CC BY
257
ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ
В.А. Меркулов, Н.Д. Бунятян, С.М. Радаев
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России, Москва
Резюме: В статье представлены современное понимание клеточной терапии, история вопроса с момента возникновения термина «стволовая клетка» и до настоящего времени, рассмотрены типы стволовых клеток их особенности и эффекты, обращается внимание на основные понятия клеточной медицины, необходимые для понимания сути проблемы. Отдельно обсуждаются успехи и проблемы клинического применения стволовых клеток из различных источников, вопросы эффективности и безопасности их применения, а также сложности правового регулированием производства лекарственных препаратов на основе клеточных технологий.
Ключевые слова: стволовые клетки, костный мозг, аутоиммунные заболевания, проблема стандартизации стволовых клеток, клеточная терапия.
PROBLEMS AND PERSPECTIVES OF CELL THERAPY IN CLINICAL PRACTICE V.A. Merkulov, N.D. Bunyatyan, S.M. Radaev
Abstract: The following article introduces modern interpretation of cell therapy, historical background since the first appearance of the term «stem cell» up to the present moment. The article also considers different types of stem cells, their special characteristics and effects, the attention is given to basic concepts of cell medicine, which are necessary for understanding the point of the matter. Special consideration is given to achievements and problems of the clinical use of different types of stem cells, and to efficacy and safety of their use, as well as difficulties in legal regulation system in manufacturing of medicines, based on cell technologies.
Key words: stem cells, bone marrow, autoimmune diseases, problem of standardization of stem cell, cell therapy.
Клеточная терапия в настоящее время является одной из самых многообещающих и быстро развивающихся областей медицины. Клеточные технологии зачастую успешно применяются при лечении широкого спектра заболеваний.
Стволовая клетка (СК) — это клетка, способная продолжительное время производить как себе подобные дочерние клетки, так и клетки, обладающие другими, более ограниченными свойствами (дифференцированные или специализированные клетки) [1]. СК — прародительницы всех клеток нашего организма, способные к самообновлению, в процессе деления образующие специализированные клетки различных тканей. Таким образом, все клетки нашего организма возникают из СК. Они способны обновлять и замещать клетки, утраченные в результате каких-либо повреждений во всех органах и тканях. СК призваны восстанавливать и регенерировать организм человека с момента его рождения.
Определяющими свойствами стволовых клеток являются следующие: неспециализированные (недифференцированные) клетки, не выполняющие никакой работы; способные к самообновлению (т.е. к повторяющимся циклам деления, в результате которых образуется по крайней мере одна дочерняя клетка, полностью повторяющая исходную и обладающая способностью к дифференцировке); из СК могут развиться специализированные (дифференцированные) клетки.
В настоящее время не ясно, сколько существует видов СК в организме человека, поскольку имеются трудности с выявлением и трактовкой поверхностных маркеров клеток, а также с методиками их определения. Все известные в настоящее время маркеры не позволяют с полной уверенностью отделить СК от транзиторных форм клеток, в том числе и потому, что между этими двумя группами клеток наблюдается постепенный переход [2].
Предполагается, что у разных типов СК существуют схожие механизмы регуляции, в т.ч. и генные (эффект «стволовости») [3].
Важной характеристикой СК является ее потенциал — диапазон различных типов клеток, в которые она способна дифференцироваться. Другая важная характеристика большинства типов СК — способность к асимметричному делению, в результате которого получаются две дочерние клетки с различным направлением дифференцировки или одна из дочерних клеток уходит в процессы дифференцировки, а другая остается стволовой — копией материнской клетки.
Истинная СК является тотипотентной, т.е. способной дать начало любому типу клеток организма и сформировать весь организм целиком. Тотипотент-ностью обладают клетки зиготы и клетки меристемы растений. Клетки взрослого организма позвоночных таковыми не являются [1].
Говоря о СК, необходимо учитывать важную роль в их поведении и последующей судьбе спе-
ОБЗОРНЫЕ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ
ОБЗОРНЫЕ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ
циализированного клеточного микроокружения, обеспечивающего поддержку и генерацию стимулов, необходимых для их самообновления, а также определяющего, в какой именно тип клеток будет дифференцироваться их потомство. Такое микроокружение можно модулировать как in vitro, так и in vivo, заставляя некоторые типы СК дифференцироваться в требуемом направлении. Каждая ткань организма имеет свой специфический ген — регулятор дифференцировки.
