CC BY
42
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (50)/2010
Применение фосфоресцентных иммуночипов для серологической диагностики иксодовых клещевых боррелиозов*
В.Г. Помелова1 ([email protected]),
Э.И. Коренберг2 ([email protected]), Н.С. Осин3 ([email protected]), Т.А. Быченкова1 ([email protected]), Н.И. Бекман1, Т.А. Канаева1,
Н.Н. Воробьева4, В.И. Фризен5
1 Государственный научный центр «ФГУП «Государственный НИИ биологического приборостроения» ФМБА», Москва
2 НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва
3 ЗАО «Иммуноскрин», Москва
4 Пермская государственная медицинская академия
5 1-я Краевая инфекционная больница г. Перми
Резюме
Продемонстрирована перспективность применения фосфоресцентных иммуночипов, разработанных на основе микро-планшетной технологии ФОСФАН™, для сероэпидемиологического мониторинга и подтверждающей серологической диагностики иксодовых клещевых боррелиозов и других природно-очаговых инфекций. При сопоставимой или более высокой чувствительности по сравнению с коммерческими иммуноферментными тестами главное преимущество иммуночипов состоит в способности выявлять специфические антитела одновременно к 4 - 16-ти различным антигенам, «напечатанным» в виде микропятен на дне лунки стандартного 96-луночного планшета, в том числе при обследовании высушенных на фильтровальной бумаге сывороток. Благодаря мультиплексности, миниатюризации анализа и микро-планшетному формату иммуночипов ФОСФАН™ позволяет повысить производительность иммуноанализа, снизить его стоимость и сократить трудоемкость лабораторной работы. Ключевые слова: микропланшетная биочип-технология ФОСФАН™, фосфоресцентные иммуночипы, иксодовые клещевые боррелиозы, клещевой энцефалит, серодиагностика, высушенные на фильтровальной бумаге сыворотки
The Use of Microarray-Based Phosphorescent Immunoassay Tests for Serological Diagnosis of Ixodid Tick Borne Borrelioses
V.G. Pomelova1 ([email protected]),
E.I. Korenberg2 ([email protected]),
N.S. Osin3 ([email protected]),
T.A. Bychenkova1 ([email protected]), N.I. Bekman1, T.A. Kanaeva1, N.N. Vorob'ova4, V.I. Frizen5
1 State Research Center: State Scientific-Research Institute for Biological Instrumentation, Moscow
2 N.F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Academy of Medical Sciences, Moscow
3 Closed Joint Stock Company «Immunoscreen», Moscow
4 The State Educational Establishment: The State Medical Academy of Perm
5 The First Regional Hospital of Infectious Diseases of Perm Abstract
In this report, we describe microarray-based phosphorescent immunoassay tests (created on the basis of PHOSPHAN™ technology) to aid in the seroepidemiologic monitoring and serologic diagnosis of ixodid tick-borne borrelioses and other natural focal infections. The sensitivity of microarray-based immunoassays was comparable to, or higher than that of a commercial ELISA test. The main advantage of PHOSPHANTM-based tests is connected with their ability to detect specific antibodies simultaneously to 4 - 16 different antigens «printed» on the bottom of standard 96-well plate microwell by examining both native and filter paper dried serum samples. Due to multiplicity, miniaturization and microplate format of microarray assays, the PHOSPHANTM-based tests provide an increased productivity while decreasing the cost of immunoassay and labor input of laboratory work.
Key words: microplate microarray technology PHOSPHAN™, microarray-based phosphorescent immunoassays, ixodid tick-borne borrelioses, tick-borne encephalitis, serologic diagnosis, filter paper dried sera
Введение возможных заболеваний при проведении сероэпи-
Разработка комплексного подхода к одновре- демиологических исследований эндемичных тер-
менному выявлению всего спектра потенциально риторий и серодиагностике природно-очаговых ин-
* Материалы статьи были доложены на Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы природной очаговости болезней» (к 70-летию теории академика Е.Н. Павловского о природной очаговости болезней), ноябрь 2009 г., Омск.
фекций является актуальной задачей. Ее решение в значительной степени базируется на создании мультиплексных тестов (иммуночипов) для одновременного определения специфических антител к нескольким возбудителям. Проведение исследований в формате иммуночипа включает взаимодействие обследуемой сыворотки крови с набором диагностически значимых иммунодоминант-ных и контрольных антигенов, «напечатанных» в виде микрозон («микроэрреев», или микропятен) на поверхности твердофазного носителя. Это позволяет охарактеризовать спектр содержащихся в сыворотке крови специфических антител. Миниатюризация формата иммуноанализа снижает его стоимость и способствует повышению чувствительности и надежности серологического исследования благодаря возрастанию локальной концентрации связывающих реагентов и улучшению соотношения сигнал/фон [22].
