CC BY
35
663.63.01:578.08
ПРОБЛЕМЫ ПИРОГЕННОСТИ ВОДЫ В ПИЩЕВОЙ ТЕХНОЛОГИИ: ЕЕ ПРИРОДА И КОНТРОЛЬ
Н.В. АЛЕШИНА, В.Н. ВАСИЛЬЕВ, И.Ф. ЯНЧЕНКО
Кубанский государственный университет
Проблема химического состава и качества воды — технологического агента многих пищевых производств, а также обязательного компонента исходного сырья и готовой продукции, во многом определяющего их состояние и потребительские свойства, включая биологическую ценность, — относится к числу наиболее актуальных.
Одной из малоисследованных характеристик воды является пирогенность, обусловленная присутствием в ее составе веществ органической природы, попадание которых в организм человека и теплокровных животных вызывает резкое повышение температуры тела [1]. Основной причиной пирогенности воды могут служить эндотоксины (2], т.е. липополисаха-риды, прочносвязанные с клеточными структурами бактерий и освобождающиеся при распаде или разрушении клеток в результате действия физических или химических факторов [3, 4]. Попадая с водой в организм, эндотоксины вступают во взаимодействие с клеточными мембранами; при этом их полисахаридная часть присоединяется к белковому рецептору (вероятно, лектиновой природы), расположенному на мембране [5]. Это приводит к высвобождению ц-АМФ, что, в свою очередь, запускает биосинтез простагландинов либо способствует их высвобождению в значительных количествах [2, 6]. Пироген-ный эффект имеет двухфазный характер и достигает максимума через 1 и 3 ч [7].
Установлено [4, 8], что все бактериальные эндотоксины состоят из трех частей:
липида А, обусловливающего токсичность и сходного у всех грамотрицательных бактерий;
олигосахарида кор, являющегося антигеном-ми-шенью и одинакового для каждого вида бактерий;
о-специфических цепей, определяющих серологическую принадлежность эндотоксинов.
Примерная структура липополисахарида для Salmonella newington и архитектоника клеточной оболочки грамотрицательных бактерий (/ — липо-полисахарид, 2 — двухслойная фосфолипидная мембрана, 3 — внешний слой, 4 — оболочка, 5 — клеточная мембрана, 6 — периплазматическая область, 7 — пептидогликан (ригидный слой), 8 — липопротеин) представлены на рисунке.
Полисахаридная часть эндотоксина обеспечивает его присоединение к клеточной мембранё, а токсичный липид А инициирует процессы, приводящие к появлению пирогенного эффекта. Хими-
ческое строение липида А определяет интенсивность пирогенности липополисахарида [7,9—11]. Так, образцы липида А, не содержащие фосфора или о-ацильных заместителей, слабо пирогенны. Его формы, не содержащие заместителя при С-3 атоме глюкозаминобиозы, практически не пирогенны (11]. Образование липидом А комплекса с белковым носителем усиливает пирогенный эффект, причем отмечено влияние природы носителя на пирогенную активность комплекса- [9].
SaCmomOa wnAnftm
• f~* тлти*Ы.тжшч/
С~»С -HC-HC-MC-HiP-ty
* С+-мне г—с*
АгГ ке-МН-Ст
Ь - О -( КД0)Г- Гrtt -fm ~Г/ио~Гм- >'■** -Ул* “Ра* -Нм
L0C-9 К Р Глл ГллМЛщ
м р
1,Л
" с.--------;----------и-------_------. I»_______________1
/ищи! А Х»Р ЮрМЛЮАНт*
Рфооо**,
* . At
. ■
Способность липополисахаридов вызывать интоксикации и пирогенные эффекты была замечена достаточно давно. Сейчас известно несколько ме-' тодов выявления и количественного определения эндотоксинов [8, 12—15].
В мировой практике для определения пирогенности воды широко применяются методы с использованием кроликов в качестве тест-организма [16] и лизата амебоцитов морского животного мечехвоста Ыти1и$ роИркетиз (тривиальное название ♦ подковообразный краб») [13]. Последний известен также под названием £у4/.-тест.
