CC BY
85
УДК 619:615.37.012
И. В. Ковальский, Т. А. Скотникова, Ю. Д. Фролов,
A. А. Нежута, Н. К. Еремец, А. Я. Самуйленко,
B. И. Смоленский, З. А. Канарская
ПРИМЕНЕНИЕ СТАТИСТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ЧАСТЬ 3. АЛГОРИТМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ ВИРУСВАКЦИНЫ ПРОТИВ НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ
Ключевые слова: иммунитет, иммунобиологические препараты, антитела, многомерная статистика, эталонный материал.
На модели вирусвакцины против ньюкаслской болезни разработан алгоритм статистического анализа результатов иммунологических исследований с использованием специального программного обеспечения. Такой подход может быть использован в процессе разработки, аттестации и применения отраслевых стандартных образцов иммунобиологических препаратов (вирусных вакцин для ветеринарии).
Keywords: immunity, immunobiological preparations, antibodies, multivariate statistics, reference material.
On model of virusvaccine against Newcastle disease the algorithm of the statistical analysis of results of immunologic researches with use of the special software is developed. Such approach can be used in the course of development, certification and use of branch standard samples of immunobiological preparations (virus vaccines for a veterinary medicine).
Актуальность
В современной биомедицине особое внимание уделяется проблеме профилактики заболеваний, поскольку она имеет большое социальное и экономическое значение. Наиболее важными составляющими профилактики являются своевременная диагностика с использованием биомедицинской техники и технологий, а для инфекционных болезней - неспецифическая и специфическая коррекция иммунитета с помощью парафармацевтиков (БАДов) и иммунобиологических препаратов (ИМБП) или иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) согласно формулировки статьи 1 (ФЗ № 429 О внесении изменений в Федеральный закон «Об обращении лекарственных средств») соответственно [1].
Учитывая, что профилактика болезней животных -гарантия здоровья человека, особенно важны ИМБП против зоонозов (антропозоонозов) - болезней, общих для людей и животных, передающихся от животных к человеку и практически не передающихся от человека к человеку. Зоонозы могут быть вызваны бактериями - сальмонеллез, бруцеллез, туберкулез, сибирская язва и др., и вирусами - ящур, бешенство, грипп птиц, ньюкаслская болезнь (НБ) и др. [2, 3].
Разработка и производство ИМБП, в частности, вирусных вакцин, - одна из важнейших отраслей биотехнологии, которая сопровождается широким спектром биологических и физико-химических экспериментов с большими объемами данных, обработка и анализ которых требует обязательного применения методов математической статистики [4].
Согласно международным требованиям качество ИМБП обеспечивается тремя основными показателями: безопасность, эффективность и стабильность [5].
Безопасность - безвредность препаратов при применении их животным, а также отсутствие или минимизация вредного воздействия препарата на персонал и окружающую среду при его производстве и применении. Безвредность определяется, как правило, на тест-системах биологической природы различной
сложности - культурах клеток и тканей, эмбрионах, лабораторных животных. Безопасность препаратов обеспечивается использованием асептического метода их производства.
Стабильность ИМБП обеспечивает сохранение активности до момента применения и является важным фактором успешной вакцинации. Изучение стабильности ИЛП является важным критерием для подтверждения неизменности показателей безопасности и эффективности медицинского препарата от даты выпуска до окончания срока годности [6]. Исследования по определению стабильности проводят как в реальном времени, так и при условиях ускоренного старения препарата [6]. Подтверждение стабильности показателей качества ИЛП в течение срока годности свидетельствует о том, что процесс производства и методы контроля выполняются в полном объеме и в соответствии с нормативной документацией [6].
Согласно требованиям ВОЗ [7, 8] при тестировании любого материала (объекта) необходимо использовать эталонный образец (образец сравнения), который предварительно должен быть охарактеризован для получения статуса эталонного. Это особенно важно, когда для контроля используют тест-системы биологической природы (например, культуры клеток и тканей, куриные эмбрионы, лабораторные животные), нестандартность которых может привести к получению ошибочных результатов.