СК по своему происхождению делят на эмбриональные, фетальные, СК пуповинной крови и СК взрослого человека. С 5-го по 75-й день эмбрионального развития из зародыша можно выделить эмбриональные СК. Они плюрипотентны, т.е. способны дифференцироваться в любые клеточные линии, включая и половые клетки, а также во все типы клеток внешних эмбриональных тканей. Но у этого источника СК есть недостатки: во взрослом организме они способны спонтанно перерождаться в раковые [3]. Фетальные СК получают из абортивного материала на 8—12-й неделях беременности. Они способны к более частому делению, чем зрелые и могут дифференцироваться в ответ на сигналы микроокружения. Однако использование непроверенного абортивного материала, помимо этических и юридических соображений, опасно заражением пациента гемотрансмиссивными заболеваниями. При проведении диагностики материала на вирусы увеличивается себестоимость метода, что в конечном итоге приводит к увеличению стоимости самого лечения. Источником СК может явиться также плацентарно-пуповинная кровь, собранная после рождения ребенка. Однако количество СК в пуповинной крови недостаточно велико. Клеточный состав пуповинной крови очень богат. В ней присутствуют разные типы СК и клеток-предшественников, но преобладают гемопоэтиче-ские СК. На данный момент они считаются мульти-потентными, т.е. способными к дифференцировке в нескольких направлениях, восстанавливая целиком ткань или ткани.
СК обнаружены в большинстве тканей взрос -лого человека. В настоящее время описаны гемо-поэтические, эпидермальные, мезенхимальные, невральные СК и СК печени. Предполагается, что во взрослом организме такие тканеспецифичные (или региональные) клетки способны дифференцироваться, как правило, только в типы клеток, присущие именно этим тканям, и являются резервуаром репаративных клеток, которые активируются повреждением и мигрируют в рану, где кооперируют с локальными клетками и участвуют в репаратив-ном ответе. Говоря о тканеспецифичных СК важно упомянуть о таком феномене, как пластичность — окончательно не доказанной на сегодняшний день способности этих клеток к дифференцировке в дру-
гие типы клеток в зависимости от физиологических потребностей организма или повреждения определенных тканей и органов.
С точки зрения клинического применения наиболее интересны и доступны гемопоэтические и мезенхимальные мультипотентные СК. Гемопоэ-тическими стволовыми клетками (ГСК) являются клетки, дающие все гемопоэтические линии in vivo и поддерживающие образование этих клеток на протяжении всей жизни человека. Однако в настоящее время отсутствуют прямые маркеры ГСК. ГСК и примитивные гемопоэтические клетки дифференцируются от зрелых клеток крови по отсутствию у них линия-специфичных маркеров и наличию некоторых других поверхностных антигенов. Несмотря на небольшой объем знаний о миграции, выживании, самообновлении и дифференциации ГСК, они уже давно широко применяются для ауто- и аллотрансплантаций. До недавнего времени стволовые клетки костного мозга считались специфичными для гемопоэза. Однако в последующих экспериментах и клинических исследованиях была показана возможность образования различных тканей, например, мускульных, нервных клеток и гепатоци-тов после трансплантации клеток костного мозга. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были выделены из костного мозга, надкостницы, трабекулярной кости, жировой ткани, синовиальной оболочки, скелетной мускулатуры и молочных зубов. МСК способны дифференцироваться в клетки соединительной ткани, такие как кость, жир, хрящ и мускулатуру. В культуре такие клетки диффренци-руются во многие тканьобразующие клетки: кость, хрящ, жир, мускулатура, сухожилие, печень, почки, сердце и даже клетки мозга.
В процессе взросления человека количество стволовых клеток снижается: при рождении — 1 стволовая клетка встречается на 10 тыс., к 20—25 годам — 1 на 100 тыс., к 30 — 1 на 300 тыс. В 50 лет в организме уже остается всего 1 стволовая клетка на 500 тыс. Но по мере формирования организма (сначала внутриутробно, а затем в ходе естественного взросления и старения) уменьшается и регенераторная способность стволовых клеток [4]. Таким образом, самыми активными клетками, из доступных исследователям, являются эмбриональные, фетальные и клетки пуповинной крови и стенки пупочного канатика. Клетки же, полученные из организма взрослого человека, гораздо менее актив -ны, но обладают другими преимуществами, такими как онкологическая безопасность, отсутствие риска иммунологических осложнений и переноса гемо-трансмиссивных инфекций.
На данном этапе развития медицины значительный интерес вызывает внедрение в медицинскую практику клеточных технологий, под которыми подразумевается комплекс методов, на-
правленных на выделение отдельных клеток из ткани человека (чаще всего стволовых или клеток-предшественников), культивирование с целью увеличения их количества, последующее использование этих клеток для стимуляции роста, репарации или регенерации тканей.