В настоящей работе описаны фосфоресцент-ные иммуночипы (фосфоресцентные тест-системы) для выявления специфических антител к возбудителям иксодовых клещевых боррелиозов (ИКБ) и клещевого энцефалита (КЭ), разработанные на основе микропланшетной биочип-технологии фосфоресцентного анализа (ФОСФАНТМ) [4, 20]. Эта технология сочетает преимущества микропланшет-ных методов (производительность) с потенциалом биочипов (мультиплексность). Особенность фос-форесцентных иммуночипов состоит в том, что иммуноанализ выполняется в лунках обычного по-листиролового планшета аналогично постановке ИФА. На дне каждой лунки «напечатано» от 4-х до 16 микропятен диаметром 0,5 - 0,7 мм. Каждое микропятно содержит иммобилизованные иммунореагенты (моноклональные антитела, рекомбинантные и/или пептидные антигены), способные к специфическому улавливанию из обследуемой сыворотки крови антител класса ^М или ^ против возбудителей вирусных (КЭ) и/или бактериальных (ИКБ) инфекций. Связавшиеся в микрозоне антитела взаимодействуют с биотинилированными анти-видовыми антителами, а затем со стрептавидином, конъюгированным с фосфоресцентным метчиком Р^опропорфирином. Уникальными свойствами этого метчика являются способность длительно люминесцировать при комнатной температуре, в том числе после высушивания на дне лунки, а также значительный Стоксов сдвиг между длинами волн возбуждения и регистрации фосфоресценции. Совокупность этих свойств обеспечивает возможность измерения фосфоресцентного сигнала в режиме временного разрешения путем сканирования дна высушенной лунки с помощью специализированного сканера.
Ранее технология ФОСФАН™ была успешно применена для выявления ^М и ^ к вирусу КЭ, антигенов и кДНК этого вируса, дифференциальной серодиагностики КЭ и других природно-очаговых вирусных инфекций [6, 7]. В настоящей работе
основное внимание сконцентрировано на оценке эффективности фосфоресцентных иммуночипов для выявления специфических антител к возбудителям иксодовых клещевых боррелиозов.
В качестве основного компонента иммуночипов для серодиагностики ИКБ использовали пептид С6. Его аминокислотная последовательность соответствует консервативной иммунодоминантной области поверхностного белка VlsE Borrelia burgdorferi [16]. В настоящее время коммерческий тест на основе иммуноферментного анализа (ИФА) и пептида С6 считается одним из наиболее перспективных для подтверждающей серодиагностики Лайм-боррелиоза в Северной Америке: он может использоваться как единственный или в сочетании с иммуноблотом [11, 12, 17 - 19], обеспечивает высокую чувствительность на ранних стадиях заболевания, позволяет выявлять антитела у больных, инфицированных различными геновидами боррелий, и является высокоспецифичным при исследовании больных с заболеваниями, которые могут влиять на результаты серодиагностики ИКБ [12, 15, 17]. Вместе с тем использование пептида С6 только одного геновида боррелий может оказаться недостаточным для подтверждающей серодиагностики ИКБ в Евразии [14, 21], где данное заболевание вызывают несколько патогенных для человека боррелий комплекса B. burgdorferi sensu lato [3]. С учетом этого помимо пептида С6 из американского геновида боррелий в состав фосфоресцентных иммуночипов были также включены пептид С6 из белка VlsE B. garinii и рекомбинантный белок VlsE B. burgdorferi sensu stricto.
Цель работы - оценить чувствительность и специфичность фосфоресцентных иммуночипов для выявления специфических антител к возбудителям ИКБ в сравнении с коммерческим ИФА-тестом и продемонстрировать возможность создания мультиантигенных тестов для дифференциальной серодиагностики ИКБ и клещевого энцефалита, в том числе при исследовании высушенных на бумажных бланках сывороток крови.
Материалы и методы
Сыворотки крови. В работе использованы 153 сыворотки крови больных ИКБ, 212 - пациентов с инфекционными заболеваниями иной этиологии (не ИКБ), 32 сыворотки крови больных с микст-инфекцией (ИКБ + КЭ) и 100 проб от клинически здоровых доноров крови (всего 497 проб).
Сыворотки крови группы ИКБ собраны в Пермском крае в эпидемический сезон (с апреля по сентябрь) 2003 года от 51 больного разного возраста с клиническим диагнозом ИКБ (получены из Краевой клинической инфекционной больницы № 1 (КИБ № 1) г. Перми). Из числа больных этой группы 50 (98,0%) отмечали факт предшествующего присасывания клеща. У 43 больных (84,3%) клинический диагноз ИКБ основывался на наличии типичной мигрирующей эритемы в сочетании
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (50)/2010
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (50)/2010
(у части больных) с общеинфекционным синдромом (эритемная форма). У 8 больных эритема отсутствовала (исследованы 24 сыворотки крови, взятые в разные сроки после начала заболевания). Диагноз ИКБ был поставлен по совокупности анамнестических и клинических признаков, характерных для безэритемной формы [1], и подтвержден серологически выявлением специфических IgM и/или IgG в НРИФ (непрямая реакция иммунофлюоресценции) на основе цельноклеточного антигена B. afzelii, Ip21 (производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН), или в ИФА на основе рекомбинантных белков боррелий («Омникс», Санкт-Петербург), при отрицательном результате ИФА в отношении клещевого энцефалита. Все обследованные сыворотки являлись парными и были собраны на разных сроках от начала заболевания ИКБ.
