CC BY
6ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗаРАВООХРАНЕНПЮ
УДК 612.822-057.875
Т.В. Кушнерова
профилактика стрессовых изменений лиПидной составляющей мембран Эритроцитов студентов в период учебной нагрузки
Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток
Показано, что применение функционального пищевого продукта мармелада «Биолад-калина», содержащего биологически активную добавку «Калифен», восстанавливало антиоксидантную и антирадикальную защиту, а также соотношение липидных компонентов в мембранах эритроцитов, нарушенных стрессом, в период учебной нагрузки у студентов.
Ключевые слова: стресс, студенты, эритроциты, растительные полифенолы, липиды.
T.V. Koushneryova. Preventing stress changes in lipid content of RBC membranes in students under academic load. The authors proved that using functional nutritional product "Biolad-kalina" fruit jellies containing biologically active addition "Kalifen" resulted in restored antioxidant and antiradical defence, lipid complexes ratio in RBC membranes disordered by stress, during academic load in students.
Key words: stress, students, RBC, vegetable polyphenols, lipids.
Одним из наиболее массовых и доступных оздоровительных продуктов, содержащих биологически активные вещества растительного происхождения, могут стать в России фруктово-ягодные кондитерские изделия, обладающие высокой биологической ценностью. Наиболее распространенным видом фруктово-ягодных кондитерских изделий является мармелад, в котором агар может служить носителем биологически активных добавок (БАД). Одним из видов функциональных пищевых продуктов, разработанных для профилактики нарушений, вызванных стрессом, нами был использован мармелад «Биолад-калина» (ТУ 9128-152-02067936—2006), содержащий в своем составе БАД «Калифен» (свидетельство на товарный знак — RU № 228327 и En № 225516). «Калифен» представляет собой экстракт из калины (Viburnum Sargentii Koehne), запатентованный как БАД к пище (патент RU № 2199249). В его состав входит широкий диапазон полифенольных соединений: катехины, лейкоантоцианы, флавонолы, процианидины, олигомерные таннины и лигнин. Полифенолы составляют свыше 60 % сухого остатка экстракта. В ранее проведенных исследованиях на животных было установлено, что «Калифен» обладает мембранопротекторными и
антирадикальными свойствами в условиях экспериментального стресс-воздействия [7].
Целью работы явилось использование функционального пищевого продукта мармелада желейного «Биолад-калина», содержащего в своем составе БАД «Калифен», для адаптации студентов к учебной нагрузке.
М а т е р и а л ы и м е т о д и к и. Проведено исследование эритроцитов крови 20 студентов дневного отделения вуза в возрасте 18—20 лет (2-й семестр после поступления в вуз), после которого им было предложено ежедневно утром принимать в течение 6 нед по 100 г мармелада «Биолад-калина», что соответствует 100 мг общих полифенолов в сутки. Доза в 100 мг соответствует известной терапевтической дозе для полифенольных гепатопротекторов [3]. В учебные дни студенты пили чай с мармеладом под наблюдением медицинского работника, а в выходные дни мармелад принимали самостоятельно. Контрольную группу составляли здоровые доноры сопоставимого со студентами возраста. Проводили сравнение исследованных параметров эритроцитов крови до приема мармелада и после его приема, а также с контрольными величинами. В 1-ю группу (контрольную) включено 20 здоровых доноров-мужчин; во 2-ю группу — 20
студентов-мужчин до приема мармелада, 3-я группа — студенты 2-й группы после приема мармелада. Исследование одобрено Комитетом по вопросам этики Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН.
Выделение эритроцитов из гепаринизирован-ной крови и определение осмотической устойчивости эритроцитов к понижению концентрации хлористого натрия осуществляли традиционными методами. Экстракцию общих липидов из эритроцитов проводили по методу [12]. Состояние антиоксидантной системы оценивали по величине антирадикальной активности крови, активности супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, уровня восстановленного глутатиона, малонового диальдегида по методам, описанным в руководстве [8]. Фракционное разделение фосфолипидов и их количественное определение осуществляли методом двумерной тонкослойной хроматографии [15]. Хроматографическое распределение нейтральных липидов и их количественное определение проводили методом одномерной тонкослойной хроматографии [10]. Количественное содержание отдельных фракций выражали в процентах от общей суммы нейтральных липидов и фосфолипидов соответственно.
