CC BY
415
Сухих А.С., Кузнецов П.В.
Кемеровская государственная медицинская академия,
г. Кемерово
ПРИМЕНЕНИЕ СОРБЕНТА УНИВЕРСАЛЬНОГО НАЗНАЧЕНИЯ СЕФАДЕКСА LH-20 В СОВРЕМЕННЫХ МЕДИКОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
В обзоре обобщены литературные данные и подведён итог более чем тридцатилетнего успешного применения сефадекса LH-20 в разделении, очистке и препаративном накоплении различных классов биологически активных веществ. Показаны перспективы применения сорбента в современных медико-биологических исследованиях.
Ключевые слова: сефадекс LH-20; гель-хроматография;
очистка биологически активных веществ.
Sukhikh A.S., Kuznetsov P.V.
Kemerovo State Medical Academy,
Kemerovo
APPLICATION OF A SORBENT OF UNIVERSAL APPOINTMENT СЕФАДЕКСА LH-20 IN MODERN MEDICAL AND BIOLOGIC RESEARCHES
In the offered review the literary data are generalized and the certain result more than thirty-year successful application is brought sephadex LH-20 in division of clearing and preparative accumulation of various classes of biologically active substances. Prospects of application of a sorbent in modern medical and biologic researches are shown.
Key words: sephadex LH-20; gel-chromatography;
clearing of biologically active substances.
Современный уровень медицинских и фарма- вателей вызывают универсальные хроматографичес-цевтических исследований требует получения кие методы и сорбенты, позволяющие осуществить высокочистых индивидуальных веществ, экс- выделение, разделение и препаративное накопление трагируемых из объектов животного и растительно- органических веществ различных классов. го происхождения. Такая задача актуальна для раз- В этом контексте, по совокупности большого чис-личных областей химии и медицины, но в большей ла экспериментальных работ, одним из наиболее унистепени в биохимических и фармакологических исс- версальных сорбентов, применяемых для хроматог-ледованиях. рафии различных веществ, оказался декстрановый
Научные исследования сопряжены с решением сорбент сефадекс LH-20 (липофильно-гидрофильный нестандартных задач и, как правило, в естественно- сефадекс — ЛГС). Уникальные физико-химические научных дисциплинах, на современном уровне, су- свойства этого сорбента, используют на любой стадии ществует необходимость доказательного наличия не- очистки (хроматографирования) непосредственно при которых веществ, относящихся к различным классам «начальной» очистке или доочистке после ионообмен-[1]. Поэтому особую заинтересованность у исследо- ной хроматографии (ИОХ), обращено-фазовой высо-
_____________________________________________ ко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ),
Корреспонденцию адресовать: а также как завершающий этап при разделении диас-
Сухих Андрей Сергеевич, тереомеров. Отмечено, что предварительное приме-
650029, г. Кемерово, ул. Ворошилова, 22а, нение ЛГС повышает последующую эффективность
ГОУ ВПО «Кемеровская государственная тонкослойной хроматографии (ТСХ), например, при
медицинская академия», выделении и очистке феромонов различной химичес-
Тел. раб. 8 (3842) 73-48-72. кой природы [2]. Применение ЛГС позволяет осущест-
влять выделение, очистку и разделение природных соединений различной структуры, при этом необходимо подчеркнуть, что, используя сорбент данного типа, набор подвижных фаз не ограничивается только водой (как в классическом варианте гель-прони-кающей хроматографии), а возможно применение относительно различающихся по физико-химическим свойствам органических растворителей (табл. 1), в том числе и апротонных [3].
Таблица 1
Параметры набухания матрицы и граница прозрачности растворителей, используемых при хроматографировании на ЛГС
Впервые промышленный выпуск сефадекса был освоен Шведской фирмой «Pharmacia» в 1966 г., и в настоящее время он изготавливается рядом известных химических фирм [4, 5]. Сефадекс LH-20 является бисерным поперечно-сшитым декстрановым сорбентом, получаемым алкилированием (введением оксипропиловых групп) сефадекса G-25 [4]. Именно такая химическая модификация исходного сорбента обеспечивает высокую стабильность и определяет ли-пофильные (L) и гидрофильные (H) свойства, позволяя осуществлять хроматографирование, используя для элюции широкий набор органических растворителей практически без каких-либо структурных изменений сорбента. Он стабилен в диапазоне значений рН 2-13, и может быть подвергнут автоклавированию в течение 30 мин. при 120°С без разрушения.
