CC BY
29
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Профилактика и терапия экспериментальной формы лихорадки Западного Нила рибавирином
С. Я. ЛОГИНОВА, С. В. БОРИСЕВИЧ, Ю. И. ПАЩЕНКО, В. П. БОНДАРЕВ
Филиал федерального государственного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации» — «Вирусологический центр», Сергиев Посад
Ribavirin Prophylaxis and Therapy of Experimental West Nile Fever
S. YA. LOGINOVA, S. V. BORISEVICH, YU. I. PASHCHENKO, V. P. BONDAREV
Virological Centre, Branch of Central Research Institute No. 48 of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Sergiev Posad
Изучение эффективности рибавирина в отношении вируса Западного Нила в постоянных культурах клеток свидетельствует о том, что исследуемый препарат в высоких концентрациях эффективно подавляет репродукцию вируса (коэффициент ингибирования 100%). Рибавирин при инъекционном применении в течение 7 суток в дозе 20 мг/кг по схеме экстренной профилактики высокоэффективно защищает от гибели 85 % белых мышей, инфицированных вирусом Западного Нила в дозе 10 ЛД50.
Ключевые слова: лихорадка Западного Нили, рибавирин, противовирусная эффективность, культура клеток.
Investigation of the efficacy of ribavirin against the West Nile virus in standard cell cultures showed that in high concentrations it inhibited the virus reproduction (the inhibition coefficient of 100%). In the experiments on albino mice infected with the West Nile virus in a dose of 10 LD50 ribavirin was used in the form of injections in a dose of 20 mg/kg for 7 days in the scheme of urgent prophylaxis and proved to be highly efficient in protection of the animals from death (85-percent survival).
Key words: West Nile fever, ribavirin, antiviral efficacy, cell culture.
Введение
За последние 10 лет на территории Южного федерального округа Российской Федерации сформировался устойчивый активный очаг лихорадки Западного Нила (ЛЗН), поддерживаемый циркуляцией вируса Западного Нила среди мелких млекопитающих, птиц, комаров и подтверждаемый наличием иммунного ответа к вирусу ЛЗН у населения. Очаг инфекции имеет тенденцию к своему расширению, поэтому актуальным является поиск противовирусных препаратов, эффективных в отношении ЛЗН [1].
Анализ данных зарубежной литературы свидетельствует о наличии ряда эффективных противовирусных препаратов в отношении возбудителя ЛЗН. Так, специалистами доказана активность ви-разола (рибавирина) и a-2b интерферона in vivo [2] и in vitro [3, 4]. Израильскими исследователями сконструирован гомологичный иммуноглобулин [5], обеспечивающий эффективное лечение тяжё-
© Коллектив авторов, 2009
Адрес для корреспонденции: 141306 Московская обл., Сергиев Посад-6. Филиал ФГУ 48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны РФ «Вирусологический центр»
АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2009, 54; 11-12
лых случаев ЛЗН [6, У]. В Австрии кампанией Baxter была выявлена эффективность иммунной плазмы in vitro [8]. Для терапии заболевания были созданы человеческие и гуманизированные антитела, а также Fab-фрагменты, которые по эффективности in vivo на белых мышах и сирийских хомяках не уступали гомологичному иммуноглобулину [9—11]. В 200У г. в США были проведены клинические испытания сконструированных экспериментальных образцов рекомбинантной химерной вакцины (II фаза) [12], однако до настоящих исследований препараты не разрешены к применению на людях. Отечественными специалистами выявлена умеренная активность индуктора интерферона амиксина в отношении ЛЗН по схеме экстренной профилактики [13], подтвержденная в эпидемических очагах инфекции 1999—2002 гг. в Волгоградской области [14].
С учётом изложенного расширение арсенала отечественных эффективных неспецифических средств профилактики и лечения этого вирусного заболевания является актуальным.