По рекомендациям ВОЗ лабораторный рабочий эталонный материал (ЛРЭМ) необходим для следующих целей: определение биологической активности при серийном производстве препаратов; комиссионное испытание препарата в случае возникновения спорных ситуаций; испытание нового биологического препарата; сравнение результатов научных исследований, касающихся биологических препаратов [6].
В соответствии с терминологией Государственной системы обеспечения единства измерений (РМГ 29-99) ЛРЭМ является стандартным образцом пред-
приятия (СОП), который утверждается руководителем предприятия в соответствии с требованиями нормативных документов.
Изготовление лекарственных средств (ЛС), как правило, осуществляется сериями (партиями), поэтому насколько бы идентичными ни были условия производства невозможно изготовление точно одинаковых серий препаратов, то есть имеет место разброс значений показателей качества. Автоматизация производства уменьшает разброс, но не устраняет его совсем. Поэтому необходимо применение статистических методов анализа, сбора, систематизации данных для всех показателей качества.
Компьютеризированные информационные технологии, благодаря своему быстрому развитию, стали все шире внедряться в область биотехнологических и медико-биологических исследований. В РФ на современном этапе к области обращения лекарственных средств, которые относятся к высокотехнологичной и наукоёмкой продукции, адаптируются элементы CALS/PLM-технологий [9]. Они позволяют создать организационно-техническую систему, обеспечивающую управление всей информацией об ЛС и связанных с ним процессах на протяжении всего его жизненного цикла, начиная с проектирования и производства до снятия с продаж.
Концепция CALS (сокр. от англ. Continuous Ac-guisition and Lifecycle Support) технологии - средства непрерывной информационной поддержки поставок и жизненного цикла продукции. PLM (сокр. от англ. Product Lifecycle Management) - технология управления жизненным циклом изделий.
Программное обеспечение статистической обработки данных биотехнологических и медико-биологических исследований является одним из ключевых элементов этой системы. Статистические критерии являются мощными средствами анализа данных только при их корректном применении, владении статистической терминологией, методами поиска ответа на возникающие вопросы.
При обработке результатов иммунологических исследований важнейшее значение имеют логика статистического анализа, порядок и система научной аргументации при выборе необходимого метода. Правильно подобранный критерий позволяет получить исчерпывающие данные и сделать корректные выводы из них.
Контроль качества лекарственных средств, как правило, основан на информации, полученной с использованием лабораторных методов исследования. При этом определение ее должной достоверности возможно только на основе статистической оценки. Поэтому статистическая обработка результатов исследований, нивелирование погрешностей и повышение точности ключевых показателей обеспечивают высокий методологический уровень исследований и являются необходимым элементом фармацевтической системы качества.
Многолетними исследованиями накоплен большой опыт работы по совершенствованию технологии изготовления сухих вирусвакцин против ньюкаслской болезни (НБ) птиц из лентогенных штаммов [10 - 15].
На современном этапе наименее разработанным является вопрос применения методов статистики и специализированных программных сред для иммунологических исследований. При этом большинство иммунологических исследований, связанных с оценкой эффективности диагностических, лечебных, профилактических и других мероприятий, с прогнозированием исхода заболеваний на основе иммунологических показателей, характеризуется либо очень большими базами данных, требующими структурирования и адекватной оценки, либо, наоборот, с ограниченными объемами данных, которые недостаточны для эмпирических (интуитивных) выводов. Для обоих случаев необходимым является условие грамотного и обоснованного использования методов статистической обработки [16, 17, 18].
Поэтому разработка планомерной и научно обоснованной процедуры (алгоритма) статистического анализа результатов иммунологических исследований с использования специального программного обеспечения является актуальной задачей. Этому вопросу посвящена данная статья.
Цель работы - разработать алгоритм статистического анализа базы данных результатов определения иммуногенности ЭС вакцины против НБ птиц с использованием программных пакетов StatPlus и SPSS 22.