Диапазон фракционирования по молекулярным массам составляет от 100 до 2000-10000 Да, в зависимости от выбранного растворителя [3], по некоторым данным — от 4000 до 6000 Да [4]. Такое отличие, вероятно, связано с использованием при элюции различных растворителей, к сожалению, не обозначенных авторами. По современным представлениям, как показал недавно Х. Хенке, характер разделения на данном сорбенте может определяться не только режимом классической гель-фильтрации, но также адсорбционной и распределительной хроматографией, что во многом определяется выбором растворителя (элюента) [6, 7].
Размер частиц набухшего носителя и хроматографическая способность у геля зависят от используемого растворителя, обобщенные данные представлены в таблице 1.
Наибольшее практическое применение в качестве элюентов с ЛГС находят растворители, как правило обладающие границей УФ прозрачности не выше 240-245 нм, а так же дающие объём упакованного геля не менее 2,5 мл/г. Как видно из таблицы, к таким растворителям в первую очередь относиться вода, метанол (МеОН), дихлорметан (ДХМ) хорошо подходит как подвижная фаза при разделении среднеполярных и низкогидрофобных соединений. Так же может проводиться избирательное разделения по увеличивающейся полярности и электроотрицательности. По заключению Х. Хенке [5] о ЛГС: «ни с каким другим полимерным гелем даже приблизительно нельзя достигнуть сравнимых разделений». При этом «для разделения смеси метанолом требуется 5-метровая колонна, а с помощью ацетона достаточно уже высоты гелевого слоя 870 мм, при разделении же метиленхлоридом достаточно 200-350 мм гелевого слоя [5].
Существенным преимуществом ЛГС является возможность использования в качестве подвижных фаз чистых органических растворителей. При этом, смешивая растворители в определённых пропорциях можно оптимизировать элюирующие системы, достигая особой избирательности [8-10].
Активное применение ЛГС в биохимии связано с синтезом биологически активных пептидов, и непосредственным выделением и очисткой веществ белковой природы. Наиболее существенной проблемой, является сложность методов очистки промежуточных защищённых пептидов от исходных соединений и различных побочных продуктов, образующихся почти на каждой стадии синтеза. В большинстве случаев пептиды имеющие более пяти-семи аминокислотных остатков можно растворить только в полярных растворителях, таких, как диметилформамид (ДМФА) и диметилсульфоксид (ДМСО), в этой связи при-
Растворитель Объём матрицы, мл/г (сухого геля) УФ граница прозрачности (нм)
Диметилсульфоксид 4,4-4,6 270
Пиридин 4,2-4,4 305
Вода 4,0-4,4 190
Диметилформамид 4,0-4,4 268
Метанол 3,9-4,3 210
Хлороформ 3,8-4,1 245
Пропанол 3,7-4,0 210
Этанол 3,6-3,9 210
Изобутанол 3,6-3,9 225
Дихлорметан 3,6-3,9 245
н-Бутанол 3,5-3,8 220
Изопропанол 3,3-3,6 210
Тетрагидрофуран 3,3-3,6 220
Ацетон 2,4-2,6 330
Ацетонитрил 2,2-2,4 200
I4 CI C 1,8-2,2 265
Бензол 1,6-2,0 280
Этилацетат 1,6-1,8 260
Толуол 1,5-1,6 285
Сведения об авторах:
Сухих Андрей Сергеевич, канд. фарм. наук, ст. науч. сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории, ГОУ ВПО «КемГМА Росздрава», г. Кемерово, Россия.
Кузнецов Петр Васильевич, доктор фарм. наук, профессор, академик РАЕН, зав. кафедрой фармацевтической и токсикологической химии, ГОУ ВПО «КемГМА Росздрава», г. Кемерово, Россия.
менение сорбента ЛГС позволяющего производить очистку используя данные растворители является вполне оправданным [10-13].
Отмечено, что наиболее полная очистка пептидов достигается сочетанием нескольких хроматографических методов. Так, циклические пептиды с 22 остатками аминокислот, полученные в режиме работы [14], проявили выраженные гидрофобные свойства, поэтому содержащиеся примесные компоненты удалить с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ оказалось невозможным. Однако, применение тандемного варианта, включающего обращенно-фазовую ВЭЖХ и гель-хроматографию на ЛГС, позволило получить целевой продукт, чистота которого по данным ЯМР Н1 составила более 95 %.
