CC BY
111
Лечение и профилактика
УДК 619:616.995.122.21:1-085
ПРОБЛЕМА УСТОЙЧИВОСТИ Fasciola hepatica К БЕНЗИМИДАЗОЛАМ: ОПЫТ МИРОВОЙ НАУКИ
А.С. ГУЛЯЕВ аспирант
Институт биологии гена РАН, Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина, e-mail: Andrew Gull8 7@gmail. com
С.К. СЕМЕНОВА кандидат биологических наук Институт биологии гена РАН
И.А. АРХИПОВ доктор ветеринарных наук Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии
им. К.И.Скрябина
В обзоре рассмотрены работы последних лет по проблеме развития устойчивости Fasciola hepatica к триклабендазолу. Освещены механизмы действия и фармакокинетика альбендазола и триклабендазола.
Ключевые слова: Fasciola hepatica, устойчивость, анти-гельминтики, бензимидазолы, альбендазол, триклабендазол.
Фасциолициды можно разделить на пять основных групп: галогениро-ванные фенолы, салициланилиды, бензимидазолы, сульфонамиды и фенокси-алканы. При фасциолезе применяют три БЗ-производных: альбендазол (АБЗ, син. SKF 62979, вальбазен, центел, вермитан, албен, альбакс, атазол), мебен-дазол (МБЗ, син. R 17635, овителмин, пантелмин, телмин, вермиракс, вер-мокс, супаверм) и триклабендазол (ТКБЗ, син. ЦГА 89317, фазинекс) (рис.).
Б
Н
CI
В
Рис. Структурные формулы: А - альбендазола; Б - мебендазола; В - триклабендазола
БЗ-производные различаются по многим параметрам, в частности по возрасту фасциол, с которого они начинают действовать. Так, АБЗ имеет эффективность свыше 90 %, если возраст фасциол превышает 12 нед, а ТКБЗ имеет аналогичную эффективность гораздо раньше - уже в возрасте одной недели [1, 10].
По причине своей высокой эффективности, в последние 20 лет ТКБЗ был наилучшим в борьбе с фасциолезом сельскохозяйственных животных и человека [4]. Но уже в середине 90-х годов появились первые сообщения из Австралии о случаях устойчивости Fasciola hepatica к действию ТКБЗ [24]. Позже устойчивость к ТКБЗ была установлена и в некоторых европейских странах, например, в Ирландии, Великобритании, Нидерландах и Испании [11].
Целью данной работы был обзор гипотез, объясняющих механизмы устойчивости F. hepatica к бензимидазолам (БЗ).
Метаболизм и механизм действия ТКБЗ и АБЗ
ТКБЗ имеет необычную для БЗ структуру: хлорированное бензольное кольцо и отсутствие карбаматной группы [3, 19]. Вследствие этого он необычно активен, в противоположность другим антигельминтикам широкого действия, которые весьма ограниченно действуют на F. hepatica. Его действие распространяется помимо F. hepatica еще на два вида: F. gigantica и Fascioloides magna [10]. В то же время ТКБЗ имеет недостаточную активность против некоторых других трематод: Dicrocoelium dendriticum, Schistosoma mansoni, Paraphistomum spp. [7, 14, 37].
В организме хозяина (жвачного) ТКБЗ окисляется до двух главных метаболитов - ТКБЗ^О (сульфоксид) и ТКБЗ^02 (сульфон). В печени происходит гидроксилирование ТКБЗ и его метаболитов и выведение их в таком виде в желчь [15]. Максимальный уровень метаболитов ТКБЗ в крови овец был обнаружен через 22 ч после введения препарата (у КРС - через 30 ч) [21].
Позже было показано, что метаболизм ТКБЗ имеет комплексную природу, поскольку в его окислении, сульфатредукции и постепенном всасывании в кровь жвачного играет существенную роль микрофлора пищеварительного тракта [21, 35]. Более того, микрофлора рубца может быть резервуаром ТКБЗ, медленно высвобождающим его в пищеварительный тракт животного-хозяина [35].