Целью настоящей работы явилась оценка противовирусной эффективности рибавирина в
17
-е-
Таблица 1. Результаты изучения подавления рибавирином репродукции вируса Западного Нила в культурах клеток
Препарат Культура клеток Доза препарата, мкг/мл Инфекционный титр вируса, lg БОЕ/мл Подавление репродукции вируса А, lg Ки, %
Рибавирин GMK-АН-ЦД) 100 0 4,6 100
Реаферон 105 0 4,6 100
Контроль (без препарата) — 4,6 — —
Рибавирин СПЭВ 100 2,6 3,4 99,96
Реаферон 105 2,1 3,9 99,98
Контроль (без препарата) — 6,0 — —
отношении экспериментальной формы лихорадки Западного Нила.
Материал и методы
Вирус. В экспериментах использовали вирус Западного Нила, штамм Eg-101, полученный из ГУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» РАМН. В качестве инфицирующего препарата использовали 10% вируссодержащую суспензию головного мозга белых мышей. Инфекционный титр возбудителя определяли на белых мышах при интрацеребральном и подкожном инфицировании, а также по формированию негативных колоний в монослое культуры клеток почек африканской зеленой мартышки — ОМК-АН-1(Д).
Культуры клеток. Использованы постоянные культуры клеток почек зеленых мартышек — ОМК-ЛН-1(Д) и свиньи — СПЭВ. В качестве ростовой среды и среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на растворе Хенкса, содержащую 7,5 и 2% сыворотки крупного рогатого скота соответственно. Препараты вносили в поддерживающую среду культур клеток через 1 час после инфицирования. Инфицирующая доза вируса составила 0,01 БОЕ/клетку.
Препараты. В работе использовали рибавирин (1-/3-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид) производства Dragon Hwa ChemPhaim Co. Limited, серия 20031110; виразол (рибавирин) капсулированный производства ICN Pharmaceuticals (Швейцария).
В качестве референс-препарата использовали реаферон — производства ЗАО «ВЕКТОР-ФАРМ», Россия, серия 16.
Перед применением препараты растворяли в стерильном физиологическом растворе. Препараты вводили внутримышечно в исследуемых дозах по схемам: профилактика — в течение 3 суток до инфицирования один раз в день и за 1 ч до инфицирования; экстренная профилактика — через 1 ч после инфицирования и далее в течение 6 суток один раз в день; лечение — через 24 ч после инфицирования и далее в течение 6 суток один раз в день.
Животные. Для моделирования летальной формы ЛЗН использовали белых мышей массой 6—8 г. Животных заражали подкожно в дозе 10ЛД50. Наблюдение за инфицированными животными проводили в течение 21 суток, при этом контролировали гибель мышей дважды в течение суток.
Оценка противовирусной эффективности лекарственных препаратов осуществлена в соответствии с требованиями [15]. Противовирусную эффективность препаратов in vitro оценивали по следующим показателям:
— снижение уровня накопления вируса под воздействием препарата (A, lg);
— коэффициент ингибирования (Ки, %).
Уменьшение уровня накопления вируса в тканях головного мозга под влиянием препарата (A, lg) определяли по формуле:
A = Ап — Ао, (1)
где Ап — уровень накопления вируса без внесения препарата, lg БОЕ/мл; Ао — уровень накопления вируса с внесени-
ем препарата, lg БOE/мл.
Коэффициент ингибирования (Ки, %) рассчитывали по формуле:
( _ (——— —
Ки :
^о]
■ X 100%, (2)
где Аконтр — уровень накопления вируса без внесения изучаемого препарата, БОЕ/мл; Аоп — уровень накопления вируса при внесении изучаемого препарата, БОЕ/мл.
Противовирусную эффективность рибавирина оценивали по защите экспериментальных животных от гибели (в %). В качестве дополнительных критериев служили: показатель среднего времени жизни (дни) и уровень подавления репродукции вируса в ткани головного мозга (А, 1^).