Описаны и обсуждаются два основных эффекта клеточной терапии in vivo и in vitro: а) замещающая терапия — когда клетки, образующиеся в результате дифференцировки введенных стволовых клеток, включаются в восстанавливаемую ткань; б) «эффект стороннего наблюдателя» — когда вводимые стволовые клетки оказывают противовоспалительное, трофическое или иммуномодулирующее действие на восстанавливаемую ткань. В данном случае, очевидно, ведущую роль играет паракринный эффект, когда ростовые факторы, цитокины и прочие вещества, активно выбрасываемые в кровоток юными формами клеток, оказывают мощное стимулирующее влияние на собственные стволовые клетки организма-реципиента, расположенные в различных органах и тканях. И уже именно собственные клетки обеспечивают восстановление структуры и функции поврежденных органов. В настоящее время второй из эффектов и считается основным [5].
Первым методом клеточной терапии, внедренным в клиническую практику, является трансплантация костного мозга, применяемая с 80-х гг. в лечении онкологических и гематологических заболеваний для восстановления гемопоэза. Из костного мозга или периферической крови донора (иногда пациента в период ремиссии) выделяется чистая фракция ГСК, использование которой дает лучший эффект. Трансплантация стволовых клеток открывает не известные ранее возможности для лечения новых форм злокачественных заболеваний, улучшения переносимости химиотерапии, уменьшения реакции отторжения и др.
Схожая методика применяется и при лечении аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка, рассеянный склероз, ревматоидный артрит и болезнь Крона. После полного или частичного подавления иммунной системы пациента ему вводятся аутологичные стволовые клетки. Однако положительный эффект достигается не во всех случаях, хотя результат превосходит любые другие методы [6].
Возможно применение клеточной терапии и при сахарном диабете I типа. Трансплантация донорских Р-клеток позволяет восстановить синтез инсулина, но широкому применению метода мешает проблема отторжения и ограниченный период жизни остров-ковых клеток. Введение СК дает ангиопротектор-ный эффект, тем самым облегчается течение осложненных форм сахарного диабета. На сегодняшний день трансплантация СК при сахарном диабете проводится главным образом в качестве дополнения к
инсулинотерапии, предотвращения развития вторичных осложнений или для облегчения уже существующих [7].
Применение клеток показывает хорошие результаты в случаях, когда способности органа к регенерации недостаточны. Введение клеток в миокард после инфаркта позволяет в ряде случаев значительно улучшить функцию сердца. В настоящее время проводятся клинические испытания с использованием различных типов клеток: мезенхимальных клеток костного мозга, скелетных миобла-стов, ГСК. СК стимулируют рост новых микрососудов в ишемизированных областях, восстанавливая питание в пораженном участке. Улучшается выживаемость существующих кардиомиоцитов, возможно, также образуются новые сократительные элементы в миокарде [8].
Клеточные технологии нашли свое применение в лечении ожогов, незаживающих ран и язв. Для этого уже с 1980-х гг. используются клетки различных слоев кожи — фибробласты и кератиноциты (как аллогенные, так и аутологичные). Клетки помещаются на раневую поверхность в виде взвеси, иногда в различных матриксах или в виде ранее выращенного монослоя, таким образом стимулируется регенерация, ускоряется образование новых сосудов и заживление ран; предотвращается образование грубых рубцов [9].
Также клетки применяются в лечении болезней суставов — с начала 1990-х гг. используется трансплантация аутологичных хондроцитов (клеток — предшественников хрящевой ткани), активно разрабатываются методики, основанные на трансплантации в поврежденные суставы мезенхимальных стволовых клеток костного мозга [6].
Большие перспективы возлагаются на клеточные технологии в лечении различных нейродегенератив-ных заболеваний (болезнь Паркинсона) или травматических повреждений спинного и головного мозга. В опытах на животных восстанавливается синтез дофамина у крыс с моделью болезни Паркинсона. Также было получено восстановление функций при повреждении спинного мозга [10].
Для лечения различных форм печеночной недостаточности возможно введение ГСК, которые способны оказывать различные действия: транс-дифференцироваться в гепатоциты, стимулировать овальные клетки, увеличивать количество непаренхиматозных клеток [2].
Созданием трехмерных органов при помощи био-деградируемых матриксов или органов из нескольких тканей занимается тканевая инженерия. Методами тканевой инженерии удалось вырастить полноценный зуб у крыс, участок сосуда, многослойный им-плант кожи, фалангу пальца из кости и хряща [9].
