CC BY
38
УДК 575.224.46
ПРОБЛЕМЫ КИСЛОРОДНОГО МУТАГЕНЕЗА У МИКРООРГАНИЗМОВ
© 2011 г. В.А. Чистяков
Научно-исследовательский институт биологии, Scientific Research Institute of Biology
Южного федерального университета, of Southern Federal University,
пр. Стачки, 194/1, г. Ростов-на-Дону, 344090, Stachki Ave, 194/1, Rostov-on-Don, 344090,
[email protected] [email protected]
Рассмотрены итоги 50-летнего изучения мутагенеза, вызываемого у микроорганизмов кислородом. Установлено, что механизмы ге-нотоксичности кислорода весьма сложны. Формирование мутаций может быть связано не только с повреждением ДНК активными формами кислорода, но и с инактивацией репарационных ферментов. Сделан вывод о том, что проблематика кислородного мутагенеза отнюдь не исчерпана и остается актуальной и для генетики XXI в.
Ключевые слова: кислород, мутагенез, микроорганизмы, супероксид-анион, синглетный кислород.
The results of fifty years study of oxygen mutagenesis at microorganisms was consider. In these studies, it was found that the mechanisms of ge-notoxicity of oxygen are very complex. Formation of mutation may be associated not only with DNA damage from reactive oxygen species, but also with the inactivation of repair enzymes. It is concluded that the problems of oxygen mutagenesis is not exhausted, and remains valid for the genetics of XXI century.
Keywords: oxygen, mutagenesis, microorganisms, superoxide-anion, singlet oxygen.
Впервые мутагенный эффект кислорода был обнаружен в 1957 г. [1] Стрептомицигоависимый штамм Е. соИ обрабатывали кислородом при 4-105 ^1,013-Ш6 Па в течение 16 ч и определяли частоту реверсий к стреп-томициннезависимости. Контролем являлась обработка при 1,013-Ш6 Па 16 ч воздухом, азотом и смесью азота с кислородом.
В более поздних экспериментах было показано, что повышенное давление кислорода и повышенное до 80 % содержание кислорода в воздухе (гипероксия) способны вызывать мутации у дефектных по различным типам репарации штаммов бактерий, но не у дикого типа [2]. Мутагенный эффект гипербарической оксигенации (ГБО) на основании результатов, полученных на прокариотах, был сближен по механизму действия с эффектом ионизирующей радиации. Однако позже было показано, что в отличие от радиации генетический аппарат клетки не является мишенью
летального действия ГБО, вследствие чего летальный и генетический эффекты ГБО слабо коррелируют между собой [3].
В 80-е гг. ХХ в. Е.П. Гуськовым была инициирована серия работ по изучению влияния различных режимов ГБО на бактериальные клетки разного генотипа и клетки дрожжей разной плоидности [3]. Исследования выполнены в едином методическом пространстве с использованием стандартных режимов обработки ГБО, эталонных в генетической токсикологии штаммов микроорганизмов и стандартных методов статобработки. Генетические эффекты бактерий и дрожжей обнаружены после давления 6-1,013-106 Па при экспозиции 4 ч и выше, но не для меньших давлений и экспозиций. Достоверная индукция мутаций у бактерий зарегистрирована лишь для штаммов, дефектных по эксцизионной репарации - Т100 S. typhi-murium и WP-2S E. coli. Не было зарегистрировано
индукции мутагенеза для дикого штамма E. coli WP-2 и RecALexA штамма СМ871. Для дрожжей зарегистрированы слабый рекомбиногенный эффект для диплоидных штаммов и отсутствие мутагенного эффекта как для диплоидного, так и для гаплоидного штаммов. Эффекты, вызванные непрерывной обработкой ГБО, незначительны для всех тест-объектов. Максимум, которого удалось достичь, - троекратное превышение числа прототрофов в опыте над контролем.