Сыворотки крови группы «микст-ИКБ + КЭ» были собраны в Пермском крае в 2006 году от 13 больных с клиническим диагнозом микст-инфекции ИКБ и КЭ, подтвержденным наличием типичной мигрирующей эритемы (эритемная форма ИКБ) и выявлением IgM к вирусу КЭ. Сыворотки получены на 3 - 216-й день от начала заболевания (медиана - 14 дней). У всех пациентов отмечен факт присасывания клеща за 4 - 15 дней (медиана - 9 дней) до начала заболевания.
Контрольная группа С состояла из сывороток крови больных с клиническими диагнозами «клещевой энцефалит» (9 проб), «сифилис» (60 проб), «леп-тоспироз» (27 проб), «сальмонеллез» (27 проб), «ангина», «паратонзиллярный абсцесс», «аденовирусная» и «энтеровирусная инфекция» (30 проб), «инфицирование вирусом Эпштейна-Барр» (30 проб), а также пациентов с положительным ревматоидным фактором (29 проб). Пробы этой группы были в основном получены из КИБ № 1 г. Перми в 2003 и 2006 годах; часть сывороток крови (от больных, инфицированных вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) и с положительным ревматоидным фактором) - из Инфекционной клинической больницы № 1 г. Москвы (2007 г.). Клинический диагноз в отношении клещевого энцефалита, сифилиса, лептоспироза и ВЭБ-инфекции был подтвержден выявлением специфических IgM, и/или IgG, и/или IgA в соответствующих коммерческих тестах.
Контрольная группа Д состояла из сывороток крови доноров Пермской краевой станции переливания крови, полученных в 2006 году вне сезона активности клещей-переносчиков боррелий и вируса КЭ.
Все сыворотки до исследования хранились в виде аликвот при температуре -20 °С.
Выполнение ИФА. Для выявления суммарных антиборрелиозных IgM и IgG в сыворотках крови пациентов использовали ИФА-тест Immunetics Quick ELISA C6 Borrelia Assay Kit (Immunetics Inc., США). Результаты представляли в виде значений Лайм-индекса и интерпретировали как положительные, сомнительные или отрицательные в соответствии с указаниями производителя тест-системы. При рас-
чете чувствительности учитывали положительные и сомнительные результаты.
Выполнение теста ФОСФАН™. В работе использовано три варианта иммуночипов (Лайм-плекс14, Лаймплекс33 и Лаймплекс34/ВКЭ), представляющих собой наборы реагентов, необходимых для выполнения анализа. Основным компонентом каждой из трех тест-систем был стандартный 96-луночный полистироловый планшет. На дне лунок планшета с помощью наноплоттера для контактной печати (ЗАО «Иммуноскрин», Москва) были «напечатаны» 4, 9 или 16 микрозон (диаметром 0,5 - 0,7 мм каждая), содержащих иммобилизованный пептид С6 из белка VlsE B. burgdorferisensu stricto, B31 (Лаймплекс14-ФОСФАНТМ), в том числе в сочетании с пептидом С6 из белка VlsE B. garinii, Ip90, и рекомбинантным белком VlsE B. burgdorferi sensu stricto, B31 (Лаймплекс33-ФОСФАНТМ), или в комбинации с пептидом С6 из белка VlsE B. garinii, Ip90, рекомбинантным белком VlsE B. burgdorferi sensu stricto, B31, и моноклональными антителами (МКА) к вирусу КЭ, штамм 4072 (Лаймплекс34/ ВКЭ-ФОСФАНТМ).
Фосфоресцентный иммуноанализ проводили в лунках планшета аналогично ИФА. Исследуемые пробы вносили в разведении 1:100 и инкубировали в течение двух часов при комнатной температуре и встряхивании на шейкере. При постановке теста Лаймплекс34/ВКЭ в лунках планшета предварительно (до внесения анализируемых проб) инкубировали сахарозоацетоновый антиген вируса КЭ, как описано ранее [6]. Каждую пробу исследовали в дублях в двух лунках планшета. Затем вносили биотинилированные МКА против IgG человека и конъюгат стрептавидина c Pt-копропорфирином. Время инкубации с этими реагентами составило соответственно 1 час и 15 минут при комнатной температуре и встряхивании на шейкере. После завершения каждой стадии иммуноанализа планшет промывали три раза промывочным буфером, а на финальной стадии - еще три раза дистиллированной водой, затем высушивали на воздухе. Интенсивность фосфоресценции (ИФ) измеряли путем сканирования дна лунки с помощью приборов-сканеров ИФИ-02 [4, 20] или «Диагем» (ЗАО «Иммуноскрин», Москва).
Результаты сканирования представляли как интегральное число фотоимпульсов от каждой микрозоны. После компьютерной обработки картина распределения сигнала фосфоресценции по поверхности дна лунки была представлена в виде 4-х, 9-ти или 16-ти окрашенных микропятен, при этом интенсивность окраски была пропорциональна концентрации IgG (или IgM) к возбудителям ИКБ (или к вирусу КЭ) в исследуемой пробе.