Сравнительный анализ биохимических характеристик антиоксидантной защиты показал, что в крови студентов до приема мармелада с БАД «Калифен» отмечалось достоверное повышение активности супероксиддисмутазы на 11 % (р < 0,05) по сравнению с таковыми величинами в контрольной группе (909±24 ед/мл эритроцитов против 822±28 ед/мл эритроцитов). На 15 % (р
< 0,001) выше контрольного уровня зафиксирована активность ключевого фермента глутатио-нового звена — глутатионпероксидазы (70,90 ± 2,03 против 61,70±1,91 нмольНАДФН/мин/ мл плазмы в контроле). Одновременно было отмечено снижение уровня восстановленного глутатиона на 23 % (3,66±0,13 мкмоль/г Hb против 4,73±0,22 мкмоль/г № в контроле, р
< 0,01). Полученные данные свидетельствуют о напряжении системы антиоксидантной защиты организма, что подтверждается снижением уровня антирадикальной активности (896±74 против 1270±45 ед. тролокса/мл плазмы в контроле; p < 0,001). Увеличение концентрации в крови малонового диальдегида (4,02±0,18 нмоль/мл против 3,46±0,19 нмоль/мл в контроле; p < 0,05) определяет активацию перекисного окисления липидов, а также повышение проницаемости мембран. Подтверждением этого является снижение порога окончания гемолиза эритроцитов до 0,40±0,01 % №С1, в то время как начало ге-
молиза соответствовало норме (в норме гемолиз эритроцитов начинается при концентрации 0,45 % №С1, заканчивается — 0,35 % №С1). То есть мембрана эритроцитов обладает пониженной устойчивостью к гемолизирующему агенту.
Известно, что влияние стресса сопровождается образованием семихинонных радикалов адреналина, инициирующих свободно-радикальные реакции, а также передачей неспаренного электрона кислороду с образованием супероксидного радикала и развитием окислительного стресса [1, 2]. Таким образом, исследованные биохимические параметры крови говорят о том, что под действием учебной нагрузки в организме студентов активируются свободнорадикальные процессы, которые истощают антиоксидантную систему организма, что обусловливает повышение перекисного окисления липидов и проницаемости мембран.
Сравнение показателей нейтральных липидов в эритроцитах студентов до приема мармелада (2-я группа) с таковыми в контроле (табл. 1) показало у первых увеличение триацилглицеринов на 14 % (р < 0,05) и холестерина на 6 % (р < 0,05). Одновременно было снижено количество эфиров жирных кислот и эфиров холестерина в среднем на 11 % (р < 0,01) и 17 % (р < 0,01) соответственно. Эти изменения обусловлены активацией периферического липолиза в жировой ткани в ответ на выброс в кровь катехоламинов под действием стресса. При этом в липопротеинах крови увеличивается содержание холестерина и триацил-глицеринов поступающих в мембраны эритроцитов [6]. В то же время заметно снижается количество этерифицированного холестерина, что может быть обусловлено ингибированиием активности фермента лецитин:холестерин-ацилтрансферазы
(ЛХАТ) [11].
Фосфолипидный состав эритроцитов крови студентов до приема мармелада также отличался от контрольных значений (табл. 2). Ярко выражен повышенный уровень лизофосфатдилхолина (на 60 %; р < 0,001), что свидетельствует об активации фосфолипазы А2 и увеличении проницаемости мембран. Однако компенсаторной реакцией на повышение проницаемости явилось повышение уровня сфингомиелина (19,17±0,27 % против 18,20±0,23 %; р < 0,01), при этом количество фосфатидилинозита было ниже на 5 % (р < 0,05), а фосфатидной кислоты на 60 % (р < 0,001). Рассогласование липидных компонентов в структуре эритроцитарных мембран студентов под действием учебной нагрузки обусловлено стрессовой реакцией, а также сниженной антиоксидантной защитой.
Применение мармелада, содержащего в своем составе БАД «Калифен» (3-я группа), сопровождалось восстановлением до контрольных величин (1-я группа) активности супероксид-дисмутазы (834±22 ед/мл эпритроцитов), глу-татионпероксидазы (62,88±1,84 нмоль/мл/ мин), величины восстановленного глутатиона (4,33±0,12 мкмоль/г НЬ), малонового диаль-дегида (3,54±0,06 нмоль/мл), антирадикальной активности (1165±84 ед. тролокса/мл). Начало гемолиза эритроцитов произошло при концентрации 0,40±0,01 % №С1, а завершение гемолиза — при 0,30±0,01 % NaCl, то есть границы осмотической устойчивости расширились на 0,05 % №С1 относительно контроля.
