CC BY
119
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
УДК 616.831-003.821
З.А. Леонова
ПРИОНЫ МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АМИЛОИДОГЕНЕЗА
Иркутский государственный медицинский университет (Иркутск)
В статье содержатся сведения о возникновении нонсенс-мутаций в жизненно важных генах SUP45 и SUP35 дрожжей-сахаромицетов, кодирующих факторы, терминации трансляции eRF1 и eRF3. Эукариотические клетки, обладают, специальными, механизмами по устранению действия этих нонсенс-мутантов. Кроме того, приведены, факты, использования дрожжевой модели, с целью изучения нейродегенеративных заболеваний.
Ключевые слова: прион, дрожжевая модель
PRIONS OF MICROORGANISMS AND THEIR USE FOR INVESTIGATION OF AMYLOIDOGENESIS
Z.A.Leonova Irkutsk State Medical University, Irkutsk
The present work contains information about appearance of nonsense-mutations in vital genes SUP45 and SUP35 of yeast Sacharomyces cerevisiae, encoding translation, termination, factors eRF1 and eRF3 respectively. Eukaryotic cells possess special mechanisms for removing of these nonsense-m.utan.ts' influence. In addition there are also facts about use of yeast model for research of neurodegenerative diseases.
Key words: prion, yeast model
В течение длительного времени все известные проявления прионового феномена были связаны лишь с белком РгР млекопитающих [4]. Обнаружение подобных белков у низших эукариот существенным образом расширило представление о прионах, в связи с чем, их можно рассматривать как общебиологическую проблему.
У микроорганизмов, в частности у дрожжей Sacharomyces cerevisiae и гриба Podospora anserine известно несколько белков, способных переходить в прионовые формы [3, 5, 9]. Эти белки определяют возникновение нехромосомно наследственных признаков. Впервые обратил внимание на сходство между прионами дрожжей и прионами позвоночных Уикнер [7].
Оказалось, что прионы дрожжей можно использовать как модель для изучения прионового явления в целом. Как объект исследования они имеют ряд явных преимуществ по сравнению с РгР млекопитающих: эксперименты с прионами дрожжей не занимают много времени, они доступны и безопасны [3, 5, 9]. Прионовая модель является перспективной для изучения амилоидо-генеза — общего патологического звена при кон-формационых болезнях. В частности, дрожжевая прионовая модель используется для исследования нейродегенеративных заболеваний [1].
Впервые наследственный фактор неядерной и немитохондриальной природы, так называемый, детерминант [PSI + ] у дрожжей Sacharomyces был описан и назван в 1965 году Брайаном Коксом. Другой наследственный детерминант дрожжей [игеЗ] был открыт Франсуа Лакрутом в 1971 году [7]. Данные детерминанты являются прионами, появляющимися при мутациях генов Sacharomyces — SUP35 и SUP45, соответственно. Эти гены отвечают за синтез факторов терминации трансляции (ризилинг-факторов), ген SUP35 у дрожжей Sacha-romyces отвечает за синтез белка еЯРЗ (другое название Sup35), ген SUP45 — за синтез еЯР1 ^ир45).
Как известно, терминация трансляции происходит тогда, когда рибосома достигает одного из стоп-кодонов (терминирующих кодонов) — UAG, UGA и иАА. Они не кодируют аминокислот и получили название нонсенс-кодонов. Ризилинг-факторы включаются в работу при попадании нонсенс-кодонов в аминоацильный центр рибосомы. еРШ вызывает изменения пептидилтранс-феразы, в результате которых данный фермент гидролизует эфирную связь между СООН-груп-пой белка и ОН-группой 3-концевого нуклеотида, т.е. осуществляет отщепление синтезированного пептида от тРНК. еРЯЗ — это GTPаза, которая стимулирует фактор еРШ и обеспечивает высво-
бождение новосинтезируемой полипептидной цепи с рибосомы [2, 5].
