CC BY
56
Мазуркевич А.И.1, Ковпак В.В.2,Журба В.И.3 ©
'Профессор, д.вет. н.; 2к.вет.н.; 3к.вет.н., Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины
ПРИМЕНЕНИЕ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННОГО СУСТАВНОГО ХРЯЩА
У ЖИВОТНЫХ
Аннотация
Исследовать течение репаративного хондрогенеза в патологически измененном суставном хряще вследствии его механического повреждения после введения культуры недифференцированных аллогенных МСК костного мозга и аллогенных МСК костного мозга с предварительно направленным хондрогенним дифференцированием.
Ключевые слова:мезенхимальныестволовыеклетки, восстановления гиалинового хряща. Keywords:mesenchymalstem cells, recovering ofhyalinecartilage.
Применение методов клеточной терапии для восстановления структуры и функций патологически измененных тканей в животном организме приобретает все больший размах. В настоящее время ведется активный поиск оптимальных методов лечения травматологических и дегенеративных повреждений гиалинового хряща суставов.
Физиологическая регенерация хрящевой ткани происходит благодаря деятельностихондроцитов и хондробластов - выработке ими хондромукоиду, коллагена и эластина, которые способствуют новообразованию хондриновихволокон.
Возрастные изменения в хрящевой ткани характеризуются уменьшением содержания клеточных элементов и ростом количества межклеточного матрикса. При этом по мере преобразования хондроцитов первого и второго типов на хондроциты третьего типа в межклеточном веществе хряща снижается количество протеогликанов, хондромукоид замещается альбумоидом, увеличивается содержание коллагеновых волокон. Последние обладают способностью накапливать соли кальция и кальцифицироваться. Все эти изменения приводят к уменьшению степени гидратации, потери упругости и увеличение ломкости хрящевой ткани. Наблюдаются также врастание в кальцифицированный хрящ кровеносных сосудов и замена хрящевой ткани костной [1, 2, 3].
Многочисленными исследованиями доказано, что регенерация частичных дефектов суставного хряща происходит, в основном, за счет усиления синтетической активности и митоза хондроцитов, расположенных по краям дефекта. Однако, потенции хондроцитов, при заживлении таких повреждений ограничены: со временем их активность уменьшается, что приводит к дальнейшему разрушению структуры матрикса и углубления дегенеративных изменений в ткани. Определенную роль в заживлении частичных дефектов играют мезенхимальные клетки, ониперемещаются из синовиального слоя суставной капсулы в область повреждения и участвуют в процессах хондрорепарации.
Стволовым клеткам присуща способность к самовосстановлению, тоесть к пролиферации без дифференцировки в течение неопределенно длительного времени и способность к дифференцировке в специализированные типы клеток организма [4, 5, 6]. В культуре они обладают высокой жизнеспособностью и пролиферативной активностью [7, 8].
В последнее время в мире для восстановления суставного хряща все большую популярность приобретают методы клеточной и тканевой имплантации. Источником получения хондроцитов, которые используются в клеточной и тканевой технологии, могут служить как хондроциты с собственно хрящевой ткани, так и полученные культуральным путем дифференцирования из клеток-предшественников различной степени зрелости
©Мазуркевич А.И., Ковпак В.В., Журба В.И., 2013 г.
(эмбриональные стволовые клетки, фетальные ткани, МСК костного мозга, стволовые клетки плаценты, периостальныепрогениторные клетки и др.) [9, 10, 11].
Исследование влияния аутологичныхМСК костного мозга на репарацию экспериментально поврежденного суставного хряща проведены на 9 кроликах породы серый великан в возрасте 3 мес., массой 2000 ± 250 г. Получение костного мозга, выделение из него клеток с высокой пролиферативной активностью и культивирования мезенхимальных стволовых клеток осуществляли согласно собственной методики [12, 13].
Эксперименты на животных проведены с соблюдением требований "Общих этических принципов экспериментов на животных", одобренных I Национальным конгрессом по биоэтике (20.09.04 г., Киев, Украина), и положений "Европейской конвенции по защите позвоночных животных, которых используют в экспериментальных и других научных целях "(Страсбург, 1986), Закона Украины «О защите животных от жестокого обращения»(15.12.2009. - Ведомости ВС, 2010, № 9).
Дифференциацию МСК в хондрогенном направлении осуществляли путем добавления дексаметазона 10-8 М; аскорбиновой кислоты 50 мкг/см3; трансформирующего ростового фактора (TGF - 1) 10 нг / мл; раствор инсулина-трансферрина-селенина (Ш^) 1%. Как известно, названные соединения обусловливают снижение активности транскрипции генов, кодирующих белки, участвующие в пролиферации и адгезии и повышают транскрипцию генов хондробласт-специфических белков.