Первый метод биоконтроля пирогенности заключается в инъекции пробы исследуемой ВвДЫ в виде физраствора в ушную раковину кролика и последующем наблюдении за температурой его
тела. Для устранения влияния индивидуальных особенностей организма на результат анализа исследования одновременно проводятся не менее чем на трех животных [16]. Наиболее стабильные результаты получаются на серых кроликах весом от 2,5 до 3,5 кг; более легкие животные обладают повышенной чувствительностью к пирогенности воды [8]. В фармакопее разных стран допустимая суммарная величина повышения температуры тела^/ трех кроликов варьируется в пределах 1,4-—1,15 С [8, 1/]. Продолжительность проведения анализа также различна.
Достоинства этого метода в том, что кролики — теплокровные животные и их реакция на пироген-ность наиболее близка человеческой. Недостатком считается длительность анализа, значительные затраты на инфраструктуру, потребность в тщательном отборе и проверке животных перед исследованием. Кроме того, есть сообщения о способности кроликов отвечать пирогенной реакцией на инъекции .заведомо апирогенной воды [12, 18].
Метод определения пирогенности с использованием лизата амебоцитов Ити1и$ роИрНетиз дает наиболее достоверные результаты при анализе воды. С небольшими модификациями он широко применяется для исследования плазмы крови и других веществ [13]. Метод основан на обнаруженной американскими учеными в 1959 году способности лизата амебоцитов мечехвоста образовывать гель в присутствии даже небольших количеств бактериальных эндотоксинов [19]. Амебоциты, представляющие собой клетки гемолимфы мечехвоста. содержат свертывающийся белок — коагу-логен и высокомолекулярный проэнзим, который после активации эндотоксином преобразует коагу-логен в гель коагулин [20]. Полагают, что эта реакция — защита от бактериальной контаминации и биохимически близка к процессу свертывания крови у позвоночных [21].
Сейчас известно около десяти разновидностей Ь4£.-теста. Анализ проводят в пробирках, кюветах, планшетах, капиллярах [22—24]. О присутствии пирогенов судят по образованию прочного геля либо по появлению помутнения (если лизат разведен в 10—15 раз), которое обычно анализируют спектрофотометрически ]25] В последнее время предпочтение отдается варианту с добавлением хромогенного субстрата, представляющего собой связанный с л-нитроанилином полипептид [26— 28]. Он носит название ОС/.-1000. или количественный хромогенный ЬАЬ-тест. При проведении анализа этим способом активированный эндотоксинами энзим лизата отщепляет от хромогенного субстрата л-нитроанилин в концентрации, пропорциональной количеству эндотоксина. Чувствительность этого варианта теста 1 нг/мл, время полного анализа 16 мин (28]. Ярко-желтое окрашивание пробы может служить и для качественного определения наличия эндотоксинов.
В настоящее время промышленное производство Ц\Ь-теста освоено рядом зарубежных фирм: Е-Гоха1е-”51£гпа” — США, Руго1е51-”ОЛсо” — США, Руго51а1-”МППроге” — США, Ругоде1-«Саре СОО
Jnc.» — США, Pyrogent-”Mallenkrodt” — Великобритания, Pre-geI-”Teikoki-Hormone” —Япония, QCL-1000-’’Serva” — ФРГ и др. [8, 13, 23]. В основе физико-химического определения эндотоксинов лежит колориметрический метод, предложенный Джанда и Ворк в 1971 г. и основанный на способности карбоцианиновых красителей образовывать окрашенные ассоциаты с эндотоксинами, спектральные максимумы которых смещаются в более коротковолновую область по сравнению с максимумом самого красителя [1]. Методы люминесцентный, с использованием родамина 6Ж и
1-анилино-нафталин-8-сульфоната, и полярографический C.LLI. Чаусовского [29] по чувствительности в 100 раз превосходят LAL-тест, но они, к сожалению, не нашли широкого практического применения, так как требуют дорогостоящих особо чувствительных приборов.
Известен широко применяющийся в исследовательских целях микробиологический метод контро-> ля пирогенности [12], основанный на подсчете' общего количества микроорганизмов перед стерилизацией исследуемого образца. Вода считается апирогенной при содержании в ней не более 10 микроорганизмов в 1 мл. Однако этот метод не учитывает разделения микроорганизмов на грамот-рицательные и грамположительные, в то время как известно, что источником эндотоксинов являются только первые [6, 18]. Рекомендуется [12] метод обнаружения грамотрицательных (пирогенобразу-ющих) микроорганизмов по реакции гелеобразова-ния при их взаимодействии с 3%-ным раствором гидроксида калия. В случае образования геля делается вывод о наличии в исследуемой воде хотя бы одной колонии грамотрицательных микроорганизмов или минимум 20 мкг липополисахаридов [12]. Метод дает возможность проводить экспресс-конт-роль пирогенности воды и других препаратов в процессе производства лекарственных средств.
