CC BY
111
ИММУНОЛОГИЯ
© коллектив авторов, 2015 УДК 616.441-078.33
Бекман Н.И., Ларичева С.Ю., Быченкова Т.А., Помелова в.Г., Осин Н.С.
ПРИМЕНЕНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИММУНОЧИПОВ ФОСФАНТМ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МАРКЕРОВ щИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Лаборатория молекулярных методов диагностики инфекционных и соматических заболеваний ФГУП «ГосНИИ биологического приборостроения» ФмБА РФ, г. москва
Разработан набор реагентов для мультиплексного определения маркеров функционального состояния щитовидной железы на основе технологии иммуночипов в планшетном формате ФОСФАНТМ. Показано, что набор позволяет проводить количественные измерения уровня свободного тироксина и тиреотропного гормона, а также аутоантител к тиреопероксидазе и тиреоглобулину в сыворотке крови человека в клинически значимых диапазонах концентраций. Продемонстрирована высокая чувствительность и хорошее совпадение с результатами иммуноферментного анализа при исследовании клинических проб.
Ключевые слова: ФОСФАН™; мультиплексный анализ; тироксин; тиреотропный гормон; аутоантитела к ти-реопероксидазе; аутоантитела к тиреоглобулину.
Для цитирования: Клиническая лабораторная диагностика. 2015; 60(5): 23-26. BeckmanN.I., LaritchevaS.Yu., Bichenkova T.A., Pomelova V.G., Osin N.S.
HE APPLICATION OF TECHNOLOGY OF IMMUNE CHIPS FOSFANTM FOR INVESTIGATION OF MARKERS OF THYROID GLAND
The state research institute of biological instrument engineering of the Federal medical biological agency of Russia, Moscow, Russia
The set of reagents was developed on the basis of technology of immune chips in flatbed format FOSFANTM to apply in multiplex detection ofmarkers of functional .state ofthyroid gland. It is demonstrated that the set permits carrying out quantitative measurements of level of free thyroxine and thyrotropic hormone in human blood serum within clinically valuable ranges of concentration. The high sensitivity and good concordance with results of immune enzyme analysis under examination of clinical samples were demonstrated.
Keywords: FOSFANTM; multiplex analysis; thyroxine; thyrotropic hormone; auto-antibody to thyreoperoxidase; autoantibody to thyroglobulin
Citation: Klinicheskaya Laboratornaya diagnostika. 2015; 60(5): 23-26.
В последнее время в лабораторной диагностике инфекционных и соматических заболеваний активно развивается направление, связанное с разработкой муль-тианалитных (мультиплексных) систем. Такие системы позволяют при тестировании одной пробы пациента измерить несколько диагностически значимых маркеров одновременно, что способствует снижению стоимости исследования (при сохранении его чувствительности и специфичности) и особенно актуально при проведении масштабных скрининговых исследований [10, 14].
Применение мультиплексных тестов - перспективный подход для выявления комплекса маркеров, характеризующих функциональное состояние щитовидной железы, таких как тиреотропный гормон гипофиза (ТТГ), свободный тироксин (свТ4), тиреоидные аутоантитела к тиреопероксидазе (ТПО) и тиреоглобулину (ТГ). Определение этих аналитов широко используется в обычной клинической практике, а в последние десятилетия - и для раннего выявления дисфункции щитовидной железы при скрининговом обследовании групп риска насе-
Для корреспонденции:
Бекман Наталья Игоревна (Bekman Natalya Igorevna), e-mail: [email protected]
ления, особенно в экологически неблагополучных регионах [3-5, 8, 9]. К настоящему времени разработаны мультиплексные тесты на основе проточной цитометрии флуоресцентно-меченных микросфер для измерения уровня ТТГ и свТ4 [6, 11] и аутоантител к ТПО и ТГ [7], совокупное определение которых позволяет судить о тиреоидном статусе пациента и наличии у него аутоиммунных заболеваний.
В данной работе приведены результаты разработки набора реагентов для выявления тиреоидных маркеров на основе биочип-технологии мультиплексного фос-форесцентного иммуноанализа ФОСФАН™ (Иммуно-скрин, РФ) [1, 2, 12].