Критерии отбора положительного результата. Результаты исследования каждой пробы в данной микролунке представляли в виде значений коэффициента позитивности: Кпоз = P / (N + b), где P (или N) соответствуют ИФ пробы (или отрицатель-
ной контрольной сыворотки) при взаимодействии с пептидом С6 B. burgdorferi sensu stricto, или пептидом C6 B. garinii, или рекомбинантным белком VlsE, или антигеном вируса КЭ; b - постоянное значение, подобранное в предварительных экспериментах таким образом, чтобы обеспечивать не менее чем 95%-ный уровень диагностической специфичности при анализе сывороток группы Д. Результат исследования пробы считали положительным (антитела выявлены), если значение К
' ' поз.
с любым антигеном в составе иммуночипа было равно или выше 1.
Статистическая обработка результатов. Выявление статистически значимых различий выборок по количественным показателям (сравнение значений Кпоз) проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни, по качественным показателям (сравнение долей) - с помощью точного двустороннего критерия Фишера для уровня статистической значимости p < 0,05 [10].
Результаты и обсуждение
Сравнение чувствительности и специфичности тестов Лаймплекс14-ФОСФАНТМ и C6 ELISA Immunetics. Результаты выявления антиборрели-озных IgG в ФОСФАН™ (Лаймплекс14) или суммарных IgM/IgG в ИФА (C6 ELISA Immunetics) представлены в таблице 1.
При обследовании проб контрольных групп Д (n = 100) и С (n = 203) специфичность теста ФОСФАН™ составила соответственно 99 и 92,6% (89 - 96%). Специфичность С6 ELISA Immunetics оказалась несколько ниже (см. табл. 1), хотя наблюдаемые различия были статистически недостоверны (р > 0,05). Наибольшее число ложноположительных результатов было зарегистрировано при анализе проб от больных сифилисом (до 13%) и пациентов с положительным ревматоидным фактором (до 17%).
Панель для оценки чувствительности включала 153 сыворотки больных ИКБ с эритемной (исследова-
но 129 проб) и безэритемной (24 пробы) формой этого заболевания. Антиборрелиозные IgG выявлены в тесте ФОСФАН™ примерно в 70% (63 - 77%) обследованных проб независимо от клинической формы ИКБ (см. табл. 1). В тесте С6 ELISA Immunetics зарегистрированы близкие показатели чувствительности.
По данным теста ФОСФАН™, характер изменения доли положительных сывороток с IgG на разных сроках от начала заболевания ИКБ (на каждом сроке исследовано от 16 до 29 проб) соответствовал результатам теста C6 ELISA Immunetics, который выявляет антитела обоих классов (рис. 1). Нарастание или снижение доли положительных сывороток коррелировало с изменением медианы значений Кпоз специфических антител (см. рис. 1). Значения Кпоз в тесте ФОСФАН™ были достоверно (р < 0,05) выше, чем в ИФА, практически на всех сроках заболевания, за исключением самого раннего и самого позднего периода. Эти данные свидетельствуют о достижении в тесте ФОСФАН™ лучшего соотношения сигнал/фон, что является основой повышения надежности серологического тестирования в формате фосфоресцентного иммуночипа.
Определение спектра IgG- или IgM-антител в тесте Лаймплекс33-ФОСФАНТМ. Результаты выявления антиборрелиозных IgG или IgM одновременно к трем антигенам боррелий в тесте Лаймплекс33-ФОСФАН™ иллюстрирует таблица 2. Для этих экспериментов были отобраны 180 проб из групп ИКБ, Д и С. Включенные в обследование сыворотки группы ИКБ были получены от 22 больных с эритемной формой ИКБ (от двух до шести сывороток от каждого пациента на разных сроках от начала заболевания).
IgG был выявлен в 9 - 12 из 22 (41 - 55%) проб группы ИКБ, собранных сразу после поступления пациента в стационар, и в 37 - 39 из 48 (77 - 81%) проб этой группы, полученных на более
Таблица 1.
Чувствительность и специфичность выявления антиборрелиозных антител в тестах Лаймплекс14-ФОСФАН™ и C6 ELISA Immunetics при обследовании сывороток больных ИКБ, пациентов с иными заболеваниями и доноров
Группа Исследовано Число (%) положительных проб в тесте:
сывороток Лаймплекс14-ФОСФАНТМ C6 ELISA Immunetics
Больные ИКБ: 153 107 (69,9) [63 - 77]a 109 (71,2) [64 - 79]
с эритемной формой 129 90 (69,8) [62 - 78] 92 (71,3) [63 - 79]
с безэритемной формой 24 17 (70,8) [52 - 89] 17 (70,8) [52 - 89]
Контрольная группа С Из них с клиническим диагнозом: 203 15 (7,4) 17 (8,4)
ангина и т.п. 30 0(0,0) 0(0,0)
сальмонеллез положительный ревматоидный 27 1 (3,7) 2 (7,4)
фактор 29 3 (10,3) 5 (17,2)
инфицир. вирусом Эпштейна-Барр 30 2 (6,7) 2 (6,7)
лептоспироз 27 1 (3,7) 0 (0,0)
сифилис 60 8 (13,3) 8 (13,3)
Клинически здоровые доноры 100 1 (1,0) 2(2,0)
а Здесь и в табл. 2, 4: в квадратных скобках — 95% доверительный интервал доли положительных проб
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (50)/2010
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (50)/2010
Рисунок 1.