Конечно, гены SUP45 и SUP35 жизненно важны для клетки. Тем не менее, показана возможность возникновения в них нонсенс-мутаций, которые, казалось бы, должны приводить к необратимым изменениям в клетке из-за нарушения терминации трансляции всех ее белков [5].
Нонсенс-мутация — это появление терминирующих кодонов внутри гена. Но оказалось, что эти, так называемые прямые мутации, могут реверсировать, т.е. «перекрываться» обратными мутациями в том же сайте (истинными обратными мутациями) и восстанавливать дикий (исходный) фенотип. Есть и другая возможность избежать последствия нонсенс-мутации. Она заключатся в том, что вторая мутация локализуется в другом месте генома и каким-то образом компенсирует дефект, обусловленный первой мутацией. Мутации такого типа называют супрессорными [2, 14]. Супрессорная мутация приводит к синтезу супрессорной тРНК. Такая тРНК узнает нонсенс-кодон, то есть прочитывает его неканонически, и встраивает определенную аминокислоту в соответствующее место полипептидной цепи, восстанавливая синтез полноразмерного белка. Существуют и «естественные» супрессорные тРНК, так называемые, эндогенные супрессоры [3].
[PSI+] описан как цитоплазматически наследуемый детерминант, усиливающий действие слабого нонсенс-супрессора SUQ5 (кодирует сериновую тРНК с мутацией в антикодоне, комплементарным нонсенс-кодону UAA) [5, 8]. Таким образом, появление прионового фактора [PSI + ] можно рассматривать как адаптивную реакцию [8]. Большинство из изученных мутаций в генах SUP45 и SUP35 приводят к увеличению уровня эндогенных тРНК, что может объяснять жизнеспособность клетки с нонсенс-мутациями в этих генах [3]. Кроме того, клетки эукариот обладают специальными механизмами узнавания и разрушения мРНК, содержащих преждевременные стоп-кодоны [9].
Клетки дрожжей могут быть освобождены от [PSI + ] малыми концентрациями гидрохлорида гуанидина, не вызывающего мутаций в ядерных генах, но при высоких концентрациях вызывающего денатурацию белков, а также, некоторыми факторами, вызывающими стресс, такими как высокая температура, повышенное осмотическое давление среды и других. Штаммы дрожжей, не содержащие [PSI + ], могут с небольшой частотой спонтанно возвращаться к состоянию [PSI + ]. Частота возникновения [PSI + ] многократно увеличивается при сверхэкспрессии гена SUP35. Важно отметить, что мутации в гене SUP35 имели такое же проявление, как и детерминант [PSI + ], т.е. приводили к супрессии всех трех нонсенс-кодонов. Поддержание детерминанта в клетке также зависело от интактности гена SUP35 — делеции его 5'-кон-цевого района приводили к элиминации [PSI + ] [8].
Белок Sup35 имеет три домена. Аминоконцевой домен белка N (первые 123 аминокислоты) не
существенен для его функции, но необходим и достаточен для возникновения и наследования [ PSI + ], т.е. для перехода белка Sup35 в прионную форму. Роль срединного домена М до конца не выяснена. Карбоксиконцевой домен С (аминокислоты 254685) жизненно важен и отвечает за функцию белка в терминации трансляции [8]. В клетках [PSI + ] молекулы Sup35 полимеризуются посредством своих прионовых доменов.
Выявлены и другие прионовые детерминанты дрожжей, например, [PIN+]. В отличие от [PSI + ] и [Ure3] фенотипическое проявление [PIN+] не связано с инактивацией соответствующего белка. Детерминант [PIN+] был описан как фактор, необходимый для возникновения [PSI + ], вызванного сверхпродукцией белка Sup35. Этот детерминант также способствует более эффективному образованию [Ure3]. В отличие от возникновения, наследование [PSI + ] и [Ure3] не зависит от [PIN+]. В процессе поиска белков, соответствующих детерминанту [PIN + ], было выявлено несколько разных белков, однако в норме [PIN+] образуется в результате прионового превращения белка Rnql с неизвестной функцией. Эффект [PIN+] связан со способностью прионовой формы Rnql служить затравкой для прионовой агрегации Sup35 [1].