В данной работе обнаружен ряд эффектов, характерных для кислородного, но не радиационного мутагенеза. Наиболее неожиданный из них - усиление эффекта с фракционированием дозы. Так, дробление 6-часовой обработки дрожжей штамма П3 85 1 6,08-105 Па на 2 - 3-часовые с 20-минутным перерывом при нор-мобарии дало более чем 10-кратное увеличение частоты индуцированных рекомбинантов. Аналогичное дробление дозы для штамма WP-2S E. coli дало увеличение эффекта в 5,5 раз. Однако этот эффект не проявляется для штамма TA100 S. typhimurium, для которого дробление дозы уменьшает эффект, как это характерно для радиационного мутагенеза.
В свое время авторы работы не смогли достаточно убедительно объяснить данный феномен. Сейчас, когда накоплен большой фактический материал, надежно подтверждены данные о способности ГБО синхронизировать деление самых различных клеток, в том числе и E.coli [4-6]. Очевидно, усиление эффекта при дроблении дозы может иметь место в том случае, если в клеточном цикле существуют стадии, чувствительные к кислородному мутагенезу, и 2-я обработка приходится на момент, когда большинство клеток находятся на чувствительной стадии. Для микроорганизмов чувствительной стадией для кислородного мутагенера и рекомбиногенеза может быть момент репликации изучаемого гена.
К началу 80-х гг. были в основном сформированы современные представления о механизмах защиты живых форм от кислорода [7].
Открытие системы ферментов антиоксидантной защиты и изучение генетического контроля этой системы дало возможность конструировать штаммы бактерий, чувствительные к атмосферному кислороду [8]. Опубликован ряд других работ этого направления, основные результаты подытожены в [9].
1. Двойной мутант Exoli sodAsodB, не способный синтезировать MnSOD и FeSOD, показал значительное (около 2 порядков) увеличение частоты мутаций резистентности к рифампицину (Rif^-Rif) при аэробном росте по сравнению с диким штаммом.
2. Одиночный мутант, дефектный по MnSOD, показал меньшее (около одного порядка) увеличение частоты мутаций.
3. Одиночный мутант, дефектный по FeSOD, но сохранивший активность MnSOD, не показал такого увеличения вообще.
4. Частота прямых мутаций к прототрофности по тимину для двойного мутанта по SOD в аэробных условиях на порядок превысила таковую для анаэробных условий. Выращивание бактерий в присутствии чистого кислорода при нормобарии увеличивало частоту мутаций еще на порядок.
5. Обработка внутриклеточным индуктором супероксид-аниона плюмбагином вела к 4-кратному увеличению частоты мутаций для sodAsodB штамма, 2-кратному - для sodA и не влияла на штамм sodB.
6. Присутствие плазмиды, вызывающей повышение продукции супероксиддисмутазы, понижало частоту мутаций у всех штаммов до уровня дикого штамма.
7. Ни в одном из вариантов опыта не обнаружено достоверной SOS-индукции, из чего авторы сделали вывод о RecA-независимости кислородного мутагенеза.
8. Частота мутаций у тройных мутантов sodA-sodBxth- - дефектных по супероксиддисмутазе и эн-донуклеазе III, ключевому ферменту репарации окислительных повреждений ДНК, в аэробных условиях не отличалась значительно от этого показателя для дикого типа; введение плазмиды, несущей ген xth+, вело к повышению частоты мутаций в 8,5 раз.
Авторы статьи предположили, что существуют 2 основных механизма кислородного мутагенеза. 1-й связан с повреждением ДНК супероксид-анионом, 2-й - с нарушением точности репликации (в том числе репарационной) ДНК в результате окислительного повреждения участвующих в этом процессе ферментов. В последующие годы был опубликован ряд работ, показавших неспособность суперокосид-аниона повреждать ДНК непосредственно [10, 11], что делает 1-е предположение маловероятным. 2-е также не получило однозначного экспериментального подтверждения. Однако есть данные, говорящие о том, что активные формы кислорода (АФК) способны вызывать нарушения работы ферментов репарации неправильно спаренных оснований ДНК (mismatch repair, MMR) в клетках человека [12-15].
Агентом, вызывающим кислородный мутагенез, вполне может быть и синглетный кислород, который генерируется в клетке при спонтанной дисмутации супероксидных радикалов [16, 17].
Способность синглетного кислорода повреждать нуклеиновые кислоты и вызывать мутации достаточно надежно подтверждена [18, 19]. В [19] показано, в частности, что обработка синглетным кислородом однонитевой ДНК гибридного фага M13mp19 ведет к 25-кратной индукции мутаций во встроенном фаг LAC опероне.
