцитом у собак свидетельствует о наличии корреляционной зависимости степени злокачественности и степени экспрессии изучаемых иммунногистохимических показателей. Выбор изучаемых иммунногистохимических маркера определялся свойствами белка KIT (CD117), который кодируется протоонкогеном c-kit и является трансмембранным рецептором фактора стволовых клеток.
Выявлено, что в случаях, когда мембранная иммуннореактивность клеток опухоли к антителам к KIT (CD 117) является благоприятным прогностическим типом реактивности. На иммунногистохимических снимках выявлена наличие реакции со стороны внутренней поверхности стенки клетки, проявляющееся в выработки вторичного посредника, который действует на указанный белок (рис 1).
Рис 1. Мембранная иммуннореактивность клеток опухоли к антителам к KIT (CD117). Благоприятный прогностический тип
Интерпретация гистологического материала спонтанных дермальных мастоцитом может быть затруднена в связи с наличием цитоплазматических гранул, препятствующих определению количества митозов. В связи с этим, нами использовался метод иммуногистохимического иследования с использованием красного хроматина для выявления экспрессии Ki67, что позволило подсчитать пролиферирующие клетки. Для этого изучали Ki67 - ядерный белок (экспрессируется на всех фазах клеточного цикла с пиком в М-фазе), определяющий наличие митозов в опухолевых тучных клетках. И так как экспрессия Ki67 отсутствует в нециклирующих клетках, определение степени пролиферативной активности клеток по наличию красной ядерной маркировки может также стать дополнительным прогностическим тестом при спонтанных дермальных мастоцитомах (рис 2, 5).
Выявлено, что низкая экспрессия белка Ki67 мастоцитом определялась редкой красной ядерной маркировкой, коррелировала с результатами морфологических исследований и указывала на низкую степень злокачественности тучноклеточной опухоли (рис 2).
Рис. 2 Оценка пролиферативной активности кожных мастоцитом собак. Низкий индекс Ki67 (редкая красная ядерная маркировка). Позитивный прогностический тип
Изучая результаты по выявлению перимембранной очаговой/точечной (рис 3) цитоплазматической иммуннореактивностью или перимембранной диффузной (рис 4) цитоплазматической иммуннореактивностью клеток опухоли к антителам к KIT (CD 117), действующая на внешний слой мембраны клеток, когда реакция проходила очагово (рис 3) или диффузно (рис 4), относятся к неблагоприятному прогностическому типу.
а - " „Л. ■ <*•■■»' .
А4,
; v ■*:>.;;••;-.■ - \ ш * - V ; в - ' , 5
• ■ Щ « #
v: л 7 ч > ^ | - i
Рис. 3 Перимембранная очаговая/точечная цитоплазматическая иммуннореактивность клеток опухоли к антителам к KIT (CD 117). Неблагоприятный прогностический тип
л .
Рис. 4 Перимембранная диффузная цитоплазматическая иммуннореактивность клеток опухоли к антителам к KIT (CD117). Неблагоприятный прогностический тип
V
. л' % Л • > •• ;
» *» . #
■ • • j
ш • * • ^
. • • л • • 1
• г* » • . .
• • . / • • - -. * >.
« _
Рис 5. Оценка пролиферативной активности кожных мастоцитом собак. Высокий индекс Ki67 (большое количество клеток с красной ядерная маркировка). Неблагоприятный прогностический тип.
Тогда как выявление большого количество клеток с красной ядерной маркировкой обратно пропорционально времени выживаемости животных и коррелирует с результатами высокой степени злокачественности. При однофакторном и многофакторном анализе были выявлены высокие показатели Ki67, коррелирующие со снижением времени послеоперационной выживаемости.
Низкий индекс Ki67 характерен для мастоцитом с менее агрессивным поведением. Напротив, высокий индекс Ki67 (большое количество клеток с красной ядерной маркировкой) был связан с более коротким временем выживания и высоким риском метастазирования.
Лучшим средством для выявления низкодифференцированной мастоцитомы, которая проявляет более агрессивное поведение, использовали маркер Ki67, а также паттерн мембранной локализации KIT.