Для достижения поставленной цели решены следующие задачи:
1. Обоснование необходимого и достаточного для оценки иммуногенности количества объектов (голов птицы) в группе.
2. Реализация эксперимента (9 опытов) с обоснованным количеством голов в группе.
3. Оценка однородности различных партий цыплят, используемых в опытах по определению имму-ногенности ЭС, по следующим параметрам: а) уровень антител в сыворотке крови вакцинированной птицы (далее - АТ); б) степень защиты вакцинированной птицы после контрольного заражения (далее - КЗ).
4. Определение наличия и уровня корреляции между: а) величиной прививной дозы (ПД) и уровнем АТ (антител у вакцинированной птицы); б) величиной ПД и КЗ (степенью защиты вакцинированной птицы после контрольного заражения).
5. Оценка наличия и степени корреляция между АТ (уровнем антител у вакцинированной птицы) и эффектом (КЗ - степенью защиты вакцинированной птицы после контрольного заражения).
6. Рассчет эффективной защитной дозы ЭД50 и ЭД95 вакцины.
Материалы и методы
Объект исследования. Эталонная серия (ЭС) сухой вирусвакцины против НБ [12].
Штаммы вируса ньюкаслской болезни: ленто-генный «Ла-Сота», вирулентный - «Т-53» (Томилинский).
Птица. Цыплята 10 - 20-суточного возраста, не имеющие материнских антител к вирусу НБ или с
их остаточным уровнем, не превышающим 2,0 - 2,5
Петухи породы белый леггорн в возрасте 6 - 8 месяцев в качестве доноров эритроцитов для постановки реакции гемагглютинации (РГА) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА).
Птицу получали из благополучных по НБ хозяйств.
Вакцинация. Птицу вакцинировали различными дозами вакцины эталонной серии в десятикратных разведениях от 7,3 до 2,3 ^ ЭИД5о/мл интраназально по 0,1 мл на голову. Поставлено 13 опытов: 4 опыта по 20 голов в группе и 9 опытов по 10 голов.
Контрольное заражение. Вирус вирулентного штамма «Т-53» в дозе 3,0 ^ЛД50 вводили внутримышечно в бедро через 14 дней после вакцинации с последующим наблюдением за зараженной птицей в течение 10 дней и учетом количества выжившей и павшей птицы.
Эффективность вакцинации.
Уровень защиты определяли по выживаемости птицы (в процентах) при контрольном заражении птицы, вакцинированной различными дозами вакцины ЭС.
Иммуногенность (антигенную активность) определяли по содержанию специфических антител (анти ГА - антигемагглютининов) в сыворотках крови птицы, вакцинированной различными дозами вакцины ЭС, по результатам реакции торможения гемагглюти-нации (РТГА) [19].
При постановке опытов по определению иммунологической эффективности вакцины птицу контрольной и опытной групп содержали отдельно.
Инфекционную активность (титр) вируса ЭС вакцины определяли титрованием на 9-10 суточных SPF-эмбрионах по результатам капельной РГА общепринятым методом [18].
Рассчитывали значение эффективных защитных доз вакцины ЭД50 и ЭД95 с использованием пробит-анализа [20].
Статистические методы [6, 20, 21, 22, 23].
Методами дисперсионного анализа [20] оценивали неоднородность различных групп цыплят, используемых в опытах по определению иммуногенности ЭС, по следующим параметрам - уровень антител в сыворотке крови вакцинированной птицы (АТ) и степени защиты вакцинированной птицы после контрольного заражения (КЗ).
Методами корреляционного анализа определяли наличие и уровень корреляции между а) величиной прививной дозы и уровнем антител у вакцинированной птицы; б) величиной прививной дозы и степенью защиты вакцинированной птицы после контрольного заражения.
ЭД50 и ЭД95 вакцины и соответствующую ей прививную дозу определяли с использованием пробит-анализа по Прозоровскому.
Результаты исследований и обсуждение
На первом этапе исследований для оценки им-муногенности статистически обосновали необходимое и достаточное количества объектов (голов птицы) в группе.