Процесс дифференциации контролировали по изменению морфологии клеток, их пролиферативной активности в процессе дифференциации и изменения активности продуцирования внеклеточного матрикса в виде гликозаминогликанов.
Выявление гликозамингликанов (протеогликанов) осуществляли путем окрашивания 0,1% водным раствором красителя сафранина - О.При этом сульфатированные гликозамингликаны окрашиваются в красный цвет.
Схема опыта
Качестворепаративныхпроцессовв областидефектаоценивалипо
характеруповерхностногостроениярегенерата, морфологииткани, структуры еематрикса, а такжепо характеруижизнеспособностихондроцитов,
состояниякальцифицированнойзоныхрящаиподхрящевойкостной пластинки,
наличиемзонвторичнойоссификацииикровеносныхсосудов.
Для общейоценкииспользовалиальтернативнуюOS(scomingsystem) шкалу[14] (табл. 1). СогласноальтернативнойOSшкале, качестворегенератасчиталиоченьплохимпри получениисуммарного балла-0иоптимальнымприсуммарнополученномбалле- 10.
Альтернативная OSшкала
Таблица 1
1. Поверхностное строение регенерата. близкое к норме - 2 частично разнородное- 1 очень разнородное- 0
2. Морфология ткани гиалиновая-3 фибро \ гиалиновая - 2 фибро хрящ - 1 фиброзная ткань - 0
близко к норме - 1
ненормальная - 0_
отсутствует - 1 <25% клеток - 0,5
> 25% клеток - 0_
нормальное - 1
плохое - 0_
отсутствуют - 1
присутствуют - 0_
отсутствуют - 1
присутствуют -0_
делены на три группы по 3 животных в каждой. У каждого животного предварительно молировали повреждения суставного хряща бедренной кости. Все манипуляции проводились под общим наркозом. В условиях асептики и антисептики, парапателярно рассекали капсулу коленного сустава. С помощью сверла, во фронтальной плоскости на надколенной поверхности бедренной кости формировали стандартное полнослойное повреждения суставного хряща, диаметром 3 мм (рис. 1).Целостность подхрящевой костной пластинки сохраняли. После этого рану промывали водным раствором хлоргексидина и послойно зашивали мягкие ткани.
На 9 сутки после нанесения экспериментальной травмы суставного хряща животным первой группы (контроль) в полость оперированного коленного сустава с помощью инсулинового шприца вводили 100 мкл солевого физиологического раствора (плацебо); животным второй группы (опыт I) вводили аллогенные МСК костного мозга, в количестве 2,5 х 106; животным третьей группы (опыт II) вводили аллогенные МСК костного мозга, подвергнутыхдифференциации в хондрогенном направлении, в количестве 2,5 х 106.
Контроль эффективности репаративных процессов в хрящевой ткани осуществляли с помощью макроскопических и микроскопических исследований.
Отбор проб тканей для гистологических исследований при изучении влияния трансплантации аллогенных мезехимальних стволовых клеток в течение репаративных процессов в суставном хряще проводили на 45-е сутки заживления. Для этого животных подвергали эвтаназии путем внутримышечного введения летальной дозы смеси кетамина (150 мг / кг) и ксилазина (60 мг / кг). От них отбирали образцы тканей (коленные суставы) с местом дефекта и проводили гистологические исследования.
Окраску срезов проводили гематоксилином Караци и эозином.
Результаты исследования.
В опытах по изучению условий направленной дифференциации МСК костного мозга кролика в хондрогенному направлении нами установлено, что на 6-7 сутки культивирования снижается их пролиферативная активность и теряются адгезивные свойства, характерные свойствами мезенхимальных стволовых клеток в недифференцированном состоянии. Об этом свидетельствует потеря клетками адгезивных свойств после снятия монослоя этих клеток из культуральной посуды, на что указывает снижение процента прикрепления клеток при повторном пасажировании до 15-20% от посадочного количества этих клеток.
Уже на 8 сутки культивирования наблюдались морфологические изменения МСК, а именно: клетки потеряли веретенообразную форму и сильно распластывались по дну культуральной посуды. При окрашивании красителем сафранина О на выявление гликозаминогликанов в монослоеМСК кролика, индуцированных в хондрогенному направлении, было обнаружено значительно более высокий уровень продуцирования ими этих соединений по сравнению с контролем (рис 2, рис 3).
цитов
Рис.
1.Надколеннаяповерхностьбедре ннойкост икроликапосле
нанесенияэкспериментальногоповрежден ия_
е были разд
Через 45 суток после нанесения травмы у животных контрольной группы, обнаружено, что дефект суставного хряща частично заполнен неплотным веществом желтоватого цвета. Смежный участок хряща имел тусклый оттенок(рис.4).