ТКБЗ как и все производные БЗ действует, по-видимому, на молекулу Р-тубулина и, таким образом, нарушает зависимые от микротрубочек процессы. Доказательства этой точки зрения были получены еще 15 лет назад в исследованиях морфологических изменений тегумента, желточников и семенников F. hepatica после воздействия активным метаболитом ТКБЗ^О. Было показано, что эта обработка привела к подавлению митоза в вителлиновых и спер-матогенных клетках, нарушению транспорта в тегументе, которое приводило к полной потере тегумента [30-33]. Дополнительные свидетельства того, что именно Р-тубулин является мишенью ТКБЗ, были получены в работах по им-муноокрашиванию в субтегументальном синцитиуме F. hepatica [20, 26].
Фармакокинетика АБЗ сходна с таковой у ТКБЗ. Основными его метаболитами являются сульфоксид, сульфон и 2-аминосульфон. Максимальное количество АБЗ и метаболитов в плазме крови овец обнаруживали через 15 ч после его введения. В течение первых 120 ч 51 % препарата выводится из организма вместе с мочой. В тканях и органах АБЗ сохраняется в течение 10 сут [1].
Механизм действия АБЗ, по-видимому, сходен с ТКБЗ, а его мишенью, как выяснилось, является Р-тубулин изотипа 2 [6].
Механизм устойчивости
Известно три пути развития устойчивости (не исключающие один другой): во-первых, изменение строения молекулы-мишени, на которую действует ТКБЗ (т. е. Р-тубулин); во-вторых, изменение механизмов всасыва-
105
ния/выведения действующего вещества, и, в-третьих, изменение метаболизма ТКБЗ в организме сосальщика.
Рассмотрим эти гипотезы.
Изменение мишени. Для нематод показано, что с устойчивостью к действию производных БЗ строго ассоциированы замены в молекуле Р-тубулина фенилаланина на тирозин в позициях 167 или 200 [18, 25, 38]. У трематод же картина не столь однозначна: эти же замены есть как у R-штаммов (resistant -устойчивый), так и у S-штаммов (susceptible - чувствительный) F. hepatica. Также были обнаружены и различия в аминокислотных последовательностях между R- и S-штаммами, но пока нельзя утверждать с достаточной уверенностью, что они связаны именно с устойчивостью к ТКБЗ [29].
На молекулярном уровне показано, что аминокислотные остатки в молекуле Р-тубулина, отличающиеся у БЗ-устойчивых организмов (а это 6, 50, 134, 165, 167, 198, 200 и 257), формируют кластер, но, что только запутывает картину, не на поверхности молекулы, а внутри ее [9]. Возникает закономерный вопрос: как в таком случае ТКБЗ может достичь этого региона молекулы?
Было предложено по образцу бактериального аналога тубулина - белка FtsZ увеличить угол между N-концевым, срединным и C-концевым доменами у Р-тубулина фасциолы на 11°. Это сделало кластер вариабельных аминокислот доступным для связывания с АБЗ [23]. Этот эксперимент позволяет предположить, что именно показанные различия в строении тубулина и FtsZ делают фасциол малочувствительными к действию АБЗ. Но, стоит заметить, эта работа никак не проясняет проблему устойчивости фасциол к ТКБЗ.
В работе Robinson et al. показано, что и без того труднодоступный кластер вариабельных аминокислот в молекуле тубулина полностью закрывается новыми водородными связями, образованными благодаря аминокислотным заменам в позициях 167 и 200. Также модель, взятая в этой работе, демонстрирует, что БЗ не вызывают деполимеризацию тубулинового димера, а «фиксируют» фрагменты Р-тубулина в «открытом» состоянии, вмешиваясь таким образом уже в само формирование микротрубочек [27].