Sup35, Sup45 и Rnq1 относятся к группе белков, обогащенных глутамином и аспарагином, что предопределяет их склонность к формированию упорядоченных амилоидных агрегатов, обогащенных p-слоями, но белок PrP не является таковым [5].
На основании всех перечисленных выше наблюдений Р. Викнер предложил несколько критериев существования прионовой основы для генетических факторов дрожжей: цитоплазматический тип наследования детерминанта, зависимость поддержания детерминанта от наличия хромо-сомно-кодируемого белка, обратимость потери детерминанта и увеличение частоты возникновения детерминанта de novo при увеличении внутриклеточной концентрации соответствующего белка [8].
Предположение о прионовых свойствах белков Sup35 и Ure2 было основано на сходстве с некоторыми особенностями прионовой инфекции у млекопитающих [8]. Уникальным свойством детерминантов [PSI + ] и [Ure3] является обратимость их потери: они могут возникать de novo в утративших их клетках. Гипотезы о природе детерминантов, подразумевающие наличие автономного генома, не согласуются с таким поведением или требуют особых допущений. Прионовая же гипотеза подразумевает, что потеря какого-либо из этих детерминантов означает лишь утрату клеткой способности поддерживать прионовую конформацию соответствующего белка. При этом сам белок остается в клетке, и если утрата детерминанта не связана с мутациями в соответствующих ядерных генах, может с какой-то вероятностью вновь перейти в прионоподобную форму. Прионовая гипотеза объясняет также нехромосомный характер наследования [PSI + ] и [Ure3] и доминантность их проявления. При спаривании клеток дрожжей,
одна из которых содержит, а другая не содержит соответствующий детерминант, цитоплазма обеих клеток смешивается и прионовая конформация передается молекулам прионогенного белка, например Sup35 или Sup45. Становится понятно, почему делеция гена SUP45, а также 5'-концевого района гена SUP35 приводит к утрате соответствующих детерминантов — такие мутанты не синтезируют белки, способные переходить в прионовое состояние. Повышение внутренней концентрации соответствующих белков, наоборот, увеличивает вероятность спонтанного конформационного перехода молекул соответствующего белка в при-оновую форму [8].
Данные, подтверждающие сходство биохимических свойств Sup35 и Sup45 с PrP получены. Показано, что белки накапливаются, соответственно, в клетках [PSI + ] и [URE3] в виде высокомолекулярных агрегатов. Оба белка из клеток с детерминантами имели повышенную устойчивость к протеолизу, хотя в отличие от PrPSc не содержали протеазоустойчивого «ядра». Способность к агрегации Sup35 зависела от детерминанта [PSI + ]: молекулы Sup35 способны взаимодействовать друг с другом в клетках [PSI + ] и не способны к такому взаимодействию в клетках без детерминанта [psi]. Выяснено также, что для олигомеризации Sup35 необходим интактный домен N, то есть, именно тот участок белка, от которого зависело поддержание [PSI + ] в клетках дрожжей [8].
Доказательства прионовой природы белка Sup35 получены при исследовании его перехода в прионовую форму in vitro. При смешивании лизатов клеток [PSI + ] и [psi] происходило превращение белка Sup35 из лизата [psi] в агрегированную и про-теазоустойчивую форму, характерную для клеток [PSI+]. Ранее подобные опыты были выполнены для прионов млекопитающих [8]. Конформационные переходы in vitro прионов дрожжей и млекопитающих, видимо, качественно не отличаются друг от друга, но белок Sup35 переходит в прионовую форму гораздо эффективнее, чем PrP млекопитающих. Очистка белка до гомогенного состояния не снижала его прионообразующей способности.
Доменная структура Sup35 позволяет использовать его для проверки прионогенного потенциала других белков или их отдельных участков. Для этого при помощи манипуляций с ДНК прионовый домен Sup35 заменяют исследуемым полипептидом и изучают способность полученного химерного белка вызывать в клетках дрожжей фенотип, подобный [PSI + ]. Можно также заменять не прионовый, а функциональный домен Sup35.