Таким образом, многие вопросы, поставленные в работах конца ХХ в., посвященных кислородному мутагенезу микроорганизмов, остаются актуальными и в настоящее время.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (проект по аналитической ведомственной целевой программе «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 гг.)», грант № 2.1.1/5628).
Литература
1. Fenn W. Cothran F. Mutagenic effect of high oxygen ten-
sion on Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. 1957.
Vol. 43. P. 1027-1031.
2. Kelley M., Baden J. Oxygen mutagenicity // Mutation re-
search. 1980. Vol. 77. P. 185-188.
3. Влияние гипербарической оксигенации на выживае-
мость, мутагенез и рекомбиногенез одноклеточных организмов / Е.П. Гуськов [и др.] // Цитология и генетика. 1987. Т. 21. С. 10-15.
4. Гуськов Е.П., Дворкина Р.М., Гончаренко И.И. Действие
гипербароксигенации на деление клеток проростков растений // Цитология. 19826. Т. 24. С. 257-262.
5. Гуськов Е.П., Шкурат Т.П. Влияние гипербарической
оксигенации на включение Н3-тимидина в клетки фиб-робластов человека разной плоидности // Цитология и генетика. 1993. Т. 27. С. 47-53.
6. Gifford C. Toxicity of hyperbaric oxygen to bacteria in rela-
tion to the cell cycle and catalase synthesis // J. Gen. mi-crobiol. 1968. Vol. 52. P. 375-379.
7. Fridovich I. Oxygen toxicity: A radical explanation // The
J. of Experimental Biology. 1998. Vol. 201. P. 1203-1209.
8. BruynickxH., Mason N., Morse S. Are physiological oxygen
concentration mutagenic? // Nature. 1978. Vol. 274. P. 606-607.
9. Farr S.B., D'Ari R., Touati D. Oxygen dependent mutagene-
sis in Escherichia coli lacking superoxide dismutase // Proc. Natl. Acad. Sci. 1986. Vol. 83, № 11. P. 8268-8272.
10. Деградация нуклеиновых кислот в условиях генерации
супероксид-аниона в присутствии ионов меди / Д.И. Водолазкин [и др.] // Молекулярная биология. 1987. Т. 21. С. 1664-1670.
11. Marnett L.J. Oxyradicals and DNA damage // Carcinogene-
sis. 2000. Vol. 21. P. 361-370.
Поступила в редакцию
12. Oxidative stress inactivates the human DNA mismatch re-
pair system / C.L. Chang [et al.] // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2002. Vol. 283. P. 148-154.
13. Cadmium is a mutagen that acts by inhibiting mismatch repair
/ Y.H. Jin [et al.] // Nat. Genet. 2003. Vol. 34. P. 326-329.
14. Decreased expression of the DNA mismatch repair gene
Mlh1 under hypoxic stress in mammalian cells / V.T. Mi-haylova [et al.] // Mol. Cell Biol. 2003. Vol. 23. P. 32653273.
15. Skinner A.M., Turker M.S. Oxidative mutagenesis, mismatch
repair, and aging // Sci. Aging Knowledge Environ. 2005. Vol. 9. P. 3.
16. Corey E.J., Mehrotra M.M., Khan A.U. Water induced dis-
mutation of superoxide anion generates singlet molecular oxygen // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. Vol. 145. P. 842-846.
17. DelCanto M.C., Gurney M.E. Development of central nerv-
ous system pathology in a murine transgenic model of human amyotrophic lateral sclerosis // Am. J. Pathol. 1994. Vol. 145. P. 1271-1279.
18. De Toledo S.M., Duran N., Singh H. Inactivation of Esche-
rihia coli ribosomes by the bioenergized system: malonal-dehyde /horseradish peroxidase // Photobiochemistry and photobiophysics. 1983. Vol. 5. P. 237-243.
19. Singlet oxygen mutagenicity induced in the lac operon / D.
Decuyper-Debergh [et al.] // Archive int. physiol. et biochem. 1986. Vol. 94. P. 535-538.
30 июля 2010 г