Анализ содержания нейтральных липидов в эритроцитах обследуемых 1-й и 3-й групп показал, что применение мармелада способствовало нормализации в соотношении исследуемых фракций. В то же время обращает на себя внимание факт более высокой концентрации эфиров холестерина в мембранах эритроцитов 3-й группы.
Данный феномен обусловлен активацией растительными полифенолами, входящими в состав БАД «Калифен», фермента ЛХАТ [4].
При сравнении фосфолипидного состава мембран эритроцитов студентов после приема мармелада с таковым в контроле следует также отметить нормализующий эффект: количество практически всех исследованных фосфолипидных фракций не отличалось от контрольных величин, за исключением повышенного содержания фос-фатидной кислоты (на 10 %, р < 0,001). Однако это позитивный фактор, так как, по-видимому, происходит преобразование триацилглицеринов (увеличение на 7 % во 2-й группе) в фосфа-тидную кислоту, которая является основой для синтеза всех глицерофосфолипидов.
Для выяснения биохимических механизмов мембранопротекторного эффекта мармелада с БАД «Калифен» проведено сравнение показателей антиоксидантной защиты у обследуемых 2-й и 3-й групп (до и после приема мармелада). Следует отметить, что в эритроцитах 3-й группы
Т а б л и ц а 1
содержание фракций нейтральных липидов в эритроцитах крови (в % от суммы всех фракций; M ± 111)
Фракция нейтральных липидов 1-я группа Контроль (доноры) 2-я группа До приема мармелада 3-я группа После приема мармелада
ТАГ 16,50±0,61 18,77±0,77* **15,93±0,51
СЖК 16,60±0,34 17,80±0,23** ***15,08±0,58
ЭЖК 17,14±0,51 15,19±0,44** ***18,34±0,80
ХС 21,21±0,70 22,46±0,45* ***19,76±0,46
ЭХС 18,13±0,62 15,05±0,98** ***20,63±0,97*
Остаточная фракция 10,42±0,73 9,73±0,81 10,26±0,87
Фракция фосфолипидов 1-я группа Контроль (доноры) 2-я группа До приема мармелада 3-я группа После приема мармелада
ФХ 33,70±1,19 32,20±0,98 33,95±0,82
ЛФХ 3,50±0,09 5,60±0,17*** ***3,33±0,18
СМ 18,20±0,23 19,17±0,27** ***18,00±0,20
ФЭ 20,98±0,80 21,60±0,77 20,93±0,85
ЛФЭ 3,11±0,03 3,10±0,06 3,08±0,03
ФС 8,74±0,13 8,08±0,15 8,53±0,14
ФИ 7,00±0,12 6,65±0,11* 6,93±0,10
ФК 4,77±0,03 3,60±0,04*** ***5,25±0,06***
Примечание: ФХ — фосфатидилхолин, ЛФХ — лизофосфатидилхолин, СМ — сфингомиелин, ФЭ — фос-фатидилэтаноламин, ЛФЭ — лизофосфатидилэтаноламин, ФС — фосфатидилсерин, ФИ — фосфатидилинозит, ФК — фосфатидная кислота.
Примечание: здесь и в табл. 2 * р < 0,05; ** р < 0,01; *** р< 0 ,001; звездочки справа — сравнение с контролем; слева — со 2-й группой. ТАГ — триацилглицерины, СЖК — свободные жирные кислоты, ЭЖК — эфиры жирных кислот, ХС — холестерин, ЭХС — эфиры холестерина.
Т а б л и ц а 2
Содержание фракций фосфолипидов в эритроцитах крови (в % от суммы всех фракций; М ± т)
по сравнению с таковыми величинами во 2-й группе на 8 % (р < 0,05) снизилась активность супероксиддисмутазы, на 11 % (р < 0,001) — глутатонпероксидазы, на 18 % (р < 0,01) возрос уровень восстановленного глутатиона и на 12 % (р < 0,05) уменьшилось содержание малонового диальдегида. Это обусловило рост антирадикальной активности на 30 % (р < 0,001). Также отличалась осмотическая устойчивость эритроцитов к понижению концентрации №С1 до и после приема мармелада: в 3-й группе границы устойчивости выросли на 0,1 %, что свидетельствует о повышении эластичности мембраны.