Цель - разработать мультиплексный набор реагентов для одновременного определения ТТГ и свТ4, а также аутоантител к ТПО и ТГ в сыворотках крови пациентов и оценить его чувствительность и специфичность в сравнении с коммерческими иммуноферментными (ИФА) тест-системами.
Материалы и методы. Разработанный нами набор включал стандартные 96-луночные полистироловые планшеты (Nunc, Дания), предназначенные для одновременного выявления ТТГ и свТ4 (иммуносорбент № 1) или аутоантител к ТПО и ТГ (иммуносорбент №2). На
дне лунки планшета методом контактной печати напечатан набор (эррей) микропятен (диаметром 0,5 мм), содержащих монокло-нальные антитела к ТТГ и конъюгирован-ный с бычьим сывороточным альбумином трийодтиронин либо ТПО и ТГ, по 4 пятна на каждый аналит (рис. 1). Набор также включал: комплект калибровочных проб, содержащих смесь ТТГ/свТ4 в концентрациях 0; 0,03/2,4; 0,1/5,5; 1,0/16,4; 10/45; 100/95 мкМЕ/мл / пмоль/л, приготовленный добавлением препаратов ТТГ и Т4 (ICN, США) в очищенную от гормонов сыворотку крови человека (Scantibodies Lab. Inc., США), и комплект проб, содержащих аутоантите-ла к ТГ/ТПО в концентрациях 0; 50/15; 100/30; 300/100; 1000/300; 3000/1000 МЕ/мл, приготовленный титрованием в сыворотке крови плодов коров (Bioclot Ltd, Германия) пула предварительно отобранных сывороток крови человека с высоким содержанием аутоантител; контрольную сыворотку человека с известным содержанием четырех аналитов; два препарата биотинилиро-ванных антител, представляющих собой смесь монокло-нальных антител к ТТГ и Т4, либо антивидовые антитела к иммуноглобулинам человека; конъюгат стрептавидина с платинакопропорфирином (универсальный проявляющий реагент); растворы для разведения проб и промывки планшетов.
Мультиплексный анализ проб сывороток проводили параллельно на иммуносорбентах № 1 и 2. В первом случае ТТГ из тестируемой пробы связывался с моно-клональными антителами в соответствующих микропятнах и проявлялся вторыми моноклональными антителами, меченными биотином; Т4 конкурировал с Т3, иммобилизованным на чипе, за связывание с меченными биотином антителами (рис. 1, а). В лунки планшета вносили по 25 мкл калибровочных проб или исследуемой сыворотки человека, добавляли по 25 мкл смеси биотинилированных антител к ТТГ и Т4 и инкубировали при перемешивании в течение 2 ч. Во втором случае ау-тоантитела связывались с пятнами, содержащими ТГ и ТПО, и проявлялись биотинилированными антивидовыми антителами (см. рис. 1, б). В лунки планшета вносили по 25 мкл калибровочных проб или предварительно разведенной в 100 раз исследуемой сыворотки человека и инкубировали в течение часа при перемешивании. После отмывки в лунки добавляли по 25 мкл биотинилиро-ванных антивидовых антител с часовой инкубацией при перемешивании.
На завершающей стадии анализа в лунки планшетов вносили по 25 мкл универсального проявляющего реагента и инкубировали в течение 15 мин при перемешивании, после чего планшет промывали и высушивали. Регистрацию сигнала осуществляли в режиме временного разрешения на биочип-анализаторе ИФИ-04 (ГосНИИБП, РФ) путем сканирования отдельных участков дна лунки микропланшета лазерным лучом длиной волны излучения 365 нм в режиме выделения длительной люминесценции с максимумом 645 нм. Результаты исследования каждой пробы представляли в виде значений концентраций исследуемых ана-литов, которые рассчитывали по калибровочным кривым с использованием программных средств биочип-анализатора.
Правильность определения концентраций аналитов
Рис. 1. Схема мультиплексного анализа методом ФОСФАН ТТГ и свТ4 (а) и аутоантител (б).
1 - лунка 96-луночного микропланшета; 2 - дно лунки с нанесенными микропятнами для улавливания ТТГ, Т4 , анти-ТГ и анти-ТПО; 3-6 - исследуемые ТТГ, свТ4, аутоантитела к ТГ и ТПО в пробе; 7-9 - меченные биотином анти-ТТГ, анти-Т4 и антивидовые антитела; 10 - стрептавидин, конъюгированный с платинакопропорфирином.