Изменение доли положительных сывороток (гистограммы) и медианы значений коэффициента позитивности (кривые)
О Лаймплекс14-ФОСФАНТМ
Q С6 ELISA Immunetics
100 —
ю
0 d
п
><
_Q
1 _Ü
л
е
н
s
*
o
л
o
п
cc
л
o
80 -
60
40
20 -
i- 50
40
- 30
1 - 7 8 - 14 15 - 30 31 - 60
Срок от начала заболевания ИКБ (дни)
61 - 240
е
е
_Q
I
_Ü
л
е
_Q
20 I
е
10
і
е
T
а
0 ^
0
Таблица 2.
Число (%) положительных сывороток в группах ИКБ, С и Д,
в которых выявлены антиборрелиозные IgG или IgM в тесте Лаймплекс33-ФОСФАН™
Группа Иссле- довано сыворо- ток Выявлены IgG с антигеном: Выявлены IgM с антигеном:
C6 B B. garinii С6 а B.b.s.s. recVlsE любой из трех C6 B B. garinii С6 B.b.s.s. recVlsE любой из трех
Больные ИКБб при поступлении в стационар 22 9 (41) [21 - 64] й. Y 22 10 (45) [24 - 68] 13 (59) [36 - 79] 8 5 4 (18) [5 - 40] 3 3 ]) 6 (27) [11 - 50]
Больные ИКБб в стадии реконвалесценции 48 37(77) [65 - 89] 38 (79) [67 - 91] 63 CD CD ]) S ® 0 1 8 9 ] <S 10(21) [10 - 32] 5 (10) [1,5 - 18] 11(23) [12 - 34]
Контрольная группа С 60 4 (7) 2 (3) 1 (2) 5 (8) 2 (3) 2 (3) 5 (8) 5 (8)
Доноры 50 2 (4) 2 (4) 2 (4) 5 (10) 2 (4) 2 (4) 2 (4) 4 (8)
а Здесь и в табл. 3: С6 Bbss - пептид С6 из B. burgdorferi sensu stricto б ИКБ, эритемная форме)
поздних сроках болезни (см. табл. 2). Статистически значимые различия в чувствительности выявления специфических антител с каждым из трех антигенов отсутствовали. У 15 из 22 (68%) больных ИКБ спектр выявляемых антител был одинаков, тогда как сыворотки семи пациентов по-разному реагировали с боррелиозными антигенами в составе иммуночипа. Наименьшее число положительных проб зарегистрировано с пептидом C6 B. garinii, причем все эти пробы были положительны и при связывании с пептидом С6 B. burgdorferi sensu stricto. Включение в состав иммуночипа рекомбинантного белка VlsE позволило дополнительно выявить три положительные сыворотки. Сыворотки крови контрольных групп С и Д (n = 110) были отрицательными, за исключением 6-ти, 4-х и 3-х проб,
прореагировавших с пептидами C6 B. garinii, С6 B. burgdorferi sensu stricto и рекомбинантным белком VlsE соответственно (см. табл. 2).
Специфический IgM был выявлен в тесте Лаймплекс33-ФОСФАНТМ лишь в 14 - 23% проб группы ИКБ, собранных на ранних сроках, и в 10 - 21% проб этой группы, полученных на более поздних сроках болезни (см. табл. 2); во всех этих пробах был также обнаружен антиборрелиозный IgG. Наименьшее число положительных проб зарегистрировано с рекомбинантным белком VlsE.
Выявление IgG к возбудителям ИКБ и к вирусу КЭ в тесте Лаймплекс34/ВКЭ-ФОСФАНТМ. Возможность выявления IgG одновременно к четырем антигенам в тесте Лаймплекс34/ВКЭ-ФОСФАНТМ иллюстрирует таблица 3. Для этих эксперимен-
Таблица 3.
Результаты выявления IgG-антител к возбудителям ИКБ и клещевого энцефалита в тесте Лаймплекс34/ВКЭ-ФОСФАНТМ (жирным шрифтом выделены гомологичные реакции)
Ожидаемая инфекция Исследовано сывороток Число (%) положительных проб с антигеном:
C6 B B. garinii С6 B.b.s.s. recVlsE ВКЭ
КЭ 9 1 (11,1) 1 (11,1) 1 (11,1) 7 (77,8)
ИКБ 59 39 (66,1) 39 (66,1) 39 (66,1) 36 (61,1)
Микст ИКБ + КЭ 32 25 (78,1) 27 (84,4) 25 (78,1) 30 (93,8)
Контроль(доноры) 90 1 (1,1) 1 (1,1) 1 (1,1) 30 (33,3)
тов были отобраны 190 сывороток крови из групп ИКБ, Д и С, а также все пробы пациентов с микст-инфекцией ИКБ и КЭ. Включенные в обследование сыворотки групп ИКБ и С были получены соответственно от 22 больных с эритемной формой ИКБ и 4-х больных КЭ на разных сроках от начала заболевания.