Используя ЛГС в режиме предколонки, перед высокоэффективной противоточной хроматографией (ВЭПХ) удалось уже после первого прохождения, в режиме ВЭПХ, получить продукт с содержанием основного действующего вещества более 90 % [15]. В другом исследовании фракционирование пептидов на ЛГС в ДМФА позволило изолировать и очистить пептиды ингибирующие ангиотензин I-конвертиру-ющий фермент [16].
Экстрагированный смесью органических растворителей 5-гидрокситриптамин (серотонин) из образца морской губки Hymeniacidon heliophila, и рассматриваемый как один из химических факторов, предотвращающих окислительное повреждение этого объекта, вызванного УФ-облучением [17]. При выделении серотонина из суммарного экстракта в количестве около 2,6 г, были использованы достаточно большие объёмы геля (колонка с диаметром 6 см, высотой 1 м), а в качестве элюента МеОН. Это позволило получить в один этап хроматографически чистый серотонин в количестве 1,62 мг [17].
Другой вариант применения ЛГС (предложен в начале 80-х гг. прошлого века), как сорбента для ВЭЖХ, использован для хроматографии защищённых пептидов фрагментов нейротоксина II из яда среднеазиатской кобры [12]. По мнению авторов работы, для ВЭЖХ пептидов из исследованных в работе гелей: сферон Р-40, Р-300, Р-1000, сефадексов LH-60 и ЛГС только последний показал наилучший набор свойств: высокую селективность, умеренную жёсткость при работе под давлением, стабильность во времени. К недостаткам сорбента в используемом режиме отнесены частичная сорбция некоторых пептидов и невозможность разделения защищенных пептидов с молекулярной массой выше 2000 Да [12]. Однако, по ряду причин, этот метод не нашел широкого применения.
Описана возможность непосредственного применения ЛГС и в режиме гель-хроматографии для выделения и очистки пептидов. Из экстрактов восковой моли (Galleria mellonella (L.)), используя колонку 1,2 на 83 см, заполненную ЛГС, и элюируя 34 % этанолом, были выделены пять пиковых фракций пептидной природы, показавшие активность против микобактерии туберкулёза [18].
Наличие достаточно высокой химической стабильности делает возможным применение данного сор-
бента в качестве матрицы и в режиме твёрдофазного синтеза пептидов. Такой подход используется в работах по синтезу гексапептида энкефалина и его аналогов [19-20].
Жидкостная колоночная хроматография является наиболее важным методом очистки, разделения и препаративного накопления при исследовании липидов. При разделении липидов на ЛГС наибольшую популярность получили элюенты, содержащие хлороформ, этанол (метанол) в различных соотношениях [21-22]. Эфиры сахарозы и жирных кислот были разделены на моно-, ди-, три- и более высокие эфиры на ЛГС с помощью ДМФА в качестве подвижной фазы [23]. При разделении липидов, содержащихся в ткани мозга, на ЛГС, отмечено, что в смеси хлороформ-МеОН (2 : 1) ЛГС проявляет свойства слабоосновного анионита и фосфолипиды разделяются в соответствии с их основными свойствами. Однако в смеси хлороформ-МеОН-вода (65 : 35 : 8) ЛГС выступает в роли молекулярного сита и разделение веществ осуществляется по их молекулярным массам [21]. Так же возможно использование неполярных растворителей, но при этом процесс разделения во многом обусловлен образованием более крупных мицелл фосфолипидов. Использование липофильного сорбента ЛГС оказалось достаточно эффективным при хроматографической очистке жирорастворимых витаминов и их аналогов. Липо-фильная гель-хроматография с использованием ЛГС позволила разделить а-, Р-, у- и 8-токоферолы, а также разделить их продукты окисления, токоферолхи-ноны или другие продукты окисления [24].
Некоторые авторы отмечают, что предпочтительное использование тех или иных сорбентов специфически характерно для различных специалистов [25]. Так, колоночная хроматография на ЛГС становится более популярной в клинической лабораторной диагностике для выделения стероидов из плазмы прежде, чем они будут изучены методами радиоиммунологии или аффинной хроматографии [26]. В настоящее время описано огромное количество работ, в которых колоночная хроматография используется для разделения стероидов. Это, в первую очередь, связано со строением молекулы большинства стероидов, которые обладают средней полярностью и, как правило, липофильны [25]. Применяют ЛГС для разделения самых различных стероидов (табл. 2).