In vitro белки Sup35, Sup45 и Rnq1 формируют типичные амилоидные фибриллы, причем фибриллы, образованные Sup35 и Sup45, использовали для трансформации клеток дрожжей из неприоноген-ного состояния в [PSI + ] и [URE3] соответственно [1]. В лизатах клеток дрожжей прионовые полимеры Sup35 и Rnq1 не растворимы при комнатной температуре в присутствии додецилсульфата натрия, что характерно для амилоидов. Это свойство
полимеров прионовых белков дрожжей позволяет определять их размер и выделять сами прионовые белки. Инкубация лизатов клеток [PSI + ] в присутствии додецилсульфата натрия уменьшает размер агрегатов Sup35 в десятки раз, свидетельствуя о том, что такие агрегаты состоят из более мелких амилоподобных фибрилл. С помощью электрофореза в агарозном геле можно определить размер прионовых полимеров белков. Было установлено, что прионовые полимеры Sup35 могут содержать от 10 до 50 мономеров белка. Таким образом, прионовые агрегаты Sup35 представляют собой высокомолекулярные конгломераты, состоящие из сравнительно небольших амилоидных фибрилл [ 1 ].
Возникновение и поддержание [PSI + ] зависит от шаперонов семейств Hsp70 и Hsp40, но наиболее существенен шаперон Hsp104 — единственный необходимый для наследования [PSI + ] и других прионов дрожжей [1].
Исторически шапероны принято относить к группе белков теплового шока, которые продуцируются в ответ на повышение температуры и помогают клетке справиться с последствиями стресса. Вместе с тем, многие шапероны экспрессируются при физиологической температуре и необходимы для поддержания жизнеспособности.
Дрожжевой шаперон Hsp 104, синтезируемый в клетках дрожжей, не является жизненно важным белком и в норме представлен в клетке в небольшом количестве, однако при стрессе уровень его продукции резко увеличивается. В условиях термического шока жизнеспособность штаммов с делецией гена HSP104 значительно снижена. В отличие от других шаперонов Hsp104 не предотвращает аномальной укладки и агрегации белков после стрессового воздействия, однако он участвует в разборке индуцированных стрессом агрегатов, способствуя тем самым, реактивации мономеров [1, 6].
Механизм дезагрегации белковых конгломератов под действием Hsp104 пока не ясен. Данные структурного анализа показали, что Hsp104 функционирует в виде гексамера, каждый мономер которого имеет два сайта связывания с молекулой АТФ. Гексамер, в котором хотя бы один мономер имеет нарушения в АТФ-связывающих последовательностях, не способен выполнять функцию дезагрегазы [6].
Таким образом, предполагается, что Hsp104 только фрагментирует прионовые полимеры. Фрагментация приводит к увеличению количества полимеров, что важно по двум причинам. Во-первых, возрастает количество концов полимеров, по которым происходит полимеризация прионового белка, а значит, увеличивается общая скорость перехода этого белка в прионовое состояние. Во-вторых, чем больше в клетке прионовых полимеров, тем выше вероятность их попадания в дочерние клетки, образующиеся при клеточных делениях, что необходимо для стабильного наследования приона.
Экспериментально доказано, что низкие концентрации гуанидингидрохлорида могут полностью, но обратимо, подавлять активность Hsp104.
Изучение кинетики элиминации [PSI + ] в делящихся клетках дрожжей показало, что гуанидингидрох-лорид блокирует репликацию прионовых «зерен», являющихся единицами наследования [PSI + ], но не препятствует включению мономеров Sup35 в состав прионовых полимеров. Добавление гуани-дингидрохлорида к клеткам [PSI + ] вызывало увеличение размера прионовых полимеров Sup35 и, значит, уменьшало их количество. Репрессия гена Hsp104 приводила к аналогичному эффекту. Эти полученные данные также свидетельствуют о том, что шаперон Hsp 104 необходим для фрагментации прионовых полимеров, а не для полимеризации прионовых белков [1].