Результаты и обсуждение
В результате изучения подавления рибавирином репродукции вируса Западного Нила в культуре клеток ОМК-АН-1 (Д) установлено, что препарат в концентрации 100 мкг/мл полностью подавляет репродукцию возбудителя (табл. 1). В культуре клеток СПЭВ рибавирин так же, как препарат сравнения реаферон, выявил высокую противовирусную активность в отношении возбудителя ЛЗН. Уровень подавления накопления вируса составил для рибавирина и реаферона 3,4 ^ и 3,9 ^ соответственно. Коэффициент ингибирования составил для рибавирина и реаферона 99,96 и 99,98% соответственно.
Результаты изучения эффективности рибавирина и виразола при экстренной профилактике экспериментальной формы ЛЗН у белых мышей представлены в табл. 2. Показано, что при внутримышечном введении рибавирин по схеме экстренной профилактики проявлялась наибольшая защитная эффективность в суточной (разовой) дозе 20 мг/кг. Защита от гибели инфицированных животных составила 90,0%, увеличение показателя среднего времени жизни животных в группе составило 5,6 суток по сравнению с контрольной группой инфицированных белых мышей. Следует отметить, что увеличение разовой дозы рибавирина не приводило к повышению его протек-тивной эффективности. Снижение защитной эффективности, вероятно, связано с токсичностью высоких концентраций препарата, так как в дозе 100 мг/кг защита от гибели составила всего 10%. Защитная эффективность виразола (66,7%)
АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2009, 54; 11-12
-о-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 2. Выбор эффективной дозы рибавирина и виразола при экстренной профилактике экспериментальной формы лихорадки Западного Нила у белых мышей
Препарат Доза препарата, Частота гибели Защита от гибели, СВЖ, Увеличение
мг/кг животных % сутки СВЖ, А, сут
Рибавирин 20 1/10 90,0 14,6 5,6
40 2/10 80,0 14,1 5,1
80 8/10 20,0 11,6 2,6
100 9/10 10,0 10,0 1,0
Виразол 20 У/10 30,0 11,0 2,0
40 3/9 66,У 13,2 4,2
80 8/10 20,0 11,4 2,4
100 8/10 20,0 8,9 —
Контроль дозы — 10/10 — 9,0 —
Контроль стада — 0/10 — 15 —
Таблица 3. Результаты оценки эффективности рибавирина в отношении экспериментальной формы
лихорадки Западного Нила у белых мышей (инфицирование в дозе 10ЛД50)
Препарат Схема Коэффициент Среднее Удлинение Уровень накопления вируса
защиты, % время среднего в головном мозгу павших
жизни, времени животных
сут жизни, А, сут lg БОЕ/мл А, lg
Рибавирин -У2 ч, -48 ч, -24 ч, -1 ч (профилактика) 50,0 1У,1 4,9 6,1 2,2
+ 1 ч, +24 ч, +48 ч, +У2 ч, +96 ч, +120 ч,
+ 144 ч (экстренная профилактика) 85,0 21,0 8,8 0 8,3
+24 ч, +48 ч, +72 ч, +96 ч, +120 ч,
+ 144 ч (лечение) 10,0 12,3 0,1 У,8 0,5
Контроль дозы — — 12,2 — 8,3 —
Контроль стада — — 21,0 — — —
была максимальной в дозе 40 мг/кг, что значительно ниже, чем рибавирина инъекционного.
В дальнейшем для выбора оптимальной схемы применения препарата животным вводили рибавирин внутримышечно в дозе 20 мг/кг.
Установлено, что рибавирин защищал от гибели 50% животных при профилактической схеме и 85% животных при применении его по схеме экстренной профилактики (табл. 3). В то же время при лечебной схеме защитная эффективность рибавирина составила 10 %. Наиболее высокий показатель удлинения среднего времени жизни при применении рибавирина по схеме экстренной профилактике составил 8,8 суток, однако при лечении рибавирином этот показатель практически не отличался от такового для контрольной группы.