И в нашей стране, и за рубежом до настоящего времени успешно ведутся исследования на живот-
ОБЗОРНЫЕ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ
ОБЗОРНЫЕ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ
ных моделях, но проведено крайне мало развернутых клинических исследований клеточных препаратов и тканеинженерных конструкций. Эффективность любого из методов клеточной терапии должна быть продемонстрирована с учетом требований доказательной медицины. Методы клеточной терапии начали использовать недавно, и сведения об отдаленных результатах этой терапии крайне малочисленны, поэтому было бы правильным сосредоточиться в первую очередь на тех заболеваниях, лечение которых методами классической терапии мало- или неэффективно. Нет смысла применять эти подходы к лечению тех заболеваний, которые могут быть излечены общепринятыми методами, особенно с учетом сравнения соотношения стоимости, безопасности и эффективности используемых методов.
На сегодняшний день в Российской Федерации нет зарегистрированных лекарственных препаратов, созданных на основе клеточных технологий. Основной проблемой является отсутствие надежных общепринятых методов идентификации типов клеток. В мировой практике предложены различные способы типирования клеток по белкам-маркерам, расположенным на их поверхности, но единого мнения о четкой связи того или иного маркера с функциональным состоянием данной клетки не существует. Подобная картина наблюдается и с активными веществами, продуцируемыми клетками. В настоящее время их описано более ста, но нет уверенности, какое именно из этих веществ (или их сочетание) оказывает терапевтический эффект.
К клиническому применению в РФ разрешен ряд медицинских технологий, составной частью которых
ЛИТЕРАТУРА
1. Ткачук В.А. Стволовые клетки и регенеративная медицина // М.: Изд-во МГУ. 2011. 282 с.
2. Терских В.В., Васильев А.В. Стволовые клетки // Эстетическая медицина. 2004. №4.
С.325-335.
3. Пальцев М.А., Смирнов В.Н,
Терапевтический потенциал клеток пуповинной крови при негематологических заболеваниях // М.: Медицина. 2011. 176 с.
4. Brustle O., Jones K.N. et al. ESC-derived glial precursors: a source of myelinating transplants // Science. 1999. Vol. 285.
P. 7554-7556.
являются применение аутологичных клеток, получаемых из костного мозга или периферической крови больных, либо аллогенных ядросодержащих клеток пуповинной крови. Эти клетки подвергаются выделению и очистке, но без культивирования, поскольку в настоящее время в стране не зарегистрировано ни одной среды для культуральной работы в клинических целях. В рамках этих технологий клетки применяются в виде суспензий для инъекций. Они описываются по маркерам, указывается процентное соотношение различных типов клеток и их общая или разовая доза (как правило — в миллионах штук).
Специфика применения лекарственных препаратов на основе клеточных технологий требует специально разработанной и закрепленной в нормативно-правовых актах процедуры проведения биомедицинских исследований этой продукции. Лекарственные препараты на основе клеточных технологий могут разрабатываться и производиться только в лицензированных лабораториях, оснащенных сертифицированным оборудованием. Соблюдение данных условий требует разработки стандартов не только для лабораторий клеточных технологий, но также и для персонала, работающего в таких лабораториях, представляющих собой сочетание фармацевтического производства и клинической лаборатории. Таким образом, существующие сегодня стандарты фармацевтической промышленности не могут быть экстраполированы на деятельность лабораторий клеточных технологий [11]. В связи с этим в настоящее время назрела необходимость создания нового стандарта, учитывающего специфику работы с клеточным материалом.
5. Романов Ю.А., Смирнов В.Н. Стволовые клетки и регенерация сердца // Кардиологический вестник. 2007. №2.
С. 61-63.
6. Vemuri M.C., Chase L. G., Rao M. S. Mesenchymal stem cell assays and applications // Methods Mol Biol. 2011. Vol. 698. P 3-8.
7. Malgieri A., Kantzari E. et al Bone marrow and umbilical cord blood human mesenchymal stem cells: state of the art // Int J Clin Exp Med. 2010. Vol. 4. P. 248-269.
8. Лищук В.А., Мосткова Е.В. Стволовые клетки: исследования и практика // Валеология. 2003. №2. С. 11-20.
9. Asnaghi M. A., Candiani G. et al. Trends in biomedical engineering: focus on Regenerative Medicine // J Appl Biomater Biomech. 2011. № 2. Р. 73-86.
10. Черных Е.Р, Ступак В.В. и др. Применение аутологичных костномозговых клеток при лечении пациентов с травматическими повреждениями спинного мозга // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2007. № 2. С. 109-116.
11. Мелерзанов А.В. Проблемы регулирования отрасли клеточных технологий // Русский медицинский журнал. 2010. Том 18, № 6. С. 366-369.