Антиборрелиозный ^ был выявлен в 39 из 59 (66%) проб группы ИКБ и в 25 - 27 из 32 (78 - 84%) сывороток крови больных ИКБ, у которых это заболевание протекало в виде микст-инфекции с КЭ (см. табл. 3). Статистически значимые различия в чувствительности выявления специфических антител с каждым из трех антигенов боррелий отсутствовали. Сыворотки крови больных КЭ и контрольной группы Д (п = 99) были отрицательными, за исключением двух проб, прореагировавших с каждым из этих антигенов. Результаты выявления антиборре-лиозных антител в группах ИКБ и Д полностью совпали с данными, полученными при обследовании этих проб в тесте Лаймплекс14-ФОСФАНТМ.
Специфический ^ к вирусу КЭ был обнаружен в семи из девяти (78%) сывороток больных КЭ и примерно в 94% проб группы «микст ИКБ + КЭ» (см. табл. 3). Противовирусные антитела были также выявлены в значительном числе проб от больных ИКБ (61%) и клинически здоровых доноров (33%).
Выявление антиборрелиозного в сыворотках крови, высушенных на фильтровальной бумаге. Возможность выявления антиборрелиоз-ных антител в сыворотках, высушенных на бумажных бланках, демонстрирует таблица 4. Для этих экспериментов были отобраны 395 сывороток крови из групп ИКБ, Д и С. Эти сыворотки крови были нанесены на фильтровальную бумагу фирмы
«Ватман» № 903 в виде нескольких пятен диаметром примерно 1 см каждое (по 50 мкл сыворотки на пятно) и высушены на воздухе. Для исследования использовали диски диаметром 3,2 мм, которые помещали непосредственно в лунку планшета (по одному диску на лунку), как описано ранее [5]. Анализ проводили в тесте Лаймплекс14-ФОСФАНТМ аналогично обследованию жидких сывороток.
Число положительных сывороток крови, в которых удалось обнаружить антиборрелиозные антитела, было примерно одинаковым при обследовании как нативных, так и высушенных на бумаге проб (см. табл. 4). При анализе проб контрольных групп С и Д специфичность теста ФОСФАНТМ составила 93,8 и 100% соответственно для обоих видов тестируемого биоматериала (см. табл. 4). Между результатами обследования жидких и сухих проб сывороток (см. рис. 2) наблюдалась высокая степень корреляции (г = 0,9088, р = 0,0000; у = 1,04 +
0,66 • х; г2 = 0,8259).
Итак, продемонстрирована перспективность применения фосфоресцентных иммуночипов на основе микропланшетной технологии ФОСФАНТМ для серодиагностики природно-очаговых инфекций. Основным преимуществом иммуночипов по сравнению с ИФА является возможность одновременного выявления антител к 4 - 16-ти различным антигенам, в том числе в элюатах из высушенных на фильтровальной бумаге пятен сыворотки крови. Благодаря мультиплексности, миниатюризации анализа и микропланшетному формату иммуночипов ФОСФАНТМ позволяет повысить производительность иммуноанализа, снизить его стоимость и сократить трудоемкость лабораторной работы. Кроме того, ФОСФАНТМ дает возможность отсроченного или повторного «считывания» результата после за-
Таблица 4.
Чувствительность и специфичность теста Лаймплекс14-ФОСФАНТМ
при выявлении антиборрелиозных IgG-антител в сыворотках, высушенных на фильтровальной бумаге
Группа Исследовано сывороток Число (%) положительных сывороток:
до высушивания после высушивания
Больные ИКБ 144 107 (74,3) [67 - 81] 103 (71,5) [64 - 79]
Контрольная группа С 177 11 (6,2) 11 (6,2)
Доноры 74 0(0,0) 0(0,0)
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (50)/2010
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (50)/2010
Рисунок 2.
Корреляция результатов выявления антиборрелиозных IgG в сыворотках до и после высушивания на фильтровальной бумаге в тесте Лаймплекс14-ФОСФАН™
0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0 Значения коэффициента позитивности при анализе сывороток (lg)
вершения иммунореакции: благодаря стабильности фосфоресцентной метки результаты анализа сохраняются в течение месяцев и планшеты с биоматериалом могут быть архивированы.
Разработанные тесты продемонстрировали сопоставимую с американской тест-системой C6 ELISA Immunetics чувствительность и специфичность (см. табл. 1) и превосходили по этим показателям отечественный ИФА-тест [9]. ФОСФАНТМ выявлял антиборрелиозный IgG примерно в 70% обследованных проб (см. табл. 1). При этом чувствительность выявления антител в тесте ФОСФАНТМ (55%; 95% ДИ: 31,5 - 76,9) на ранних (в первую неделю) сроках от начала заболевания ИКБ оказалась на данной сравнительно небольшой (n = 20) выборке существенно выше по сравнению с показателем C6 ELISA Immunetics (40%; 95% ДИ: 19,1 - 63,9) (см. рис. 1). Максимальное накопление антиборрелиозных антител (примерно 90%) регистрировали на второй неделе болезни, причем достигнутый уровень сохранялся в течение не менее чем двух месяцев (см. рис. 1).
