CC BY
23
ПРОФИЛИ ЭКСПРЕССИИ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ГЕНОВ-МИШЕНЕй ПРИ ДИССЕМИНИРОВАННОМ РАКЕ ЖЕЛУДКА
Ф.М. Кипкеева1, Т.А. Музаффарова1, М.Н. Нариманов2, О.А. Малехова2, Т.А. Богуш2, А.В. Карпухин1
ФБГНУ«Медико-генетический научный центр»; Россия, 115478 Москва, ул. Москворечье, 1; 2ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское ш., 24
Контакты: Фатима Магомедовна Кипкеева Foty_k@mail.ru
Цель исследования — изучение количественных профилей экспрессии матричной РНК потенциальных генов-мишеней при дис-семинированном раке желудка (ДРЖ).
Материалы и методы. Применяли количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени на парных образцах опухоль — норма.
Результаты. Наиболее часто (25—41 % случаев) повышенный уровень матричной РНК в опухоли по отношению к контролю наблюдался для генов TGF-ß (трансформирующий фактор роста ß), NRP-1 (нейропилин 1) и генов семейства VEGF (фактор роста эндотелия сосудов). Впервые при раке желудка обнаружена корреляция уровней экспрессии 3 генов: TGF-ß, NRP-1 и VEGFR-2 и обратная корреляция уровней экспрессии генов VEGF и bFGF (основной фактор роста фибро-бластов).
Заключение. Выявленная корреляция экспрессии генов TGF-ß, NRP-1 и VEGFR-2 обусловлена, видимо, взаимодействием NRP-1 с продуктами 2 других генов и может быть связана с высоким метастатическим потенциалом прогрессирующей опухоли при ДРЖ. Обнаруженная обратная корреляция экспрессии генов VEGF-А и bFGF может свидетельствовать о стимуляции ангиогенеза в опухоли при сниженной активности пути VEGF через активизацию сигнального пути bFGF. Полученные результаты следует учитывать при таргетной терапии ДРЖ.
Ключевые слова: диссеминированный рак желудка, экспрессия генов, таргетная терапия
DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-4-25-28
EXPRESSION PROFILES OF POTENTIAL TARGET GENES IN DISSEMINATED GASTRIC CANCER
F.M. Kipkeeva1, T.A. Muzaffarova1, M.N. Narimanov2, O.A. Malekhova2, T.A. Bogush2, A. V Karpukhin'
1Research Center of Medical Genetics; 1 Moskvorech'e St., Moscow 115478, Russia;
2N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology; 24 Kashirskoe Sh., Moscow 115478, Russia
Objective is the investigation of messenger RNA quantitative expression profiles of potential target genes among disseminated gastric cancer cases.
Materials and methods. Quantitative real-time polymerase chain reaction on paired tumor—normal samples.
Results. The most frequently (25—41 % of cases) an increased level of messenger RNA in the tumor with respect to normal tissue was observed for the genes of TGF-fi (transforming growth factor fi), NRP-1 (neuropiline 1) and VEGF (vascular endothelial growth factor) family genes. For the first time a correlation between the expression levels of the three genes: NRP-1, TGF-fi and VEGFR-2, and the inverse correlation of the levels of VEGF and bFGF gene expression were found.
Conclusion. The revealed correlation between the expression of TGF-fi, NRP-1 and VEGFR-2 genes is apparently due to the interaction of NRP-1 with the products of two other genes and may be associated with a high metastatic potential of the progressing tumor in disseminated gastric cancer. The observed inverse correlation of the VEGF-A and bFGF gene expression may indicate the stimulation of angio-genesis in the tumor with reduced activity of the VEGF pathway by activating the bFGF signaling pathway. The results obtained should be taken into account under targeted therapy.
Key words: disseminated gastric cancer, gene expression, targeted therapy
Рак желудка (РЖ) занимает 4-е место по заболеваемости и 2-е место по смертности среди всех онкологических заболеваний в мире. В настоящее время 5-летняя выживаемость среди пациентов
с РЖ составляет только 20—30 % [1]. Из числа ежегодно диагностированных больных в 85 % случаев сразу или в течение 2—3 лет заболевание переходит в метастатический этап. При диссеминированном
4'2017 том 16 | vol. 16
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
26 Оригинальные статьи
РЖ (ДРЖ) применяют комбинированные схемы химиотерапии, включающие 5-фторурацил, производные платины, таксаны и препараты таргетной терапии [2].