Результаты исследования, представленные в таблице 1, свидетельствуют о взаимосвязи между гистологической классификацией спонтанных дермальных мастоцитомм, экспрессией иммунногистохимических маркеров CD117 (KIT) и ki-67 и выживаемостью собак с этими заболеваниями. Так у собак с низкодифференцированными мастоцитомами экспрессия белка CD117 (KIT) встречалась у 14 (73,3%) из 15 собак (100%), а экспрессия иммуномаркера клеточной пролиферации ki-67 - у 12 собак (93,3%) из этой группы. Тогда как, у собак с высокодифференцированными мастоцитомами экспрессии
белков CD117 (KIT) и ki-67 не было выявлено ни у одной собаки. Результаты наших исследований подтвердили гипотезу о том, что животные со спонтанными дермальными мастоцитомами, демонстрирующие аберрантную иммуноэкспрессию CD117 (KIT), имели большее количество летальных исходов.
Таблица 1. Сравнительная оценка гистологической классификации мастоцитом по Patnaik и Kupel с результатами иммунногистохимических исследований
Степень дифференцировки, в Кол-во больных, в абсолютных величинах Иммуногистохимические маркеры
Patnaik Kupel CD117 (KIT) экспрессия ki-67 экспрессия
Голов % Голов % Голов % Голов %
Высоко дифференцированная, 5 11,9 27 64,2 0 0 0 0
Умеренно дифференцированная, G2 25 59,5 - - 4 16,0 11 48,0
Низко дифференцированная, G3 12 28,6 15 35,8 12 73,3 14 93,3
Заключение. По результатам исследований выявлены мембранная и перимембранная очаговая/точечная или диффузная цитоплазматическая иммуннореактивность клеток опухоли к антителам к KIT (CD 117). Мембранная - низкая степень злокачественности, перимембранная - высокая степень злокачественности.
Проведенная оценка пролиферативной активности спонтанных кожных мастоцитом собак выявила наличие редкой красная ядерная маркировки при благоприятном прогностическом типе (высокий индекс Ki67) и большого количества красной ядерной маркировки при неблагоприятном прогностическом типе (низкий индекс Ki67).
Комплексный подход, включающий гистологические и иммунногистохимические исследования, является определяющим фактором типирования опухоли и прогностическим важным фактором спонтанных дермальных мастоцитом.
Список источников
1. Withrow and MacEwen's Small Animal Clinical Oncology. 6th Edition by David M. Vail; Douglas Thamm; Julius Liptak and Publisher Saunders. October 2019
2. Dobson Dzheyn M., Lastselles B., Dunkan K. Onkologiya sobak i koshek. - Moskva, 2017. - S. 419-432
3. Donald J. Meuten and all. Tumors in Domestic Animals // Set in 9/11pt Minion Pro by SPi Global, Pondicherry, India. - 2017, С. 44-88, 176-203.
4. Kiupel M, Webster JD, Bailey KL, et al. Proposal of a 2-tier histologic grading system for canine cutaneous mast cell tumors to more accurately predict biological behavior. Vet Pathol. 2011;48:147-155.
5. London CA, Seguin B. Mast cell tumors in the dog. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2003. С. 473489.
6. Tamlin VS, Bottema CDK, Peaston AE. Comparative aspects of mast cell neoplasia in animals and the role of KIT in prognosis and treatment. Vet Med Sci. 2020;6:3-18.
7. Sledge DG, Webster J, Kiupel M. Canine cutaneous mast cell tumors: a combined clinical and pathologic approach to diagnosis, prognosis, and treatment selection. Vet J. 2016;215:43-54.
8. Scase TJ, Edwards D, Miller J, et al. Canine mast cell tumors: correlation of apoptosis and proliferation markers with prognosis. J Vet Intern Med. 2006;20:151-158.
9. Ozaki K, Yamagami T, Nomura K, Narama I. Prognostic significance of surgical margin, Ki-67 and cyclin D1 protein expression in grade II canine cutaneous mast cell tumor. J Vet Med Sci. 2007;69:1117-1121.
Автор подтверждает отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
The author declares that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / Accepted for publication 02.11.2023;
© Меликова Ю.Н. 2023