Для серологического подтверждения диагноза ИКБ в разработанных тестах было достаточно выявить в обследуемой сыворотке антиборрелиозные антитела IgG-класса (см. табл. 2). Эти результаты подтвердили известные сведения о том, что пептид С6 даже на ранних сроках заболевания ИКБ преимущественно обнаруживает именно IgG [13]. Определение IgM не повышало чувствительности ФОСФАНТМ (см. табл. 2), а учет суммарных антител классов IgM и IgG существенно снижал специфичность, что также согласуется с данными других исследователей [21].
Надежность серологических исследований на ИКБ, особенно в регионах с одновременной циркуляцией боррелий различных геновидов, зависит от правильного подбора специфических антигенов в составе диагностического теста. Иммуночип Лаймплекс33-ФОСФАНТМ позволяет определять спектр IgG сразу к трем антигенам: пептиду С6 и рекомбинантному белку VlsE американского гено-вида и пептиду С6 европейского геновида боррелий. Подавляющее большинство обследованных сывороток крови больных ИКБ взаимодействовало со всеми тремя антигенами (см. табл. 2). Наиболее высокую чувствительность, особенно на ранних сроках заболевания, демонстрировал пептид С6 из американского геновида боррелий, тогда как пептид С6 из B. garinii выявлял наименьшее число положительных проб (см. табл. 2). Эти результаты в целом согласуются с данными европейских исследователей, показавших равную эффективность пептидов IR6 из B. burgdorferi sensu stricto и B. afzelii для выявления IgG как у американских, так и у европейских пациентов, тогда как пептид IR6 из B. garinii демонстрировал низкую степень корреляции [21]. Включение в исследование большего числа проб, в том числе из разных географических регионов, позволит выявить особенности взаимодействия проб с пептидом С6 трех геновидов боррелий, как это было показано ранее [14, 21], и определить их оптимальное сочетание в составе иммуночипа.
Перспективы технологии ФОСФАНТМ для сероэпидемиологического мониторинга и подтверждающей серодиагностики ИКБ, особенно в сочетанных очагах инфекций, связаны с разработкой
мультиплексных тестов, позволяющих определять спектр антител к нескольким возбудителям. Иммуночип Лаймплекс34/ВКЭ-ФОСФАНТМ выявляет спектр ^ к трем антигенам боррелий и к антигену вируса КЭ (см. табл. 3). Антиборрелиозные антитела достоверно чаще регистрировали в сыворотках крови больных ИКБ и пациентов, у которых это заболевание протекало в виде микст-инфекции с КЭ, чем в пробах, полученных от больных моноинфекцией КЭ и здоровых людей. В противоположность этому противовирусные антитела были выявлены во всех исследованных группах, в том числе у доноров (см. табл. 3). Эти данные подтверждают специфичность взаимодействия с антигенами боррелий в составе иммуночипа и, с другой стороны, согласуются с наблюдениями, свидетельствующими о наличии ^ к вирусу КЭ у значительного числа жителей эндемичных регионов [2].
ФОСФАНТМ оказался одинаково эффективным при выявлении антиборрелиозных антител в нативных сыворотках крови и в тех же пробах после высушивания на фильтровальной бумаге (см. табл. 4 и рис. 2). При проведении эпидемиологических исследований такой подход к сбору биоматериала (сыворотки или цельной капиллярной крови) на бумажные бланки очень удобен для транспортировки и хранения проб [8]. При высушивании повышается
стабильность многих аналитов, в том числе антител, РНК и ДНК, а манипуляции с бумажными бланками более безопасны, чем с цельной кровью.
Выводы
1. Технология ФОСФАНТМ является перспективным подходом к проведению сероэпидемиологических исследований и дифференциальной серологической диагностике ИКБ и других природноочаговых заболеваний.
2. При сопоставимой (или более высокой) чувствительности и специфичности по сравнению с коммерческими ИФА-тестами главное преимущество иммуночипов состоит в способности выявлять специфические антитела одновременно к 4 - 16-ти различным антигенам, в том числе при обследовании высушенных на фильтровальной бумаге сывороток крови.
3. Благодаря мультиплексности, миниатюризации
анализа и микропланшетному формату иммуночипов ФОСФАНТМ позволяет повысить производительность иммуноанализа, снизить его стоимость и сократить трудоемкость лабораторной работы. ш
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта BTEP104/ ISTC 3135.
Литература
1. Воробьева Н.Н. Клиника, лечение и профилактика иксодовых клещевых боррелиозов. - Пермь: Урал-Пресс, 1998. - 136 с.
2. Иерусалимский А.П. Клещевой энцефалит. - Новосибирск, 2001. -360 с.
3. Коренберг Э.И. Иксодовые клещевые боррелиозы / Онищенко Г.Г., Покровский В.И., Черкасский Б.Л. Эволюция инфекционных болезней в России в XX веке. - М.: Медицина, 2003. С. 376 - 386.