Таргетные препараты назначаются в составе комплексной терапии и с учетом механизма их действия эффективны только в том случае, если экспрессиру-ется мишень, на которую они могут воздействовать. В связи с этим существенна информация о частотах экспрессии потенциальных генов-мишеней таргетной терапии, а также о характеристиках, позволяющих судить о возможной координации их действия.
Материалы и методы
У каждого больного, включенного в исследование, были взяты парные образцы нормальной и опухолевой тканей желудка. Забор материала проводили при биопсии или во время операции пациентов, проходивших лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. В исследование вошли 30 больных ДРЖ в возрасте 29—87 лет до начала терапии. Все образцы охарактеризованы гистологически. Основное число образцов опухолевой ткани представлено аденокарциномой. Всем больным была назначена комбинированная химиотерапия. Препараты таргетной терапии (трастузумаб) были включены в схему лечения 4 пациентам, таксаны — 8.
Методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) в парных образцах опухоль — норма изучали уровни экспрессии матричной РНК (мРНК) генов VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), VEGFR-1, VEGFR-2 (рецепторы фактора роста эндотелия сосудов 1 и 2), NRP-1 (нейропилин 1), bFGF (основной фактор роста фи-бробластов), FGFR-2 (рецептор факторов роста фи-бробластов 2), TGF-ß (трансформирующий ростовой фактор ß), HER-2/neu (рецептор эпидермального фактора роста 2), TUBB-3 (ß-тубулин 3-го класса), BRCA-1 (breast cancer 1), Ki-67 и PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток).
Из каждой пары образцов выделяли суммарную фракцию РНК. Для выделения РНК использовали набор RNeasy Mini Kit (Qiagen, США). Обратную транскрипцию проводили с применением набора ImProm-II™ Reverse Transcriptase (Promega, США). ПЦР-РВ осуществляли на приборе Step One Plus (Applied Biosystems, США). Каждое измерение выполняли 3-кратно. ПЦР-РВ проводили с помощью наборов TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Biosystems, США) в соответствии с инструкцией производителя.
Для анализа полученных результатов применяли встроенную программу Applied Biosystems Step One Plus. В качестве контроля использовали ген GAPDH.
В результате обработки измерений получены значения уровней экспрессии генов в опухолевой ткани относительно нормальной. Повышенным или пониженным считали уровень экспрессии гена в опухоли, отличающийся в 2 раза и более от экспрессии в нормальной ткани. Статистический анализ данных проводили с помощью пакета стандартных программ Statistica 10.0 (StatSoft, США). Корреляции оценивали по методу Спирмена. Для определения ассоциации молекулярного признака с клиническими характеристиками или сравнения частот 2 молекулярных признаков использовали точный критерий Фишера. Значимыми считали различия между группами или значения коэффициентов корреляции при любом уровнеp <0,05.
Результаты и обсуждение
Чаще повышенный уровень мРНК в опухоли по отношению к контролю наблюдался для генов TGF-p, NRP-1 и VEGFR-2 (рис. 1). Доля больных в выборке с повышенным уровнем экспрессии TGF-p составила 41 %, NRP-1 и VEGFR-2 - 32 %. TGF-p на поздних стадиях развития опухоли является онкогеном. Он усиливает инвазивный потенциал опухоли и участвует в ангиогенезе. Высокий уровень экспрессии TGF-p связан с неблагоприятным прогнозом при гастроинтестинальных раках [3]. NRP-1 взаимодействует с ключевыми сигнальными путями, которые задействованы в инициации, развитии и метастази-ровании раковых клеток [4]. Он выступает в качестве многофункционального корецептора, связываясь и модулируя активность различных лигандов, в том числе TGF-p [5].
Нами была обнаружена корреляция уровней экспрессии TGF-p и NRP-1 (коэффициент корреляции R = 0,63; р = 0,0017; рис. 2). Экспрессия обоих этих генов коррелирует также с экспрессией гена VEGFR-2 (R = 0,66; р = 0,01 и R = 0,68; р = 0,0012 соответственно). Продукты генов VEGFR-2 и NRP-1 способны взаимодействовать между собой, поскольку NRP-1 действует как корецептор VEGF-рецепторов. Клеточная миграция, направление роста и ветвление
454035-t- 30-| 25-
I 20-
Il5-10-
5
HER-2 bFGF FGFR-2 Ki-67 NRP-1 TGF-ß1 VEGF VEGFR-1 VEGFR-2 PCNA TUBB-3 BRCA-1 Исследуемые гены
Рис. 1. Доля больных с повышенной экспрессией исследуемых генов в опухоли при ДРЖ
Рис. 2. Корреляция уровней экспрессии генов NRP-1 и TGF-P
кровеносных сосудов опосредуются комплексом VEGFR-2 и его корецептором NRP-1 [6].