Поставлено 4 опыта, в каждом из которых было 6 групп (вакцина в десятикратных разведениях от 10-2 до 10-7) по 20 голов в каждой группе.
Обоснование количества объектов (голов птицы) в группе проводили по результатам анализа титров АТ (антител), так как данный контроль иммуноген-ности вакцины заложен в НД на вакцину.
Исследования проводили по схеме:
1) с помощью генератора случайных чисел (реализация в программе Statplus) выборку сократили с 20 значений АТ до 10;
2) проверили характер распределения данных на близость к нормальному;
3) с помощью F-теста Фишера обосновали выбор вида Ьтеста (критерия Стьюдента);
4) с помощью критерия Стьюдента сравнили группы по 20 и 10 голов.
Близость к нормальному характера распределения данных выборок, содержащих по 20 и 10 значений АТ ( голов в группе) позволяет дальше правомерно применять параметрические критерии, в частности один из видов критерия Стьюдента.
Поскольку по результатам F-тест Фишера показано равенство дисперсий во всех 4-х сравнениях, из трех видов Ьтеста, возможность проведения которых обеспечивает пакет Statplus, нами был применен Ьтест с равными дисперсиями. В результате Ь теста подтверждено отсутствие различий в группах по 10 птиц и по 20 птиц (табл. 1).
Таблица 1 - Результаты F-теста и ^теста
Тест и его № пары
характеристики Пара 1 Пара 2 Пара 3 Пара 4
F 1,1852 1,1280 1,0525 1,3011
F А крит 1,4357 1,4761 1,4357 1,4357
Знач 0,4355 0,6170 0,8014 0,2305
Дис- Дис- Дис- Дис-
Вывод персии персии персии персии
равны равны равны равны
т 0,2817 0,1413 0,2417 0,6981
т крит 1,9735 1,9735 1,9735 1,9735
Знач 0,7785 0,8878 0,8093 0,4860
Разли- Разли- Разли- Разли-
Вывод чия не чия не чия не чия не
выяв- выяв- выяв- выяв-
лены лены лены лены
Таким образом, статистически доказано, что при постановке опытов по иммуногенности кол-во голов в группе можно снизить с 20 до 10. Поэтому дальнейшие эксперименты планировали и реализовыва-ли, исходя из этого положения.
Следующий этап экспериментальных исследований - постановка и реализация эксперимента по оценке иммуногенности вакцины ЭС (9 опытов) с уточненным количеством объектов в каждой группе (по 10 голов).
Поставлено 9 опытов, в каждом из которых было 6 групп цыплят (вакцина в десятикратных разведениях от 10-2 до 10-7) по 10 голов в каждой группе.
Иммуногенность вакцины в опытах оценивали по двум критериям: уровню титра специфических антител (АТ) и результатам контрольного заражения (КЗ). Полученные данные сгруппированы в базы данных для проведения их статистической обработки в соответствии с поставленными задачами.
Далее оценивали однородность различных партий цыплят, используемых в опытах по определению имму-ногенности ЭС, по следующим параметрам: а) уровень антител в сыворотке крови вакцинированной птицы (далее - АТ) и б) степени защиты вакцинированной птицы после контрольного заражения (далее - КЗ). Для решения этой задачи: 1) проверяли характер распределения данных на близость к нормальному; 2) по фактору номера опыта проводили однофакторный дисперсионный анализ (ДА) с применением критерия LSD.
Основные требования ДА: нормальность проверяемых выборок, одинаковое количество значений исследуемого фактора в группе или равенство дисперсий. Близость характер распределения данных (АТ и КЗ) к нормальному свидетельствует о принадлежности выборок к одной генеральной совокупности, поэтому реализован тест сравнения средних (T тест). В нашем случае, где 9 опытов поставлены на разных партиях птицы, нужны множественные сравнения (F-статистика). F-статистика не учитывает ситуации, когда между двумя группами возникает статистически значимое различие, но не настолько сильное, чтобы повлиять на значение самой F-статистики. В таком случае применяется критерий LSD.