а щ Ш/
ЩНВ Л )
■ лъ ..ег" щ Чг 1
Рис. 4. Суставной хряш бедренной кости через 45 суток после нанесения дефекта (контроль) Рис. 5. Суставной хряш бедренной косгп через 45 суток после нанесения дефекта и введение недифференцированных аллогевэых \1СК. Рис. 6. Суставной хряш бедренной кости через 45 суток после нанесения дефекта о введение алло генных дпфференпппрованнпх мск
У животных 1 исследовательской группы, которым вводили в полость оперированного коленного сустава недифференцированные аллогенные МСК костного мозга, в количестве 2,5 х 106, обнаружено заполнения дефекта суставного хряща гладким блестящим веществом белого цвета, плотным на ощупь. Смежный участок хряща блестящего оттенка, без визуальных признаков эрозии и розволокнення (рис. 5).
У животных 2 исследовательской группы, которым вводили в полость оперированного коленного сустава аллогенные МСК после их дифференциации в хондрогенном направлении, в количестве 2,5 х 106, обнаружено, что дефект суставного хряща частично заполнен неплотным веществом розового цвета. Смежный участок хряща приобрел тусклый оттенок (рис. 6).
Таким образом, результаты проведенных макроскопических исследований свидетельствуют, что МСК, введенные в количестве 2,5 х 106 в полость коленного сустава на 45-е сутки эксперимента после нанесения экспериментального дефекта суставного хряща бедренной кости (при условии сохранения подхрящевой пластинки), эффективно оптимизируют процессы хондрорегенерации (рис. 5), в то время как введение аллогенных МСК с дифференциацией в хондрогенном направлении показали худший результат (рис. 6).
При гистологическом исследовании поврежденного суставного хряща у животных контрольной группы, сосуды подхрящевой костной пластинки, которые питают суставную поверхность, расширены, переполнены кровью (рис. 7). Следует заметить, что поверхность регенерата неровная, прерывистая. Хрящ имеет пористую структуру, в области повреждения истончается, что свидетельствует о недостаточно эффективном его восстановления.
У животных 2 исследовательской группы, которым вводили в полость оперированного коленного сустава недифференцированные аллогенные МСК костного мозга, в количестве 2,5 х 106, при гистологическом исследовании хрящевой ткани коленного сустава установлено, что на 45-е сутки после нанесения механической травмы дефект суставного хряща полностью заполнен гиалинового хрящевой тканью с характерной микроскопическим строением для данного типа ткани. Всю площадь ткани занимает ее межклеточное вещество, в которой находятся лакуны, содержащие клетки хрящевой ткани -хондробласты и хондроциты (рис. 8).
У животных 3 исследовательской группы, которым вводили в полость оперированного коленного сустава аллогенные МСК костного мозга после дифференциации в хондрогенном направлении в количестве 2,5 х 106 при гистологическом исследовании материала на 45-е сутки после нанесения экспериментального повреждения хряща было
обнаружено заполнения дефекта суставного хряща гиалиновой хрящевой тканью с типичным микроскопическим строением, характерным для данного типа ткани.
Поверхность регенерата волнистая, однородная, незначительно поверхностная зона регенерата приобретает признаки фиброзной ткани. Количество клеток увеличено, однако неоднородно в разных отделах, располагаются они преимущественно в виде изогенных групп или одиночно.
В участках неповрежденного хряща местами наблюдаются отслоение ткани регенерата (рис. 9).
Качество репаративных процессов в месте дефекта оценивали учитывая поверхностное строение регенерата, морфологию ткани, структуру ее матрикса, характер и жизнеспособность хондроцитов, минирализацию хряща и подхрящевой костной пластинки, наличие зон вторичной оссификации и кровеносных сосудов.