4. Осин Н.С., Помелова В.Г., Соколов А.С. и др. Фосфоресцентный микроанализ как новая технологическая платформа для молекулярной диагностики // Вестник РАМН. 2007. № 12. С. 3 - 10.
5. Помелова В.Г., Быченкова Т.А., Бекман Н.И. и др. Тестирование антител к вирусу клещевого энцефалита с применением высушенной на фильтровальной бумаге крови // Журн. микробиол. 2008. № 1. С. 50 - 55.
6. Помелова В.Г., Быченкова Т.А., Бекман Н.И. и др. Диагностическая эффективность фосфоресцентных иммуночипов при серодиагностике клещевого энцефалита // Журн. микробиол. 2009. № 3. С. 71 - 75.
7. Помелова В.Г., Быченкова Т.А., Бекман Н.И., Осин Н.С. Иммуночип для дифференциации IgG-антител к флавивирусам (на примере вирусов клещевого энцефалита и лихорадки Западного Нила) // Журн. микро-биол. 2010. № 1.
8. Помелова В.Г., Осин Н.С. Перспективы интеграции технологии сухого пятна крови в популяционные исследования здоровья и среды обитания человека // Вестник РАМН. 2007. № 12. С. 10 - 16.
9. Помелова В.Г., Осин Н.С., Коренберг Э.И. и др. Перспективы серодиагностики природно-очаговых инфекций методом мультиплексного фосфоресцентного микроанализа / Материалы Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 70-летию теории академика Е.Н. Павловского о природной очаговости болезней: Актуальные проблемы природной очаговости болезней. Омск, 24 - 25 ноября 2009 г. - Омск: Издательский центр «Омский научный вестник», 2009. С. 61 - 63.
10. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины / Пер. с англ. - М.: Медиа Сфера, 1998. - 352 с.
11. Aguero-Rosenfeld M.E., Wang G., Schwartz I., Wormser G.P. Diagnosis of Lyme borreliosis // Clin. Microbiol. Rev. 2005. V. 18. № 3. P 484 - 509.
12. Bacon R.M., Biggerstaff B.J., Schriefer M.E. et al. Serodiagnosis of Lyme disease by kinetic enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant VIsE or peptide antigens of Borrelia burgdorferi compared with 2-tiered testing using whole-cell lysates // J. Infect. Dis. 2003. V. 187. P. 1187 - 1199.
13. Embers M.E., Jacobs M.B., Johnson B.J.B., Philipp M.T. Dominant epitopes of the C6 diagnostic peptide of Borrelia burgdorferi are largely inaccessible to antibody on the parent VlsE molecule // Clin. Vaccine Immunol. 2007. V. 14. № 8. P. 931 - 936.
14. Gomes-Solecki M.J.C., Meirelles L., Glass J., Dattwyler R.J. Epitope length, enospecies dependency, and serum panel effect in the IR6 enzyme-linkedimmunosorbent assay for detection of antibodies to Borrelia burgdorferi // Clin. Vaccine Immunol. 2007. V. 14. № 7. P. 875 - 879.
15. Liang F.T., Aberer E., Cinco M. et al. Antigenic conservation of an immunodominant invariable region of the VlsE lipoprotein among European pathogenic genospecies of Borrelia burgdorferi SL // J. Infect. Dis. 2000. V. 182. P. 1455 - 1462.
16. Liang F.T., Alvarez A.L., Gu Y. et al. An immunodominant conserved region within the variable domain of VlsE, the variable surface antigen of Borrelia burgdorferi // J. Immunol. 1999. V. 163. P. 5566 - 5573.
17. Liang F.T., Steere A.C., Marques A.R. et al. Sensitive and specific serodi-agnosis of Lyme disease by enzyme-linked immunosorbent assay with a peptide based on an immunodominant conserved region of Borrelia burgdorferi VlsE // J. Clin. Microbiol. 1999. V. 37. № 12. P. 3990 - 3996.
18. Marangoni A., Sparacino M., Carvini F. et al. Comparative evaluation of three different ELISA methods for the diagnosis of early culture-confirmed Lyme disease in Italy // J. Med. Microbiol. 2005. V. 54. P. 361 - 367.
19. Mogilyansky E., Loa C.C., Adelson M.E. et al. Comparison of Western im-munoblotting and the C6 Lyme antibody test for laboratory detection of Lyme disease // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2004. V. 11. P. 924 - 929.
20. Osin N.S., Pomelova V.G. Multi-array immunophosphorescence technology for the detection of pathogens / Frontiers in research. National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. V.S. Georgiev, K.A. Western, J.J. McGowan (ed.). - Totowa, NJ: Humana Press, 2008. V. 1. P. 233 - 240.
Sillanpaa H., Lahdenne P., Sarvas H. et al. Immune responses to bor-relial VlsE IR6 peptide variants // Int. J. Med. Microbiol. 2007. V. 297. P. 45 - 52.
Templin M.F., Stoll D., Schrenk M. et al. Protein microarray technology // Trends Biotechnol. 2002. № 20. P. 160 - 166.
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (50)/2010