Проведен поиск химических соединений, элиминирующих прионы [PSI + ] и [Ure3]. В связи с тем, что клетки млекопитающих не содержат шаперон Hsp104, поиск в клетках дрожжей химических соединений, активных по отношению к прионам млекопитающих, проводили при сниженной активности Hsp104. В результате нашли шесть соединений (из 2500 исследованных — данные на 2007 г.), элиминирующих [PSI + ]. Пять принадлежат к новому классу молекул — кастеллопаолитинам, шестым был фенантридин. Помимо [PSI + ], эти соединения приводили к исчезновению и приона [Ure3], а также подавляли образование PrPSc в культуре клеток нейробластомы мыши. Два других соединения, антиприоновую активность которых наблюдали ранее в культуре клеток млекопитающих, а именно кинакрин (средство от малярии) и хлорпромазин (антипсихотическое средство) также избавляли клетки дрожжей от [PSI + ] и [Ure3]. Все эти соединения были активны только в делящихся клетках, и для элиминации прионов требовалось присутствие этих агентов в течение нескольких поколений. По предположению авторов, скорее всего, они действуют не на прионовые агрегаты, а на механизмы, поддерживающие прионовое состояние белков. Это указывает на сходство таких механизмов у млекопитающих и дрожжей [1].
Дрожжевая модель используется для изучения патогенеза таких нейродегенеративных заболеваний как болезнь Aльцгеймера, Паркинсона, Гентингтона.
Болезнь Альцгеймера имеет наследственную и спорадическую этиологию. Основную роль в развитии болезни Лльцгеймера играет накопление амилоидной формы пептида, получившего название амилоид р, или Ap, который образуется в результате процессинга белка AРР (Amyloid Precursor Protein), локализованного в обогащенных холестерином микродоменах плазматической мембраны синапсов. AРР расщепляется секретазами семейств а, Р, у, є, Z на множество различных фрагментов, однако амилоидные агрегаты формируются только пептидами Api-40 и Api-42, которые образуются в результате последовательного расщепления AРР Р- и у-секретазами. а-секретаза расщепляет AРР между р- и у-сайтами, т.е. препятствует образованию амилоида р. В клетках млекопитающих идентифицировано три типа компартаментов, в которых
формируется Ар: компартаменты эндосомно/ лизосомного пути, транс-Гольджи, а также промежуточный компартамент эндоплазматического ретикулума. Ранее считалось, что Ар секретируется из клетки, однако оказалось, что при повышенной концентрации он может накапливаться и агрегировать в цитоплазме. Форма Ар 1-42, образуемая в эндоплазматическом ретикулюме, наиболее склонна к агрегации и удерживается внутри клетки [1].
Многие вопросы, связанные с механизмами развития болезни Альцгеймера, получили ответы благодаря использованию дрожжей. Так, существование большого количества мутантов дрожжей с блоком различных этапов внутриклеточного транспорта белков позволяет идентифицировать те из них, которые связаны с действием секретаз и других факторов, влияющих на процессинг АРР и образование Ар, а регулируемые промоторы позволяют варьировать внутриклеточную концентрацию АРР. Кроме того, можно изучать роль отдельных секретаз в биогенезе АРР [1].
Изучение химерного белка, состоящего из пептида Ар 1-40, сшитого с районом МС белка Sup35 ^pSup35MQ показало, что этот химерный белок обладает активностью, свойственной Sup35, так как поддерживал жизнеспособность штамма [1].
Болезнь Паркинсона среди нейродегенера-тивных заболеваний занимает второе место по распространенности после болезни Альцгеймера.