Следует отметить, что в результате применения рибавирина по схеме экстренной профилактики экспериментальной формы ЛЗН у погиб-
ших животных в тканях головного мозга возбудитель не был обнаружен. При профилактическом применении препарат также статистически достоверно снижал уровень накопления возбудителя в ткани головного мозга погибших от инфекции белых мышей (2,2 ^).
Таким образом, рибавирин в высоких концентрациях эффективно ингибирует репродукцию вируса в различных линиях перевиваемых культур клеток. Рибавирин в суточной дозе 20 мг/кг (равноэквивалентная доза для человека 150 мг/кг) высокоэффективен в отношении экспериментальной формы ЛЗН у белых мышей при инъекционном применении по схеме экстренной профилактики (курсовая равноэквивалентная доза для человека — 1050 мг/кг) и может представлять интерес для практической медицины при применении его в ранние сроки выявления этого инфекционного заболевания.
ЛИТЕРАТУРА 6
1. Борисевич С. В., Бондарев В. П. Лихорадка Западного Нила: прошлое и настоящее. Мол мед 2008; 5: 47—51. 7.
2. Odelola H. A. Antiviral activity of Virazole on replication of viruses iso-
lated in Nigeria. Current Chemotherapy / Siegenthaler W., Lathy R. eds. Washington: American Society of Microbiology. 1978; 1: 3343—3345. 8.
3. Jordan I, Briese T, Fisher N. et al. Ribavirin inhibits West Nile virus replication and cytopathic effect in neural cells. J Infect Dis 2000; 182: 1214—1217.
4. Anderson J. F, Rahal J. J. Efficacy of interferon alpha-2b and ribavirin
against West Nile virus in vitro. Emerg Inf Dis 2002; 8: 1:107—108.
5. Ben-Nathan D, Lustig S., Tam G. et al. Prophylactic and therapeutic 10.
efficacy of human intravenous immunoglobulin in treating West Nile virus infection in mice. J Infect Dis 2003; 188: 5—12.
АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2009, 54; П-12
Shimoni Z., Niven V. J., Pitlick S., Bulvic S. Treatment of West Nile virus encephalitis with intravenous immunoglobulin. Emerg Inf Dis 2001; 7: 4: 759.
Ben-Nathan D., Gershoni-Yahalom O., Samina I. et al. Using high titer West Nile intravenous immunoglobulin from selected Israeli donors for treatment of West Nile virus infection. BMC Infect Dis 2009; 17: 9: 18.
Planitzer Ch. B., Modrof J., Kreil Th. R. West Nile virus neutralization by US plasma-derived immunoglobulin products. J Infect Dis 2007; 196: 435-440.
Oliphant T., Engle M., Nybakken G. et al. Development of a humanized monoclonal antibody with therapeutic potential against West Nile virus. Nat Med 2005; 11: 522-530.
Gould L. H., Sui J., Foellmer H. et al. Protective and therapeutic capacity of human single chain Fv-Fc fusion proteins against West Nile virus. J Virol 2005; 79: 14606-14613.
19
-Q-
11. Nybakken G, Oliphant T., Johnson S. et al. Structural basis for neutralization of a therapeutic antibody against West Nile virus. Nature 2005; 437: 764—769.
12. Hall R. A., Khromykh A. A. ChimeriVax-West Nile vaccine. Curr Opin Mol Ther 2007; 9: 5: 498—504.
13. Логинова С. Я., Ковальчук А. В., Борисевич С. В. и др. Противовирусная эффективность индуктора интерферона амиксина в отношении экспериментальной формы лихорадки Западного Нила. Вопр вирусол 2004; 2: 14—17.
14. Петров В. А. Лечение больных лихорадкой Западного Нила // Мат. расширенного пленума проблемной комиссии «Арбовиру-сы» и науч.-практ. конф. «Арбовирусы и арбовирусные инфекции», 17—20 октября 2006 г. Астрахань. М.: 2007; 204—208.
15. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: 2005.
20
АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 2009, 54; 11-12