Видимо, впервые обнаруженная координация экспрессии генов TGF-fi, NRP-1 и VEGFR-2 обусловлена взаимодействием NRP-1 с продуктами 2 других генов и связана с высоким метастатическим потенциалом прогрессирующей опухоли при ДРЖ. Полученные результаты указывают на актуальность завершения разработки таргетных препаратов для TGF-fi и NRP-1. Их применение для комплексного ингиби-рования 3 генов (ингибиторы VEGFR-2 имеются) может привести к наилучшим результатам при лечении ДРЖ.
VEGF-A — ключевой медиатор физиологического и патологического ангиогенеза, одна из основных мишеней антиангиогенной терапии. VEGF-A опосредует свои эффекты путем связывания с рецепторами эндотелиальных клеток. Еще одним регулятором ангиогенеза является bFGF. Имеются данные о том, что одновременная экспрессия VEGF и bFGF приводит к активному росту опухоли с высокой плотностью и проходимостью сосудов [7].
В то же время нами впервые на образцах опухолевой ткани больных ДРЖ была обнаружена обратная зависимость экспрессии генов VEGF-А и bFGF (R = —0,73; p = 0,0046). Это согласуется с версией о том, что аберрантная экспрессия bFGF является компенсаторным механизмом, позволяющим опухоли сохранить ее микроциркуляторный гомеостаз, и рассматривается как потенциальная причина устойчивости к анти- VEGF-терапии [8]. В этом случае применение бевацизумаба в качестве антиангио-генной терапии может быть недостаточно, и следует обратить внимание на блокирование других путей, которые поддерживают ангиогенез опухоли.
В исследовании, проводившемся на культуре клеток сосудистого эндотелия рака толстой кишки in vitro, было получено, что при повышении уровня экспрессии VEGF экспрессия bFGF понижалась, и, наоборот,
при подавлении VEGF бевацизумабом активировался МС^-сигнальный путь [9]. Возможно, что обнаруженный нами феномен присущ не только ДРЖ.
Ген FGFR-2 относится к членам семейства рецепторов факторов роста фибробластов. Повышение уровня экспрессии FGFR-2 связано с пролиферацией опухолевых клеток и неблагоприятным прогнозом для пациентов с ДРЖ [10]. В нашем исследовании частота повышенной экспрессии FGFR-2 составила 5 %, что согласуется с изученной в других работах частотой его амплификации при РЖ [11]. Тем не менее этот ген рассматривается в качестве мишени для таргетных препаратов, продемонстрировавших выраженный и продолжительный эффект на моделях ксенотрансплантата РЖ с повышенной амплификацией FGFR-2 [12].
Одной из популярных мишеней является HER-2. Включение трастузумаба в схему лечения пациентов с РЖ, у которых наблюдалась гиперэкспрессия HER-2, позволило увеличить их общую выживаемость [13]. В нашем исследовании в случаях повышенной экспрессии гена HER-2 был также отмечен объективный эффект терапии, включающей трастузумаб. Это указывает в пользу возможности использования оценки уровня мРНК гена HER-2 в качестве предик-тивного маркера при ДРЖ.
В настоящее время нет единого мнения относительно влияния уровня экспрессии ТПВВ-3 на чувствительность опухолевых клеток к терапии ингибиторами митоза. В нашем исследовании продолжительность жизни больных с повышенным уровнем экспрессии ТиВВ-3, в схему лечения которых были включены таксаны, оказалась выше, чем у пациентов с низким уровнем экспрессии этого гена, и составила 1 год и более (р = 0,036). Сравнение кривых выживаемости по log-rank-тесту также показало значимые различия (р = 0,004).