Для КЗ и АТ рассчитаны значения F (0,0855 и 0,6289, соответственно) и F^^ (2,1572 и 1,9559, соответственно) при заданном уровне значимости p = 0.05 то есть однородность подтверждена. По результатам применения критерия LSD также не обнаружено статистически значимых различий между группами. Это позволяет для дальнейших исследований обоснованно объединять данные по 9 опытам в одну группу.
Полученное утверждение было использовано при решении следующей задачи: определить наличие и уровень корреляции между:
а) величиной прививной дозы (ПД) и уровнем АТ (антител у вакцинированной птицы);
б) величиной ПД и КЗ (степенью защиты вакцинированной птицы после контрольного заражения).
Определение наличия монотонной возрастающей или убывающей взаимосвязи между дозой и эффектами проводили в несколько этапов:
1) в рамках показателей КЗ и АТ данные девяти групп объединяли в одну;
2) для этого вычисляли среднее геометрическое титра антител (СГАТ) и среднее арифметическое значение результатов КЗ (САКЗ) для каждой прививной дозы (ПД) вакцины;
3) подтверждали близость характера распределения данных исследуемых групп к нормальному;
4) проводили корреляционный анализ (линейная корреляция Пирсона).
Подтверждена близость к нормальному распределения характеристик Доза, Среднее значение АТ и Средний геометрический титр антител, что является обязательным условием проведения КА.
Результаты корреляционного анализа показали наличие сильной взаимосвязи (при заданном уровне значимости р = 0.05):
- между прививной дозой и КЗ (коэффициент корреляции 0,9884; значение Т-статистики 11,2489);
- между прививной дозой и АТ (коэффициент корреляции 0,9481; значение Т-статистики 5,1621).
Таким образом, установлено наличие сильной положительной взаимосвязи между прививной дозой и АТ (уровнем антител у вакцинированной птицы), а также между прививной дозой и КЗ (степенью защиты вакцинированной птицы после контрольного заражения).
Полученные результаты позволили сделать предположение о наличии взаимосвязи между АТ (уровнем антител у вакцинированной птицы) и КЗ (степенью защиты вакцинированной птицы после контрольного заражения).
Наличие и вид зависимости параметра САКЗ от параметра СГАТ изучали с помощью регрессионного анализа, для чего построили регрессионную модель и оценили ее достоверность:
- по коэффициенту корреляции показали наличие взаимосвязи между факторами (без корреляции нет регрессии);
- определили коэффициент детерминации (83 %), т.е. количество подставленных в модель значений, которые будут реально ей соответствовать;
- проверили адекватности линейной регрессионной модели по F-критерию.
Статистическую достоверность коэффициентов регрессии оценили по ^критерию.
Таким образом, наличие корреляции между уровнем антител у вакцинированной птицы и степенью защиты вакцинированной птицы после контрольного заражения статистически подтверждено.
На основании установленной сильной взаимосвязи между прививной дозой и результатами КЗ, полученными на большой базе экспериментальных данных, для вакцины ЭС с помощью пробит-анализа рассчитаны величины эффективных защитных доз -ЭД50 и ЭД95.
Корректное использование данного метода предполагает наличие одинакового числа тест-объектов в группах, математических подходов к решению проблемы построения зависимости «доза—эффект». Регистрируя в нескольких группах опытов частоту возникновения определённого эффекта в ответ на какое-либо воздействие, интенсивность которого нарастает от группы к группе, можно построить кривую «доза—эффект», основным параметром которой является среднеэффективная доза — ED50. Поскольку кривая «доза—эффект» может быть разной крутизны, в части опытов потребуется меньшее, а в части — большее число наблюдений. Для того и другого случая составлены специальные таблицы.