Поглощение и выведение ТКБЗ. Относительно недавно получены интересные данные, касающиеся особенностей поглощения и распространения ТКБЗ и АБЗ в организме фасциол. Так, Mottier приходит к выводам, что ТКБЗ попадает и распространяется в организме фасциол путем диффузии, а не пе-рорально, как предполагалось ранее. При этом степень диффузии в ТКБЗ и ТКБЗ^О у R-изолятов (Sligo) была достоверно ниже, чем у S-изолятов (Cullompton). Необходимо заметить также, что для АБЗ данной особенности не замечено [22, 34].
Видимо, эти специфические черты диффузии ТКБЗ связаны с работой P-гликопротеинового насоса (Pgp). Получены убедительные доказательства, что гиперэкспрессия гена Pgp у ряда нематод связана с устойчивостью к некоторым антигельминтикам [17]. Для F. hepatica показано, что путем инги-бирования экспрессии гена Pgp можно менять R- и S-статус гельминтов. Но локализацию и окончательную роль Pgp-насосов еще предстоит выяснить, поскольку есть основания предполагать, что их роль в формировании устойчивости может быть не столь определяющей [17].
Изменение метаболизма. В ряде исследований показано, что сульфокси-дирование ТКБЗ в ТКБЗ^О и ТКБЗ^Ог гораздо активнее происходит у R-изолятов [2, 28]. Использование ингибиторов показало, что флавин-монооксигеназная (ФМО) ферментная система является главным метаболическим путем для ТКБЗ, в противовес ферментной системе цитохрома P450. [2]. Более того, метимазол (ингибитор ФМО) гораздо сильнее влияет на превращение ТКБЗ в ТКБЗ^О именно у R-изолятов фасциол, чем у S-изолятов (43 и 34 % соответственно). Для сравнения: эффект пиперонил бутоксида (ингибитор цитохрома P450) проявлялся в меньшей степени и был примерно одинаков у обоих изолятов (около 12 %) [2].
Исследования в области протеомики паразитов позволили идентифицировать некоторые белки F. hepatica [16], в частности были определены белки, избыточный синтез которых наблюдается во время действия ТКБЗ именно у R-изолята (Sligo). Например, белок HSP-70 в больших количествах синтезировался в R-фасциолах под воздействием ТКБЗ^О. Эти белки защищают клетки от клеточного стресса, связываясь с частично денатурировавшими белками и предотвращая их агрегацию.
Исследования глютатион^-трансферазы (GST) у взрослых F. hepatica показали, что в метаболизм и развитие устойчивости к ТКБЗ у фасциол вовлечено белковое суперсемейство GST [8, 36].
Можно предположить, что развитие резистентности будет вести к снижению жизнеспособности паразитов, но сравнения R- и S-изолятов показывают, что это далеко не так. R-изолят (Oberon) по всем показателям жизнеспособности превосходил S-изолят (Fairhurst): фасциолы этой популяции производили больше яиц, церкариев, были более инфекционны для крыс. Способность к высокой плодовитости исключает всякое возвращение к восприимчивости лекарственных препаратов [5, 36].
Эти исследования свидетельствуют, что помимо рассмотренных ранее механизмов устойчивости существуют иные эффективные пути уклонения от действия ТКБЗ.
Как видно, проблема развития резистентности F. hepatica к действию ТКБЗ далека от своего окончательного решения. Но, уже сейчас можно распознавать устойчивые штаммы фасциол [12, 13], вести поиск новых препара-тов-фасциолоцидов, совершенствовать программы профилактики и борьбы с фасциолезом.
Работа частично финансировалась грантами РФФИ (09-04-01611а, НШ-4881.2010.4, Программой по молекулярной и клеточной биологии, ФЦП ГК № 02.740.11.0088, П1043 и ГК 16.740.11.0001.
Литература
1. Архипов И.А. Антигельминтики: фармакология и применение. - М.: Изд-во Россельхозакадемии, 2009. - С. 24-32.
2. Alvarez A.I. et al. Altered drug influx/efflux and enhanced metabolic activity in triclabendazole-resistant liver flukes // Parasitology. - 2005. - V. 131. - P. 501-510.