Сравнительный анализ количественного содержания фракций нейтральных липидов до (2-я группа) и после приема мармелада (3-я группа) у последних отмечалось равнозначное достоверное снижение триацилглицеринов и свободных жирных кислот, величина которых была ниже таковой во 2-й группе на 15 % (Р < 0,01—0,001). На 12 % (р < 0,001) произошло снижение холестерина, а количество эфиров жирных кислот и эфиров холестерина возросло на 21 % (р < 0,001) и 37 % (р < 0,001) соответственно.
При сравнении величин фосфолипидных фракций эритроцитарных мембран между 2-й и 3-й группами были отмечены достоверные различия. Так, значительно снизилось количество лизофосфатидилхолина (на 40 %, р < 0,001) и сфингомиелина (на 6 %; р < 0,001) при одновременном повышении фосфатидной кислоты на
46 % (р < 0,001).
Такие изменения в липидной составляющей мембран эритроцитов свидетельствуют о мем-бранопротекторном эффекте БАД «Калифен» в составе мармелада. Биохимический механизм действия исследуемого функционального пищевого продукта мармелад «Биолад-калина» обусловлен тем, что растительные полифенолы, входящие в состав БАД, имеют способность улавливать свободные оксигенные и пероксиль-ные радикалы, образуя при этом относительно стабильный феноксил-радикал [14]. Это в значительной степени сдерживает процессы перекисного окисления липидов и снимает состояние оксидативного стресса. В результате уменьшается уровень малонового диальдегида и увеличивается антирадикальная активность, что свидетельствует об увеличении антиоксидантного статуса. Влияние «Калифена» на обмен липидов, процессы их перекисного окисления, антиокси-дантную систему в значительной мере обусловлено непосредственным участием входящих в его состав полифенолов, которые способны выступать в качестве самостоятельной окислительно-
восстановительной системы (фенол-семихинон-хинон). В этой системе важная роль отводится нестойкому семихинонному радикалу, играющему роль «ловушек» для реакционно-способных радикалов [13].
В ы в о д. Aнализируя результаты исследования по применению функционального пищевого продукта мармелада «Биолад-калина», содержащего в своем составе БЛД «Калифен», следует отметить целесообразность его использования как продукта направленного действия для профилактики стресса, вызванного повышенной умственной и эмоциональной нагрузкой.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Aртеменков A.A. // Гиг. и сан. 2007. № 1. С. 62—64.
2. Барабой B.A., Брехман И.И., Голотин В.Г., Ку-дряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. С-Пб.: Наука, 1992.
3. Венгеровский A.И., Маркова И.В., Саратиков A.C. // Ведомости фарм. комитета. 1999. № 2. С. 9—12.
4. Гаскина Т.К., Курилович C.A., Горчаков В.Н. // Вопр. мед. химии. 1989. Т. 35, № 4. С. 24—28.
5. Геворкян Э.С., Минасян С.М., Ксаджикян H.H., Даян A.B. // Гиг. и сан. 2005. № 5. С. 55—57.
6. Грибанов ГЛ. // Успехи совр. биол. 1979. Т. 87, вып. 1. С. 16—33.
7. Кушнерова Н.Ф., Спрыгин В.Г., Фоменко С.Е., Рахманин ЮЛ. // Гиг. и сан. 2005. № 5. С. 17—21.
8. Новгородцева Т.П., Эндакова ЭЛ, Янькова В.И. Руководство по методам исследования параметров системы «Перекисное окисление липидов — антиоксидантная защита в биологических жидкостях». Владивосток: Изд-во Дальневосточного ун-та, 2003.
9. Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф., Гордейчук Т.Н., Фоменко С.Е. // Экспер. и клинич. фармакол. 2002. Т.
65, № 4. С. 56—58.
10. Amenta J. S. // J. Lipid. Res. 1964. Vol. 5, N 2. P. 270—272.
11. Carrasco M.P., Segovia J.L., Marco C. // Biochem. Pharmacol. 1998. Vol. 56, N 12. P. 1639—1644.
12. Folch J, Less M., Sloane-Stanley G.H. // Biol. Chem. 1957. Vol. 226. P. 497—509.
13. Jovanovic S.V., Steenken S., Simic M.G., Hara Y. // Flavonoids in health and disease / Ed. by C.A. Rice-Evance and S.L. Packer. N.-Y.: Marcel Dekker, 1998. P. 137—161.
14. Sanz M.J., Ferrandiz M.L., Cejudo M. et al. // Xenobiotica. 1994. Vol. 24, N 7. P. 689—699.
15. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasenden I.M. // J. Chromatography. 1975. Vol. 114, N 1. P. 129—141.
Поступила 20.01.09