Патоморфологически заболевание характеризуется накоплением в цитоплазме этих нейронов сферических филаментозных включений белка а-синуклеина (тельца Леви). Образование телец Леви может быть следствием мутаций в гене а-синуклеина, а также нарушения деградации этого белка в протеосомах: у некоторых больных с семейными формами болезни Паркинсона выявлена мутация в гене убиквитин-гидролазы 1. Показано также, что а-синуклеин во включениях полуубик-витинилирован, что может приводить к ухудшению деградации других клеточных белков. а-синуклеин локализуется в пресинаптических мембранах и синаптических везикулах, что свидетельствует о его возможном функционировании в синапсах [1].
Изучение патогенетических основ болезни Паркинсона с использованием дрожжевой модели направлено на: 1) выяснение причин токсичности и его мутантных вариантов (А3ОР и А53Т, которые вызывают раннее наступление болезни Паркинсона); 2) определение внутриклеточной локализации агрегатов а-синуклеина, а также зависимости его агрегации от концентрации белка и других факторов; 3) изучение участия а-синуклеина в процессах метаболизма липидов и везикулярного транспорта; 4) изучение ответа клетки на накопление токсичных агрегатов; 5) разработку систем поиска лекарственных препаратов [1].
Для изучения взаимодействия а-синуклеина с мембранными структурами были получены химерные гены, которые кодировали сшитые с флуоресцирующим белком (GFP) а-синуклеин и его мутантные формы А30Р и А53Т. Эти химерные гены
экспрессировали в клетках Sacharomyces cerevisiae. Химерные белки а-синуклеин- GFP, состоящие из а-синуклеина дикого типа или его мутанта A53^ располагались в основном на плазматической мембране, небольшая их часть образовывала включения в цитоплазме. Белки а-синуклеин-GFP не наблюдали на митохондриальных или ядерных мембранах. Мутантный белок A30Р не обнаруживался в составе плазматической мембраны, а был распределен по цитоплазме, что согласуется с данными о его неспособности ассоциировать с мембранами в других системах [1].
Способность а-синуклеина агрегировать зависит от его уровня в клетках и метаболизма липидов. Двукратное повышение уровня а-синуклеина приводило к тому, что белок перемещался в цитоплазму и формировал там крупные агрегаты. Сходная картина наблюдалась и в клетках, синтезирующих мутантную форму A53^ с той лишь разницей, что количество белка, связанного с мембранами, было меньше. Мутантный белок A30Р локализовался в цитоплазме. Добавление в среду диметилсуль-фоксида, стимулирующего биосинтез липидов и повышающего концентрацию фосфолипидов в мембранах, приводило к увеличению числа клеток, содержащих агрегаты а-синуклеина в плазматической мембране, причем агрегаты наблюдали даже при экспрессии гена, кодирующего мутантный белок A30Р [1].
Использование дрожжей позволило также показать, что а-синуклеин доставляется к плазматической мембране. С этой целью использовали коллекцию температурочувствительных штаммов с мутациями в генах sec, которые блокируют различные стадии транспорта: от эндоплазматического ретикулума к аппарату Гольджи, между цистернами этого аппарата и из аппарата Гольджи в составе секреторных везикул к плазматической мембране. В клетках этих мутантов экспрессировали ген, кодирующий белок а-синуклеин-GFP. Контролем в этих опытах служили клетки, экспрессирующие ген химерного белка Yck2-GFP. Yck2 — это белок, доставляющийся к мембране классическим путем. При пермиссивных температурах во всех штаммах в состав плазматической мембраны включались оба белка, но при рестриктивной — ни один [1].
а-жнуклеин токсичен для клеток дрожжей Sacharomyces cerevisiae, причем его токсичность зависит от концентрации и, возможно, связана с агрегацией белка. Убиквитинирование а-синуклеина не предотвращает его агрегацию.
Экспрессия гена а-синуклеина в клетках Sacharomyces cerevisiae индуцирует в них синтез белков теплового шока, а также эффекты, характерные для апоптоза: потерю мембранной асимметрии вследствие перераспределения фосфатидилсерина, усиление генерации активных форм кислорода, выход цитохрома С из митохондрий. Краткий тепловой шок элиминирует все признаки апоптоза, при этом уровень синтеза а-синуклеина не снижался.