Примечательно, что повышенный уровень экспрессии гена В&СА-1 наблюдался только в образцах опухолевой ткани с повышенной экспрессией ТиВВ-3. Это совпадение неслучайно (р = 0,003). Как известно, BRCA-1 функционирует не только как ген репарации повреждений ДНК, но и принимает участие в процессе митоза. В связи с этим следует отметить данные, продемонстрировавшие высокую чувствительность клеточных линий к таксанам при индуцированной экспрессии В&СА-1 [14]. Можно предположить совместное действие генов В&СА-1 и ТиВВ-3 по увеличению чувствительности ДРЖ к таксанам.
Уровни экспрессии генов Ш-67 и PCNA не продемонстрировали связи с какими-либо клиническими характеристиками на исследованной выборке ДРЖ. Интересно только совпадение случаев повышенной экспрессии гена PCNA с повышенной экспрессией Ш-67.
4'2017 том 16 | vol. 16
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
28
Оригинальные статьи
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Terry M.B., Gaudet M.M., Gammon M.D. The epidemiology of gastric cancer. Semin Radiat Oncol 2002;12(2):111-27. DOI: 10.1053/srao.30814.
PMID: 11979413.
2. Когония Л.М., Корнилова А.Г. Метастатический рак желудка: новое в лекарственной терапии. Альманах клинической медицины 2013;29: 65-70. DOI: http://dx.doi. org/10.18786/2072-0505-2013-29-65-70.
3. Katz L.H., Likhter M., Jogunoori W.
et al. TGF-p signaling in liver and gastrointestinal cancers. Cancer Lett 2016;379(2):166-72. DOI: 10.1016/j. canlet.2016.03.033. PMID: 27039259.
4. Li L., Jiang X., Zhang Q. et al. Neuropil-in-1 is associated with clinicopathology of gastric cancer and contributes to cell proliferation and migration as multifunctional co-receptors. J Exp Clin Cancer Res 2016;35:16. DOI: 10.1186/s13046-016-0291-5. PMID: 26795388.
5. Prud'homme G.J., Glinka Y. Neuropil-ins are multifunctional coreceptors involved in tumor initiation, growth, metastasis and immunity. Oncotarget 2012;3(9):921-39.
DOI: 10.18632/oncotarget.626. PMID: 22948112.
6. Djordjevic S., Driscoll P.C. Targeting VEGF signalling via the neuropilin co-receptor. Drug Discovery Today 2013;18(9—10):447—55. DOI: 10.1016/j. drudis.2012.11.013. PMID: 23228652.
7. Korc M., Friesel R.E. The role of fibroblast growth factors in tumor growth. Curr Cancer Drug Targets 2009;9(5):639—51. PMID: 19508171.
8. Lieu C., Heymach J., Overman M. et al. Beyond VEGF: inhibition of the fibro-blast growth factor pathway and antian-giogenesis. Clin Cancer Res 2011;17(19):6130—9. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-11-0659. PMID: 21953501.
9. Zhao M., Yu Z., Li Z. et al. Expression of angiogenic growth factors VEGF, bFGF and ANG1 in colon cancer after bevacizumab treatment in vitro: a potential self-regulating mechanism. Oncol Rep 2017;37(1):601—7. DOI: 10.3892/ or.2016.5231. PMID: 27840995.
10. Kilgour E., Su X., Zhan P. et al. Prevalence and prognostic significance of FGF receptor 2 (FGFR2) gene amplification in Caucasian and Korean gastric cancer cohorts.
J Clin Oncol 2012;30(suppl; abstr 4124).
11. Park Y.S., Na Y.S., Ryu M.H. et al. FGFR2 assessment in gastric cancer
using quantitative real-time polymerase chain reaction, fluorescent in situ hybridization, and immunohistochemis-try. Am J Clin Pathol 2015;143(6): 865-72. DOI: 10.1309/AJCPNFLSM-WWPP8DR. PMID: 25972329.
12. Xie L., Su X., Zhang L. et al. FGFR2 gene amplification in gastric cancer predicts sensitivity to the selective FGFR inhibitor AZD4547. Clin Cancer Res 2013;19(9):2572-83.
DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-12-3898. PMID: 23493349.
13. Bang Y.J., Van Cutsem E., Feyereislova A. et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER-2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet 2010;376(9742):687-97.
DOI: 10.1016/S0140-6736(10)61121-X. PMID: 20728210.
14. Mullan P.B., Quinn J.E., Gilmore P.M. et al. BRCA1 and GADD45 mediated G2/M cell cycle arrest in response
to antimicrotubule agents. Oncogene 2001;20(43):6123-31. DOI: 10.1038/sj. onc.1204712. PMID: 11593420.