Понимая практические трудности в реализации классических методов пробит-анализа, многие авторы (В.Б. Прозоровский, М.Финни и др.) направляли усилия на разработку по возможности простых и удобных в экспериментальной практике методов определения среднеэффективной дозы и её доверительных интервалов [21]. В.Б. Прозоровским с со-
авт. был предложен метод определения эффективных доз, в частности экспресс-метод определения средне-эффективной дозы по 8 — 12 наблюдениям (9 - это количество наблюдений/опытов/животных, которое достаточно для получения достоверной средней в большинстве экспериментов). Нахождение дозы и её ошибки проводится по таблицам и не требует расчётов.
В отличие от метода Прозоровского метод Финни не пригоден для определения других категорий эффективных доз, кроме среднеэффективной. Учитывая и тот факт, что размерность прививной дозы в наших данных представлена в логарифмической форме, нами был выбран метод Прозоровского.
Данный этап работы выполняется не в самой программе StatPlus, а в модуле для программы EXCEL, который встроен в пакет и устанавливается автоматически вместе с лицензионной версией программы. Панель функций программы StatPlus теперь встроена в панель управления EXCEL. Это отличное решение разработчиков, позволяет избежать переноса больших массивов данных, которые долгое время собирались в формате EXCEL.
Для расчета в программу вводили в виде матрицы следующие данные: Стимул (доза вакцины), Количество выживших (для расчета ЭД, а не ЛД) и Общее количество птицы в каждой группе (10 голов). С помощью матрицы «Доза - Эффект» проводили пробит анализ, на основании которого рассчитывали значения ЭД50 с доверительным интервалом, ЭД90 и ЭДш0, поскольку именно такие величины доступны для расчета в программе StatPlus.
Для расчета более показательной характеристики иммуногенности (ЭД95 и ее доверительный интервал) использовали демо-версию пакета SPSS 22. Результаты расчетов, полученные при использовании этих пакетов, приведены в табл. 2.
Таблица 2 — Результаты пробит-анализа в пакетах StatPlus и SPSS 22
Характеристики регрессионной статистики, в lg ЭИД5о/мл Программный пакет
StatPlus SPSS 22
ЭД50 Величина, в lg ЭИД50/мл 4,1459 4,158
Стандартная ошибка 0,0960
Нижняя граница ЭД50 (ED50 LCL) 3,9569 3,832
Верхняя граница ЭД50 (ED50 UCL) 4,3349 4,411
Бета 0,8966
Бета Стандартная ошибка 0,2300
Y-пересечение (intercept) 1,2827
ЭД10 Величина, в lg ЭИД50/мл 2,7164 2,680
95% доверительные границы для VAR00001
Нижняя граница 2,039
Верхняя граница 3,122
ЭД15 Величина, в lg ЭИД50/мл 2,388
Нижняя граница 2,963
Верхняя граница 3,363
ЭД16 Величина, в ^ ЭИД50/мл 3,0306
ЭД84 Величина, в ^ ЭИД50/мл 5,2612
ЭД85 Величина, в ^ ЭИД50/мл 5,353
Нижняя граница 5,128
Верхняя граница 5,608
ЭД90 Величина, в ^ ЭИД50/мл 5,5754 5,636
Нижняя граница 5,399
Верхняя граница 5,927
ЭД95 Величина, в ^ ЭИД50/мл 6,055
Нижняя граница 5,781
Верхняя граница 6,418
ЭД99 Величина, в ^ ЭИД50/мл 6,841
Нижняя граница 6,469
Верхняя граница 7,370
ЭД100 Величина, в ^ ЭИД50/мл 5,8189
Для оценки вида распределения эффектов в зависимости от дозы построен график зависимости значений Эффектов от Доз (рис. 1).
Пробит-анализ
1 2 3 4 5 6 7
Ститул (Доза)
Рис. 1 - График зависимости Доза - Эффект
Следует отметить близость результатов, полученных при расчете ЭД50 в программных пакетах StatPlus и SPSS 22:
ЭД50 = (4,1459 ± 0,0960) ^ЭИД50 (StatPlus); ЭД50 = (4,158 ±0,0950) ^ЭИД50 (SPSS 22).