3. Bennett J.L., Koehler P. Fasciola hepatica: action in vitro of triclabendazole on immature and adult stages // Exp. Parasitol. - 1987. - V. 63. -P. 49-57.
4. Boray, J.C. et al. Treatment of immature and mature Fasciola hepatica infections in sheep with triclabendazole // Vet. Rec. - 1983. - V. 113. - P. 315-317.
5. Borgsteede F.H.M. et al. Lack of reversion in triclabendazole-resistant Fasciola hepatica // Vet. Rec. - 2005. - V. 156. - P. 350-351.
6. Chambers E. et al. Liver fluke P-tubulin 2 binds albendazole and is thus a probable target of this drug // Parasitol. Res. - 2010. - V. 107. - P. 1257-1264.
7. Coles G.C. et al. Anthelminthic activity of triclabendazole // J. of Helminthol. - 1986. - V. 60. - P. 210-212.
8. Cvilink et al. Xenobiotic metabolizing enzymes and metabolism of anthelminthics in helminthes // Drug Metabolism Rev. - 2009. - V. 41. - P. 8-26.
9. Downing K.H. Structural basis for the action of drugs that affect microtubule dynamics // Emerging Therapeutic Targets. - 2000. - V. 4. - P. 219-237.
10. Fairweather I., Boray J. C. Mechanisms of fasciolicide action and drug resistance in Fasciola hepatica / Fasciolosis (edited by J.P.Dalton). - Dublin City University, Republic of Ireland, 1999. - P. 239-240.
11. Fairweather I. Triclabendazole: new skills to unravel an old(ish) enigma // J. of Helminthol. - 2005. - V. 79. - P. 227-234.
12. Fairweather I. et al. Development of an egg hatch assay for the diagnosis of triclabendazole resistance in Fasciola hepatica: proof of concept // Vet. Parasitol. (in press).
13. Flanagan A.M. et al. Standartisation of a coproantigen reduction test (CRT) protocol for the diagnosis of resistance to triclabendazole in Fasciola hepatica // Vet. Parasitol. - 2011. - V. 176. - P. 34-42.
14. Guralp N., Tinar R. Trematodiasis in Turkey: comparative efficacy of triclabendazole and niclofan against natural infections of Fasciola hepatica and F. gigantica in sheep // J. of Helminthol. - 1984. - V. 58. - P. 113-116.
15. Hennessy et al. The kinetics of triclabendazole disposition in sheep // J. of Vet. Pharmacol. and Therap. - 1987. - V. 10. - P. 64-72.
16. Jefferies J.R. et al. Proteomic analysis of the excretory-secretory products of the digenean parasite Fasciola hepatica // Proteomics. - 2001. - V. 1 - P. 11281132 p.
17. Kerboeuf D. P-glycoprotein in helminths: function and perspective for anthelmintic treatment and revesal of resistance // Intern. J. of Antimicrob. Agents. -2003. - V. 22. - P. 332-346.
18. Kwa M.S.G. et al. Benzimidazole resistance in Haemonchus contortus is correlated with conserved mutation at amino acid 200 in beta tubulin isotype 1 // Mol. and Biochem. Parasitol. - 1994. - V. 63. - P. 299-303.
19. Lipkowitz K.B., McCracken M.O. A molecular modeling approach to in vivo efficacy of triclabendazole // J. of Parasitol. - 1991. - V. 77. - P. 998-1005.
20. McConville et al. Adult triclabendazole-resistant Fasciola hepatica: surface and subsurface tegumental responses to in vitro treatment with the sulphoxide metabolite of the experimental fasciolicide compound alpha // Parasitology. -2006. - V.133. - P. 195-208.
21. Mestorino et al. Pharmacokinetic disposition of triclabendazole in cattle and sheep; discrimination of the order and the rate of the absorbtion process of its active metabolite triclabendazole sulphoxide // Vet. Res. Comm. - 2008. - V. 32. -P.21-33.