Обнаружена способность а-синуклеина подавлять активность фосфолипазы D in vitro и в
клетках дрожжей, ухудшать процесс эндоцитоза у дрожжей.
В результате поиска средств против болезни Паркинсона удалось найти флавоноиды, обладающие антиоксидантной и хелатирующей активностью [1].
Болезнь Гентингтона также относится к наиболее распространенным нейродегенеративным заболеваниям. Болезнь Гентингтона ассоциируется с геном ITI5, кодирующим белок гентингтин (Htt). Аминоконцевой район этого белка обогащен остатками глутамина и пролина. Развитие болезни обусловлено мутациями в гене ITI5, которые приводят к увеличению количества триплетов CAG, кодирующих глутамин. У здоровых людей ген ITI5 содержит от 6 до 35 CAG-повторов. Если таких повторов 36 и более, то может развиться болезнь Гентингтона, при этом вероятность заболевания пропорциональна числу повторов CAG. При наличии 60 и более повторов болезнь возникает в юношеском возрасте. Функция гентингтина до сих пор неизвестна.
Для исследования болезни Гентингтона с помощью дрожжевой модели в основном используют штаммы Sacharomyces cerevisiae, экспрессирующие первый экзон гена гентингтина с разным числом последовательно расположенных глутаминовых кодонов. В клетках дрожжей изучают механизмы цитотоксичности гентингтина, образование и накопление его агрегатов, влияние числа глутаминовых остатков на свойства белка.
Если в клетках дрожжей сверхпродуцировать белок Sup35, в котором прионовый домен заменен 66 глутаминовыми остатками (Q66), то практически все клетки будут содержать полимеры химерного белка Q66-Sup35, устойчивые к додецилсульфату натрия, подобные тем, которые образует белок Sup35 в клетках [PSI + ]. Однако в отличие от прионовых полимеров Sup35 такие полимеры фрагментируются с крайне низкой эффективностью и присутствуют в клетках за счет возникновения de novo, а не наследования. Таким образом, белок Q66-Sup35 образует в клетках дрожжей неприоновые амилоиды, отличающиеся от прионовых частым возникновением и плохим наследованием. Белок Sup35 также склонен к образованию неприоновых амилоидов, причем с намного большей частотой, чем прионовых [1].
При исследовании химерных белков, у которых аминокислотные фрагменты гентингтина с разным числом глутаминовых остатков (Q25, Q47, Q72, Q103) были сшиты с флюоресцирующим белком GFP, удалось выяснить, что увеличение длины по-лиглутаминовой последовательности стимулирует агрегацию белка в клетках дрожжей. Степень агрегации подобных «полиглутаминовых» белков увеличивалась и при повышении уровня их синтеза.
Как и в случае с прионами дрожжей, способность фрагментов гентингтина с разным числом глутаминовых повторов образовывать агрегаты в клетках дрожжей зависит от шаперонов.
Агрегация Q103Htt подавляла рост некоторых штаммов дрожжей. Токсический эффект этого
белка зависел от прионового детерминанта [PIN+]. Локализация агрегатов белка Rnq 1 в клетках дрожжей совпала с локализацией агрегатов Q103Htt, что свидетельствовало об их физическом взаимодействии и о том, что прионовая форма Rnq1 может служить затравкой, провоцирующей не только прионовый переход Sup35, но и амилоидную полимеризацию гентингтина. Белки Q34Htt или Q24Htt в норме не способны к агрегации, но если их синтезировать вместе с Q80Htt, то они образуют нерастворимые агрегаты, которые в большинстве клеток локализуются вместе с агрегатами Q80Htt. Повышение уровня Q80Htt усиливало полимеризацию белков с более короткими полиглутаминовыми участками. Aгрегаты гентингтина с протяженными полиглутаминовыми районами могут служить в качестве [PIN+]. Появление белков Q72Htt и Q 103Htt в клетках штамми, не имеющего детерминанта [PIN+], способствовало индукции [PSI + ] при сверхпродукции Sup35 [1].