контролировали путем анализа контрольных материалов, представляющих собой охарактеризованные лио-филизированные препараты сывороток крови человека (Lyphochek Immunoassay Plus Control, Bio-Rad), содержащих смесь гормонов человека в различных концентрациях.
Оценка работоспособности мультиплексного набора проведена на панели из 66 сывороток крови. Эти пробы получены от пациентов с различным тиреоидным статусом и предварительно охарактеризованы по уровню ТТГ, свТ4, ауто-антител к ТГ и ТПО в ИФА тест-системах (Хема, РФ). Уровень ТТГ был выше нормы у 8, ниже нормы - у 11 из 66 пациентов (в сочетании с повышенным уровнем свТ4 у 2 пациентов). Из 47 пациентов, обследованных на наличие аутоантител, у 16 выявлены антитела к ТПО, в том числе у 8 пациентов в сочетании с анти-ТГ-антителами.
Результаты и обсуждение. Проведенные исследования показали, что разработанный нами набор реагентов позволяет проводить количественный анализ четырех маркеров щитовидной железы в клинически необходимых диапазонах концентраций (рис. 2). Выбранный объем исследуемой сыворотки крови и методика проведения анализа обеспечивают возможность одновременного определения гормонов с чувствительностью 0,02 мкМЕ/мл при измерении уровня ТТГ и правильной оценке содержания свободной фракции Т4 в клиническом диапазоне от 2 до 100 пмоль/л. Калибровочные кривые для определения аутоантител имели линейный характер в диапазонах концентраций от 0 до 1000 МЕ/мл для ТПО и до 3000 МЕ/мл для ТГ. Чувствительность анализа на анти-ТПО не превышала 10 МЕ/мл, а на анти-ТГ - 15 МЕ/мл. Тесты на линейность и открытие соответствовали диапазону 90-110% для всех четырех исследуемых маркеров. Таким образом, аналитические характеристики мультиплексного набора были не хуже, чем у соответствующих иммуноферментных тест-систем.
Разработанный тест обеспечивал правильное определение ТТГ и свТ4 в контрольных материалах, что подтверждалось соответствием измеренных в ФОСФАН значений заданным диапазонам концентраций этих гормонов.
10 000
1000
100
10
1
4000
3000-
2000-
1000-
0,01 0,1
1 10 мкМЕ/мл
100
свТ>
10
, пмоль/л
100
10 000
1000
100
10 000
1000
10
100 1000 анти-ТГ, МЕ/мл
10 000
Рис. 2. Калибровочные кривые для определения ТТГ (а), свТ4 (б), аутоантител к ТГ (в) и ТПО (г) с помощью мультиплексного набора реагентов на основе ФОС-ФАНТМ.
Возможность использования мультиплексного набора для анализа клинических проб оценивали по результатам исследования сывороток крови 66 пациентов с различным тиреоидным статусом (см. таблицу). Диапазон нормальных значений концентраций маркеров в ФОСФАН составлял 0,5-4 мкМЕ/мл для ТТГ, 8-20 пмоль/л для свТ4, менее 30 МЕ/мл для анти-ТПО и менее 100 МЕ/мл для анти-ТГ. Повышенный уровень ТТГ отмечен у 9, пониженный - у 11 пациентов, в том числе у двух в сочетании с повышенным уровнем свТ4. Антитела к ТПО выявлены у 15 пациентов, из них у 8 в сочетании с анти-ТГ-антителами (см. таблицу). Эти результаты практически полностью совпали с данными ИФА. Лишь в одном случае отмечено расхождение: в ФОС-ФАН зарегистрирован незначительно повышенный уровень ТТГ (5,03 мкМЕ/мл) при его нормальном уровне (3,57 мкМЕ/мл) в ИФА. Измеренные мультиплекс-
ным набором концентрации аналитов соответствовали результатам предварительного тестирования сывороток в ИФА при наличии высокой степени корреляции: 0,986 для ТТГ, 0,810 для свТ4, 0,792 для анти-ТПО и 0,899 для анти-ТГ.