Заключение
В результате проведенных исследований на модели вирусвакцины против ньюкаслской болезни разработан алгоритм статистического анализа результатов иммунологических исследований с использованием специально подобранного программного обеспечения.
Научно-практическое значение:
- статистически обосновано необходимое и достаточное количество объектов (голов птицы) в экс-
периментальной группе, которое должно быть не менее 10;
- статистически подтверждена попарная взаимосвязь между прививной дозой вакцины и показателями иммуногенности (уровнем специфических антител в сыворотке крови вакцинированной птицы и степенью защиты вакцинированной птицы после контрольного заражения), что свидетельствует о применимости этих показателей в качестве критериев оценки качества препарата;
- статистически установлена сильная степень корреляции между уровнем сывороточных антител и степенью защиты вакцинированной птицы после контрольного заражения, что позволяет обоснованно заменить контрольное заражение серологическими методами при оценке иммуногенности вирусвакцины против ньюкаслской болезни в процессе ее производства и контроля качества;
- по результатам пробит-анализа определены эффективные защитные дозы (ЭД50 и ЭД95) вакцины.
Методические подходы, применяемые в данной работе, могут быть использованы в процессе разработки, аттестации и применения отраслевых стандартных образцов (стандартных образцов предприятия) иммунобиологических препаратов (в частности, вирусных вакцин для ветеринарии).
Материал рекомендуется для включения в учебный курс по специальности «Биотехнология».
Литература
1. Бактериальные и вирусные зоонозы. Доклады комитета экспертов ВОЗ при участии ФАО, ВОЗ, СТД № 682. Же-нева.100 с. (1985).
2. Самуйленко А.Я., Василевич Ф.И., Воронин Е.С., Тихонов И.В., Гринь С.А., Гаврилов В.А., Грязнева Т.Н., Ере-мец В.И., Раевский А.А., Беро И.Л., Дадасян А.Я. Биотехнология. М., 2013. 746с.
3. Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Непоклонов Е.А., Воронин Е.С., Фомина Н.В., Гринь С.А., Белоусов В.И., Мельник Н.В., Рубан Е.А., Еремец В.И., Сапегина Е.П., Ямни-кова С.С., Цыбанов С.Ж. Инфекционная патология животных. T.I. М.: ИКЦ Академкнига. 911с. (2006).
4. Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Титова Е.И., Прово-торова О.В., Еремец Н.К., Бобровская И.В., Канарская З.А. Вест. Казан. технол. унив. Т.15 , №4, с.69-74. (2012).
5. Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Еремец Н.К., Самуйленко А.Я., Кржижановская Е.В., Чулков А.К.: III Межд. вет.Конг. по птицеводству. М. с. 58-59. (2007).
6. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Иммунобиологические лекарственные препараты. Ч. 2. Гриф и К. М. 536 с. (2013).
7. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. Серия технических докладов № 926. 53 доклад. Женева. (2004).
8. Смоленский В.И., Ю.В. Зуев Ю.В., Руденко Т.В., Горе-ва И.П. Ветеринария. № 1. С.44-47. (2011).
9. Кошечкин К.А., Олефир Ю.В., Меркулов В.А. Управление информационным сопровождением жизненного цикла лекарственных средств. Концепция применения элементов CALS/PLM-технологий для информационной поддержки жизненного цикла лекарственных средств. М. ИП Чувашова Наталья Владимировна. 284с. (2015).
10. Скотникова, Т.А. Авт. дисс. д-ра биол. наук. Щелково. 48 с. (2010).
11. Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Токарик Э.Ф., Ковальский И.В., Еремец Н.К., Павленко И.В., Провоторо-ва О.В., Еремец В.И., Самуйленко А.Я., Канарская З.А. Вест. Казан. технол. унив. Т.18, №2, с.377-383. (2015).
12. Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Токарик Э.Ф., Ковальский И.В., Еремец Н.К., Фролов Ю.Д., Смоленский В.И., Канарская З.А. Вест. Казан. технол. унив. Т.18, №4, с.258-265. (2015).