Токсический эффект агрегации гентингтина в клетках дрожжей зависит как от аминокислотных последовательностей, фланкирующих полиглута-миновый район, так и от других белков с полиглута-миновыми участками. В некоторых случаях делеция генов, кодирующих такие белки, уменьшала степень агрегации гентингтина. Токсичность агрегатов может быть связана с нарушением эндоцитоза,
На агрегацию гентингтина могут влиять мутации в генах, контролирующих различные клеточные механизмы. Вместе с тем, сама агрегация этого белка может по-разному воздействовать на физиологию клетки. Так, известно, что у млекопитающих гентингтин с увеличенной полиглутаминовой областью вызывает нарушение транскрипционной регуляции еще до развития клинических симптомов болезни Гентингтона, что может быть одним из ранних событий в патогенезе заболевания. Синтез Q75Htt в клетках дрожжей также нарушает тра-скрипцию ряда генов.
Нужно отметить, что, несмотря на выявленные возможности дрожжей, изучать патогенез нейродегенеративных заболеваний только на данной модели, конечно, недостаточно. Разная длительность жизни дрожжей и нейронов, разная физиологическая роль прионовых белков млекопитающих и микроорганизмов, а также, сходство патогенеза нейродегенеративных и прионовых заболеваний
у человека дают возможность предположить, что модели с использованием прионовых животных белков являются более перспективными по сравнению с дрожжевой моделью.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вишневская A^.., Кушниров В.В., Тер-Aванесян М. Д. Нейродегенеративные амилоидозы: дрожжевая модель // Молекулярная медицина. —
2007. — Т. 41. № 2. — С. 346 — 354.
2. Жимудилов И.Ф. Общая и молекулярная генетика // Сибирское университетское издательство. — 2004. — 478 с.
3. Журавлева ГА. и др. Повышение уровня тРНК у дрожжей, содержащих мутантные факторы терминации трансляции eRF1 и eRF3 // Молекулярная биология. — 2006. — Т. 40. № 4. — С. 724 — 730.
4. Леонова 3.A. Прионы и прионовые болезни // Бюлл. ВСНЦ СО РAМН, — 2010. — № 6, Ч. 1. — С. 169—174.
5. Мурина ОА., Москаленко С.Е., Журавлева ГА. Сверхэкспрессия генов, кодирующих тРНКТ1г и тРНКаі1, повышает жизнеспособность нонсенс-мутантов по гену SUP45 дрожжей Saccha-romyces cerevisiae // Молекулярная биология. — 2010. — Т. 44. № 2. — С. 301—310.
6. Рубель A.A. и др. Дрожжевой шаперон Hsp 104 регулирует экспрессию генов на посттранскрип-ционном уровне // Молекулярная биология. —
2008. — Т. 42. № 1. — С. 123—130.
7. Семинский И.Ж. Прионы (биологические аспекты) // Сиб. мед. журнал. — 2006. — № 4. — С. 5 — 8.
8. ТерАванесян М.Д. Прионы: инфекционные белки с генетическими свойствами // Биохимия. — 1999. — Т. 64, Вып. 12. — С. 1638—1647.
9. Шабельская С.В., Журавлева ГА. Мутации в гене SUP35 нарушают процесс деградации м РНК, содержащих преждевременные стоп-кодоны // Молекулярная биология. — 2010. Т. 44. № 1. — С. 51—59.
10. Gu Y., Jing Y. Isolation of human neuronal cells resistant to toxicity by the prion protein peptide 106-126 // J. Aizheimers Dis. 2001. — Apr. 3 (2). — P. 169 — 180.
11. Velayos J.L. et al. The cellular prion protein and its role in Alzheimer's disease // Prion. — 2009, Apr. 29. — Vol. 3 (2).
Сведения об авторе
Леонова Зоя Алексеевна - к.б.н., ассистент кафедры химии, Иркутского государственного медицинского университета Росздрава (664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1; тел.: (3952) 20-44-17)