Таким образом, нами разработан новый подход к одновременному выявлению четырех маркеров функционального состояния щитовидной железы на основе микропланшетной биочип-технологии ФОСФАН™. Этот метод выявляет ТТГ, свТ4 и антитела к ТПО и ТГ, которые связываются со специфическими улавливающими реагентами, напечатанными в виде микропятен на дне лунки 96-луночного микропланшета. Поскольку ФОСФАН аналогично ИФА проводится в стандартных полистироловых планшетах, это дает возможность использовать стандартное лабораторное оборудование (во-шеры, шейкеры и т. п.) и не требует переобучения персонала.
Разработанный набор обеспечивает правильное количественное определение маркеров в клинически значимых диапазонах концентраций, необходимую чувствительность анализа и хорошее совпадение с результатами исследования проб в ИФА.
Следует отметить, что на данном этапе разработки набор позволяет измерять уровень аналитов в парах ТТГ/ свТ4 и ТПО/ТГ, что обусловливает необходимость тестирования пробы параллельно на двух иммуносорбентах. В перспективе мы планируем объединить эти тесты в формате единого иммуночипа, что обеспечит одновременное определение четырех маркеров; принципиальная возможность создания такого теста описана в патенте [13].
Заключение. На основе биочип-технологии ФОСФАН™ разработан набор реагентов для мультиплексного определения гормонов ТТГ и свТ4 и аутоантител к ТПО и ТГ. Набор позволяет проводить количественное определение этих аналитов в клинически значимых диапазонах концентраций, обеспечивает необходимую чувствительность анализа и хорошее совпадение с результатами исследований проб в коммерческих ИФА-тестах.
100
анти-ТПО, МЕ/мл
1000
Результаты определения ттГ, свт4 и аутоантител к тПО и тГ мультиплексным набором на основе ФОСФАН™ при анализе сывороток крови пациентов
Уровень ТТГ Число проб Из них с повышенным уровнем
свТ4 анти-ТПО анти-ТГ
Ниже нормы* 11 2 5 3
Норма 46 0 3 4
Выше нормы 9 0 7 2
Всего... 66 2 15 9
Примечание. * - пояснения в тексте.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kingsmore S.F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nature Reviews Drug Discovery. 2006; 5: 310-21.
2. Xu Y.-Y., Pettersson K., Hemmila I. et al. Simultaneous quadrupelabel fluorometric immunoassay of thyroid-stimulating hormone, 17-a-hydroxyprogesterone, immunoreactive trypsin, and creatine kinase MM isoenzyme in dried blood spots. Clin. Chem. 1992; 38: 2038-43.
3. Помелова В.Г., Бекман Н.И., Ларичева С.Ю., Быченкова Т.А., Осин Н.С., Злобин В.Н. и др. Контроль уровня тиреоидных гормонов у взрослого населения с использованием высушенной на фильтровальной бумаге капиллярной крови. Медицина экстремальных состояний. 2009; 3: 43-50.
4. Современные методы лабораторной диагностики. Справочное пособие для врачей. Ростов-на-Дону; 2012.
5. Aoki Y., Belin R.M., Clickner R.J. et al. Serum TSH and total T4 in the United States population and their association with participant characteristics: National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES 1999-2002). Thyroid. 2007; 17: 1211-23.
6. Hoogendoorn E.H., Hermus Ad R., de Vegt F., Ross H.A. Thyroid function and prevalence of anti-thyroperoxidase antibodies in a population with borderline sufficient iodine intake: influences of age and sex. Clin. Chem. 2006; 52: 104-11.
7. Jensen E., Petersen P.H., Blaabjerg O., Hegedus L. et al. Biological variation of thyroid antibodies and thyroglobulin. Clin. Chem. Lab. Med. 2007; 45: 1058-64.
8. Bellisario R., Colinas R., Pass K. et al. Simultaneous measurement of thyroxin and thyrotropin from newborn dried blood-spot specimens using a multiplexed fluorescent microsphere immunoassay. Clin. Chem. 2000; 46: 1422-4.
9. Lukacs Z., Mordac C. Use of microsphere immunoassay for simplified multianalyte screening of thyrotropin and thyroxine in dried blood spots from newborns. Clin. Chem. 2003; 49: 335-6.
10. Gonzalez C., Garcia-Berrocal B., Talavan T., Casas M.L.J., Navajo J.A., Gonzalez-Buitrago J.M. et al. Clinical evaluation of microspere bead-based flow cytometry assay for the simultaneous determination of anti-thyroid peroxidase and anti-thyroglobulin antibodies. Clin. Biochem. 2005; 38: 966-72.