Таким образом, наиболее предпочтительным для окончательной проверки воды на содержание пи-рогенных веществ во многих странах, а в Российской Федерации единственно возможным, продолжает оставаться, несмотря на ряд недостатков, определение пирогенности с использованием кроликов [16. 30]. Другие методы — физико-химические и микробиологические -— признаются перспективными и пригодными для экспресс-анализа на промежуточных стадиях производства лекарственных препаратов [12, 13, 31].
ЛИТЕРАТУРА
1. Применение карбоцианиновых красителей в анализе бактериальных липополисахаридов (эндотоксинов) / Михеева М.П.. Горшкова Р.П., Брутко Л.И. / / Химия природных соединений. — 1988. — №1. — С. 29—32.
2. Мсцлер Д. Биохимия. — М.: Мир. — 1980. — 2. — С. 554—558.
3. Luderiti О. et all. Microbal Membrane Lipids. Current Tories in Membranes and Transport. — N.-Y.: Acad. Press. — 1982. — V. 17. — P. 79.
ІЄЛИКО-
тюния,
23]. В
ндоток-предло-ный на образо-инами,
ЮТСЯ В | !НИЮ С
люми-6Ж и >графи-ІЬНОСТИ :ожале-іимене-! чувст-
ледова-контро-_ одсчете' і стери-итается )лее 10 ■тод не грамот-гмя как ляются ] метод образу-іразова-■твором ія дела-<отя бы рганиз-,ов |12]. :с-конт-затов в ств.
ШМ для ние пи-Россий-продол-:татков, ем кро-кимиче-:я перс-анализа «екарст-
лизе бак-/ Михее-я природ-
- г. —
ent Tories
- 1982. -
4. Общие и специфические свойства липополисахарида Neisseria meningitidies в сравнении с липополисахаридами других грамотрицательных бактерий / Стукалова Н.В.. Алексахина Н.Н., Баснакьян И.А. //Ж. микробиол,, эпидемиол. и иммунобиологии. — 1989. — № 12. — С. 81—87.
5. О взаимодействии соединений кремния и лектинов / Алешин Н.Е., Алешина Н.В., Алешин Е.П. // Докл. АН СССР, 1988. — 302. — № 2. — С. 507—509.
6. Турьяиов М.Ф. Биологические свойства бактериальных эндотоксинов / / Советская медицина. — 1983. — № 7. — С. 31—34.
Т. International Reviev of Biochemistry, Bioshemistry of Lipids
11. / Galanos C., Luderitz O., Rietschel E.Th., Westphal O, // Baltimore: University Park Press. — 1977. — V. 14. — P. 239.
8. Щедрина JI.E., Брутко Л.И. Состояние и перспективы развития методов обнаружения бактериальных пирогенов в лекарственных средствах // Фармация. — 1989. — № 2. — С. 69-73.
9. Структура и свойства липида А — компонента эндотоксинов грамотрицательных бактерий / Красикова И.Н., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. // Химия природных соединений. — 1989. — № 5. — С. 601— 616.
10. Novotny A. Relationship of strukture and biological activity of bacterial endotoxins // Naturwissenschaften. — 1971. — V. 58. — № 8. — S. 397—409.
H.Qurechi N., Takayama K. Purification and struktural determination of nontoxic lipid A obtained from the lipopolysaccaride of Salmonella typhimurium // J. Biol. Chem. — V. 257. — № 19. — P. 11808—11815.
12. Изучение возможности обнаружения грамотрицательных микроорганизмов как источников бактериальных пирогенов / Щедрина Л.Е., Брутко Л.И., Мух’ина Т.Ю. // Фармация. — 1988. — № 2. — С. 33—36.
13. E-Toxate (Limulus Amewocyte Lysate) for detection and semiquantitation of endotoxin // Sigma Technical Bulletin n210. Saint Louis. Missouri. — 1988. — 15 p.
14. Nowotny A, Handbook of Endotoxins. — Amsterdam-N.-Y. — Oxford: Elsievier. — 1984. — VI. — 308 p.
15. Капустян В.А. Микрометод определения лимулюс-лиза-том эндотоксинов в крови больных острой дизентерией // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии. — 1989. — № 9. — С. 125—126.
16. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд., вып. 2. — М.: Медицина. — 1990. — 2. — С. 184, 398.
17. Киселев П.Н., Щульс Т.С. Определение содержания бактериальных эндотоксинов в крови животных и людей, подвергнутых облучению / / Лабораторное дело. — 1981. — № 9. — С. 561—563.
ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЕ СОСТАВА
А.Д. АЛЕХИН, Л.А. БУЛАВИН, В.И. КОСТЕНКО,
С.Д. ОСТАПЧЕНКО, Ю.И. ПОСУДИН
Украинская сельскохозяйственная академия
Молоко представляет собой сложную смесь белков и жиров. Первые представлены коллоидными частицами казеина, размеры мицелл которого колеблются в пределах 0,1—0,2 мкм, и частицами сывороточных белков (альбуминов и глобулинов) с
18. Черткова Ф.А., Шаповалова Т.Б. Бактериальные пирогены // М. — 1966. — 174 с.
19. Levin J., Bang F.B. Clottable protein in Limulus: Jts localization and kinetics of coagulation by endotoxin // Thromb. Diath. Haemmorrh. — 1968. — № 19. — P. 186.
20. Levin J., Bang F.B, The role of endotoxin in the extracellular coagulation оГ Limulus blood // Bull. John Hopkins. — 1964. — № 115. — P. 265.
21. Yin E.T., Galanos C., Kinsky S. Picogramm-sensitivity assay for endotoxin: Gelation of Limulus poiyphemus blood cell lysate induced by purified lipopolysaccarides and lipid A from gramnegative bacteria // Biochim. Biophys. Acta. — 1972. — № 261. — P. 284.
22. Daoust DR, Limulus amoebocyte lyzate az a method for detection of endotoxins and endotoxin-like materials / Orlowski S.J., Me Mahon G„ Weber C.K., Shaw W.C. et all // Bull. Parenter. Drug Assoc. — 1976. — № 30. — P. 13.
23^Nandan R., Brown D.R. An improved in vitro pyrogen test to detect picograms of endotoxin contamination in intravenous fluids using Limulus amoebocyte lysate // J. Lab. Clin. Med. — 1977. — № 89. — P. 910.
24. Eibert J. Jr. Pyrogen testing — horseshoe crabs VS rabbits // Bull. Parenter. Drug. Assoc. — 1972. — № 26. — P. 253.
25. Cooper J.F., Hochstein H.D., Seligmann E.B. The Limulus test for endotoxin (pyrogen) in radio-pharmacenticals and biologicals // Bull. Parenter. Drug. Assoc. — 1972. — № 26. — P. 153.
26. Щедрина Л.Е., Брутко Л.И. Обнаружение бактериальных липополисахаридов в дистиллированной воде спектрофотометрическим методом // Науч. тр. ВНИИ фармации. — 1984. — 22. — С. 174—176.
27. Harris R.L., Stone P.C.W., Stuart J. An improwed chromogenic substrate endotoxin assey for clinical use // J. Clin. Pathol. — 1983. — № 36. — P. 1145.
28. Limulus Amoebocite Lisate. Quantitative Chromogenic LAL. Third Generation Pyrogen Testing. 120 test kit // Whittaker Bioproducts. — 18 p.
29. Чаусовский С.Ш. Применение полярографического метода в контроле качества некоторых избранных групп лекарственных средств: Дис. ... канд. мед. наук. — М.. 1971.
30. U.S.P. Pyrogen Test, US Pharmacopeia, 19th ed. // United States Pharmacopeia Cenvention, Inc., Rockville, MD. Technic for Pyrogen Test. — 1975. — P. 613.
31. Greisman S.E., Hornick R.B. Comparative pyrogenic reaktivity of rabbit and man to bacterial endotoxin // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. — 1969. — № 131. — P. 1154.
Кафедра физической химии '
Поступила 23.10.92
637.127.002.56:543.4
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛОКА
размерами 0,01—0,02 мкм. Размеры жировые шариков изменяются от 1 до 10 мкм, подчиняясь определенному распределению [1]. Оптическое излучение, пропущенное через образец молока, поглощается, отражается и рассеивается, взаимодействуя с частицами продукта. Измеряя прозрачность молока или его оптическую плотность, можно оценить содержание того или иного компонента. В этом суть турбидиметрического метода определения состава молока.