Таблица 2
Результаты оценки качества регенерата по альтернативной OS шкале
№ Морфологичес Животные Животные 1 Животные 2
кие критерии контрольной группы исследовательской исследовательской
(баллы) группы, которым группы, которым
вводили аллогенные МСК, (баллы) вводили аллогенные МСК после
хондрогенной дифференцировки, (баллы)
1 2 3 1 2 3 1 2 3
1 Поверхностное строение регенерата 1 1 1 2 2 2 1 1 2
2 Морфология ткани 2 2 2 3 2 3 1 1 2
3 Структура матрикса 1 0 1 1 1 1 1 1 1
4 Групповое расположения хондроцитов 0 1 1 1 1 0 1 0 1
5 Строение базиса хряща 0 1 1 1 1 1 0 0 1
6 Зоны минерализации 0 1 1 1 1 0 1 1 1
7 Кровеносные сосуды 1 0 0 0 0 1 0 0 0
Всего 6 6 7 9 8 8 7 6 8
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что МСК, введенные в полость коленного сустава в количестве 2,5 х 106 после нанесения экспериментального механического дефекта суставного хряща бедренной кости (при условии сохранения подхрящевой пластинки), эффективно активизируют процессы хондрорегенерации с формированием гиалиновой хрящевой ткани в области дефекта. Кроме того, они проявляют хондропротекторный эффект, предотвращая дистрофическим изменениям со стороны суставного хряща, который граничит с зоной дефекта. Стоит отметить, что введенные МСК с направленной хондрогенной дифференциацией в количестве 2,5 х 106 в полость коленного сустава с экспериментальным механическим повреждением суставного хряща бедренной кости (при условии сохранения подхрящевые
пластинки), также активизируют процессы хондрорегенерации с формированием в области дефекта гиалиновой хрящевой ткани. Однако обнаруженный эффект от их применения был ниже (табл. 2).
Литература
1. Афанасьева Ю.И. Гистология / Под ред. Ю.И. Афанасьева,Н.А. Юриной. - М.: Медицина, 2001. -44 с.
2. Данилов Р.К. Гистология, эмбриология, цитология /Р.К. Данилов. - М.: Мед.информ. агентство, 2006 - 454 с.
3. Практикум по цитологии, эмбриологии и общей гистологии / Под ред. Е.Ф. Баринова и Ю.Б. Чайковского. - М.: 1999.
4. Doe C.Q. Neural stem cells: balancing self-renewal with differentiation / CQ Doe / / Development. -
2008. - Vol.135. - Р. 1575-1587.
5. Eslaminejad M.B. Bone differentiation of marrow-derived mesenchymal stem cells using beta-tricalcium phosphate-alginate-gelatin hybrid scaffolds / MB Eslaminejad, H. Mirzadeh, Y. Mohamadi et al. / / J. Tissue Eng. Regen. Med. - 2007. - Vol.1, № 6. - Р. 417-424.
6. Eslaminejad M.B. Ex vivo Expansion and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Goat Bone Marrow / MB Eslaminejad, H.Nazarian, F. Falahi et al. / / Iranian Journal of Basic Medical Sciences. -
2009. - Vol.12, № 2. - Р. 70-79.
7. Астахова В.С. Остеогенные клетки-предшественники костного мозга человека / В.С. Астахова. -М.: Феникс. - 2000. - 176 с.
8. Кухарчук А.Л. Стволовые клетки: эксперимент, теория, клиника. Эмбриональные, мезенхимальные, нейральные и гемопоэтические стволовые клетки / А.Л. Кухарчук, В.В. Радченко, В. Сирман - Черновцы. Золотые литавры. - 2004. - 505 с.
9. Белогородцев С.Н. Использование мезенхимальных стволовых клеток при полнослойных дефектах суставной поверхности /С.Н. Белогородцев, Н.Г. Колосов, Д.М. Самарин / / травматолого. и ортопед. России. - 2005. - № 35. - С. 27-28.
10. Гончарук Е.И. Опыт применения культуры эмбриональных фибробластов для репарации суставного хряща в крыс / Е.И. Гончарук,Н.А. Волкова, И.А. Засаднюк [и др.] / / трансплантологии. - 2007. - Т. 1,№ 9. - С. 39-44.
11. Bruder S.P. Bone regeneration by implantation of purified, culture expanded human mesenchymal stem cells / SP Bruder, Kurth A.A., Shea M. [Et.al.] / / J. Orthop. Res. - 1998. - № 16. -P. 155 - 162.
12. Патент Украины № 40805, МПК (2009) А61К 35/28. способ прижизненного получения стромальных стволовых клеток костного мозга животных / Мазуркевич А.И., Малюк Н.А., Ткаченко С.М., Ковпак В.В. - № u 2008 13659. Заявл. 26.11.2008. Опубл. 27.04.2009. Бюл.№ 8.
13. Патент Украины № 46600, МПК (2009) А61К 35/28. Способ получения фракции мононуклеарных клеток костного мозга кроликов с высокой пролиферативной активностью / Мазуркевич А.И.,Малюк Н.А., Ковпак В.В., Харкевич Ю.А., Сушко Н.И. - № u 2009 07829. Заявл. 24.07.2009. Опубл. 25.12.2009. Бюл. № 24.
14. Roberts S. Microscopic assessment of cartilage and cartilage repair / S. Roberts, H. Evans // Basic science, clinical repair and reconstruction of articular cartilage defects. - 2006. - Vol. 1. - P. 123-131.