11. Осин Н.С., Помелова В.Г., Быченкова Т.А., Соколов А.С. Способ многоаналитного иммуноанализа. Патент РФ № 2184970; 2002.
12. Осин Н.С., Помелова В.Г., Соколов А.С., Быченкова Т.А., Бек-ман Н.И., Шарафудинова Т.Ю. и др. Фосфоресцентный микроанализ как новая технологическая платформа для молекулярной диагностики. Вестник РАМН. 2007; 12: 3-10.
13. Osin N.S., Pomelova V.G. Multi-array immunophosphorescence technology for the detection of pathogens. In: Georgiev V.S., Western K.A., McGowan J.J. (eds). Frontiers in research. National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. Totowa, NJ: Humana Press; 2008: 233-40.
14. US Patent 20090280575; 2009.
REFERENCES
1. Kingsmore S.F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays. Nature Reviews Drug Discovery. 2006; 5: 310-21.
2. Xu Y.-Y., Pettersson K., Hemmila I. et al. Simultaneous quadrupelabel fluorometric immunoassay of thyroid-stimulating hormone, 17-
a-hydroxyprogesterone, immunoreactive trypsin, and creatine kinase MM isoenzyme in dried blood spots. Clin. Chem. 1992; 38: 2038-43.
3. Pomelova V.G., Bekman N.I., Laricheva S.Yu., Bychenkova T.A., Osin N.S., Zlobin V.N. et al. Control for the level of thyroid hormones in adult by use of filter paper-dried capillary blood. Meditsina ekstremal'nykh sostoyanii. 2009; 3: 43-50. (in Russian)
4. Modern methods of laboratory diagnostics. Reference manual for doctors. Rostov-on-Don; 2012. (in Russian)
5. Aoki Y., Belin R.M., Clickner R.J. et al. Serum TSH and total T4 in the United States population and their association with participant characteristics: National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES 1999-2002). Thyroid 2007; 17: 1211-23.
6. Hoogendoorn E.H., Hermus Ad R., de Vegt F., Ross H.A. Thyroid function and prevalence of anti-thyroperoxidase antibodies in a population with borderline sufficient iodine intake: influences of age and sex. Clin. Chem. 2006; 52: 104-11.
7. Jensen E., Petersen P.H., Blaabjerg O., Hegedus L. et al. Biological variation of thyroid antibodies and thyroglobulin. Clin. Chem. Lab. Med. 2007; 45: 1058-64.
8. Bellisario R., Colinas R., Pass K. et al. Simultaneous measurement of thyroxin and thyrotropin from newborn dried blood-spot specimens using a multiplexed fluorescent microsphere immunoassay. Clin. Chem. 2000; 46: 1422-4.
9. Lukacs Z., Mordac C. Use of microsphere immunoassay for simplified multianalyte screening of thyrotropin and thyroxine in dried blood spots from newborns. Clin. Chem. 2003; 49: 335-6.
10. Gonzalez C., Garcia-Berrocal B., Talavan T., Casas M.L.J., Navajo J.A., Gonzalez-Buitrago J.M. et al. Clinical evaluation of microspere bead-based flow cytometry assay for the simultaneous determination of anti-thyroid peroxidase and anti-thyroglobulin antibodies. Clin. Biochem. 2005; 38: 966-72.
11. Osin N.S., Pomelova V.G., Bychenkova T.A., Sokolov A.S. Method of multianalyte immunoassay Patent RF, N 2184970. 2002. (in Russian)
12. Osin N.S., Pomelova V.G., Sokolov A.S., Bychenkova T.A., Bekman N.I., Sharafudinova T.Yu. et al. Phosphorescent microanalysis as a new technical platform for molecular diagnostics. Vestnik RAMN. 2007; 12: 3-10. (in Russian)
13. Osin N.S., Pomelova V.G. Multi-array immunophosphorescence technology for the detection of pathogens. Georgiev V.S., Western K.A., McGowan J.J. (eds). Frontiers in research. National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. Totowa, NJ: Humana Press; 2008: 233-40.
14. US Patent 20090280575; 2009.
Поступила 11.08.14 Received 11.08.14