22. Mottier et al. Drug transport mechanisms in helminth parasite: passive diffusion of benzimidazole anthelminthics // Exp. Parasitol. - 2006. - V. 113. - P. 4957.
23. Nogales et al. Tubulin and FtsZ form a distinct family of GTPases // Natural Structural Biology. - 1998. - V. 5. - P. 451-458.
24. Overend D.J., Bowen F.L. Resistance of Fasciola hepatica to triclabendazole // Austral. Vet. J. - 1995. - V. 72. - P. 275-276.
25. Prichard R.K. Genetic variability following selection of Haemonchus contortus with anthelmintics // Trends of Parasitol. - 2001. - V. 17. - P. 445-453.
26. Robinson et al. Triclabendazole-resistant Fasciola hepatica: ß-tubulin and response to in vitro treatment with triclabendazole // Parasitology. - 2002. - V. 124. - P. 325-338.
27. Robinson M. W. et al. A possible model of benzomidazole binding to tubulin disclosed by invoking an interdomain movement // J. of Mol. Graphics and Modelling. - 2004. - V. 23. - P. 275-284.
28. Robinson M.W. et al. The comparative metabolism of triclabendazole-sulphoxide by triclabendazole-susceptible and triclabendazole-resistant Fasciola hepatica // Parasitol. Res. - 2004. - V. 92. - P. 205-210.
29. Ryan L.A. et al. Fasciola hepatica expresses multiple a- and ß-tubulin isotypes // Mol. and Biochem. Parasitol. - 2008. - V. 159. - P. 73-78.
30. Stitt A.W., Fairweather I. Spermatogenesis in Fasciola hepatica: an ultrastructural comparison of the anthelminthic, triclabendazole («Fasinex») and the microtubule inhibitor, tubuzole // Invertebrate Reproduction and Development. - 1992. - V. 22. - P. 139-150.
31. Stitt A.W., Fairweather I. Fasciola hepatica: tegumental surface changes in adult and juvenile flukes following treatment in vitro with the sulphoxide me-
tabolite of triclabendazole (Fasinex) // Parasitol. Res. - 1993. - V. 79. - P. 529536.
32. StittA.W., FairweatherI. The effect of sulphoxide metabolite of triclabendazole (Fasinex) on the tegument of mature and immature stages of the liver fluke, Fasciola hepatica // Parasitology. - 2000. - V. 108. - P. 555-567.
33. Stitt A.W., Fairweather I. Fasciola hepatica: disruption of the vitelline cells in vitro by the sulphoxide metabolite of triclabendazole // Parasitol. Res. -2001. - V. 82. - P. 333-339.
34. Toner et al. A scanning electron microscope study on the route of entry of triclabendazole into the liver fluke Fasciola hepatica // Parasitology. - 2009. - V. 136. - P. 523-535.
35. Virkel G. et al. Assessment of the main metabolism pathways for the flukicidal compound triclabendazole in sheep // J. of Vet. Pharmacol. and Ther. -2006. - V. 32. - P. 79-86.
36. Walker S.M. et al. Stage specific differences in fecundity over the life-cycle of two characterized isolates of the liver fluke, Fasciola hepatica // Parasitology. - 2006. - V. 133. - P. 209-216.
37. Wolff K. et al. Efficacy of triclabendazole against Fasciola hepatica in sheep and goats // Vet. Parasitol. - 1983. - V. 13. - P. 145-150.
38. Wolstenholme A.J. et al. Drug resistance in veterinary helminths // Trends in Parasitol. - 2004. - V. 20. - P. 469-476.
Fasciola hepatica benzimidazole resistance: experience of the world science A.S. Gulyaev, S.K. Semyonova, I.A. Arkhipov
In article the recent achievements in anthelmintic resistance investigations are reviewed. Pharmacokinetics and mechanisms of action of albendazole and triclabendazole are considered.
Keywords: Fasciola hepatica, resistance, anthelmintics, benzimidazoles, albendazole, triclabendazole.