13. СамуйленкоА.Я., Л.А. Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Ковальский И В., Еремец Н.К. V Межд. съезд ветеринарных фармакологов и токсикологов ЕАЭС. Витебск. с. 67-70. (2015).
14. А.Я.Самуйленко А.Я., Еремец В.И., Скотникова Т.А., Л.А. Неминущая Л.А., Провоторова О.В., Фролов Ю.Д., Ковальский И.В., Чубаров М.В. Вестник Российской сельскохозяйственной науки. № 6. с.8-11. (2016).
15. Ковальский И.В. Международная научно-практическая конференция, Минск. 26-27 ноября 2015 г. с. 266-270.(2015).
16. Юркевич М.Ю., Калугина Т.С. Экологический вестник. №2 (36). с. 49-55.(2016).
17. Третьякова И.В., Левченкова Т.В., Белоусова Р.В. Ветеринария, зоотехния и биотехнология. № 6. с. 33-36. (2016).
18. Алексеева И.А., Р.П. Чупринина Р.П. Стандартные образцы. №3. с. 31-35. (2013).
19. Методические указания по определению по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в РТГА, утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 23.06.97 г., № 13-7-2/988.
20. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях: Ленмедгиз. Л. 180 с. (1962).
21. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1.: Гриф и К. М. С. 891-942. (2013).
22. Füe:///C:/Users/koval/AppData/Roammg/StatPlus6/Help/ Russian/index.html - локальная база знаний пакета «Статплюс».
© И. В. Ковальский - аспирант ФГБНУ ВНИТИБП РАН РФ, vnitibp@mail.ru; Т. А. Скотникова - д-р биол. наук, зав. лаб. отдела обеспечения качества ФГБНУ ВНИТИБП, vnitibp@mail.ru; Ю. Д. Фролов - канд. биол.наук, ученый секретарь ФГБНУ ВНИТИБП, vnitibp@mail.ru; А. А. Нежута - д-р биол. наук, зав. отделом технологии сушки биопрепаратов ФГБНУ ВНИТИБП, vnitibp@mail.ru; Н. К. Еремец - канд. биол. наук, зав. отделом обеспечения качества лекарственных средств для ветеринарии и животноводства, vnitibp@mail.ru; А. Я. Самуйленко - д-р вет. наук, проф., академик РАН, дир. ФГБНУ ВНИТИБП, vnitibp@mail.ru; В. И. Смоленский - д-р биол. наук проф. каф. зоогигиены и птицеводства Московской госуд. академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина; З. А. Канарская - канд. тех. наук, доц. каф. ПищБТ КНИТУ, zosya_kanarskaya@mail.ru.
© I. V. Kowalski - aspirant of Department assurance quality medicines for the Veterinari and livestock; FGBNU VNITIBP; vnitibp@mail.ru; T. A. Skotnikova - Dr. Biol. Sciences; head. Lab .of assurance quality vaccines; FGBNU VNITIBP; vnitibp@mail.ru; Yu.D. Frolov - Cand. Biol. Sci., the scientific secretary; FGBNU VNITIBP; vnitibp@mail.ru; A. A. Nezhuta - Dr. Sci. Biol., the Head of Department of technology of drying of biological products; FGBNU VNITIBP; vnitibp@mail.ru; N. K. Eremetz - cand.Biol. Sciences, head. Department assurance quality medicines for the Veterinari and livestock, vnitibp@mail.ru; A. J. Samuyilenko - academician of RAS, Dr. of veterinary science, professor, Director FGBNU VNITIBP; vnit-ibp@mail.ru; V. I. Smolensky - Dr.Sci.Biol. professor, professor of department of zoohygiene and poultry farming, Moscow state academy of veterinary medicine and biotechnology of K.I. Scriabin", rector@mgavm.ru; Z. A. Kanarskaya - Ph.D, Associate Professor, Department of Food Biotechnology, KNRTU, zosya_kanarskaya@mail.ru.