Интересно, что характерная особенность эстрогенов — наличие в их молекулах фенольной группы — способствует взаимодействию этих соединений с ЛГС [27]. Описано разделение прогестинов и эстрогенов на ЛГС в системе МеОН-вода (85 : 15) [25]. Использование данного сорбента оказалось удобным для выделения и очистки альдостерона и других кортикостероидных гормонов [28]. При этом показано, что ЛГС особенно удобен при разделении стероидов с близкой полярностью [27]. Оказалось эффективным использование ЛГС и для очистки фармацевтических композиций, содержащих эфиры стероидов, а так же разделения их стереоизомеров [29]. Несомненно, ЛГС занимает ключевое место в исследовании метаболизма тиреоидных гормонов [30].
Таблица 2
Хроматографические фазы, используемые
для элюирования некоторых стероидных соединений
В ставшем классическим руководстве по жидкостной колоночной хроматографии, трехтомном издании под редакцией З. Дейла, К. Мацека, Я. Янака, описаны различные модифицированные производные сефадексов, нашедших широкое практическое применение при хроматографии стероидов [25]. Особую популярность в 70-80 гг. прошлого века для разделения слабо полярных стероидов получил оксиалкок-сипропилпропилированный ЛГС (липидекс) [35-36].
Важными этапами в изучении структуры и функции нуклеиновых кислот являются их выделение из клетки или субклеточных частиц, очистка от различного рода примесей, фракционирование для получения препаратов гомогенных по химическому составу, молекулярному весу и надмолекулярной организации. При фракционировании нуклеиновых кислот на ЛГС осуществляется распределительный тип хроматографического процесса с гидрофильным и гидрофобным взаимодействием (различия в коэффициентах распределения) [25]. Однако, для выделения ДНК, метода противоточного распределения, до сих пор остаётся малоизученным подходом. Известны данные по использованию для этих целей и ЛГС [25]. Особенно впечатляюще выглядят работы по применению ЛГС в генетической и клеточной инженерии, конструировании химерных растений и исследовании структурно-функционального генетического аппарата. Так, в оригинальном методе реконструкции генетической системы митохондрий самосборкой мембранных частиц в момент гель-фильтрации солюбилизата митохондрий на колонке с ЛГС происходит образование протеолипосом (митосом), обладающих способностью к матричному синтезу РНК и ДНК [37]. В другой работе процедура гель-фильтрации на ЛГС с анионным детергентом (хола-том натрия) позволяет осуществить реконструкцию монооксигеназной системы микросом печени крыс [38].
Особую роль ЛГС занимает в химии природных соединений при выделении и очистке вторичных продуктов метаболизма растений, универсальные свойства обуславливают его активное использование при разделении различных классов БАВ. Тесная взаимосвязь хроматографических методов и фармакологических исследований позволяют эффективно сконцентрировать усилия исследователей на выделение компонентов с определённым видом фармакологической активности, накапливать требуемые фракции и определять взаимосвязь между биологической активностью и структурой вещества.
Такой оригинальный подход использован в работе [39], для выделения и разделения биологически активных компонентов из этанольного экстракта Dipsacus а8рег, содержащего иридоиды. Упаренный суммарный экстракт был предварительно фракционирован на ионообменной смоле системой градиентов; полученные пять фракций были проверены на цитотоксическую активность (ЦА). Фракция, проявляющая активность (3 фракция в количестве 30 г), была нанесена на колонку с ЛГС, и элюирована системой МеОН : Н2О (80 : 20); полученные шесть подфракций так же были проверены на ЦА. Фракция с максимальной активностью была накоплена и подвергнута дополнительным этапам очистки при использовании ЛГС (МеОН : вода 80 : 20) и лихросорба Rp-18 (ацетонитрил : вода 20 : 80), препаративной ТСХ, и финальной очистке препаративной обращеннофазной ВЭЖХ на колонке с С18 с использованием водных растворов ацетонитрила в различных пропорциях. В другой недавней работе [40] из корней Ьо1ш ]а-рошсш был выделено вещество, проявляющее биостимулирующие эффекты и идентифицированное как (+) - 5-диоксистригол. Интересно, что в данной работе, объединенные гексановые экстракты были предварительно очищены на ЛГС, где в качестве элю-ента использована смесь МеОН : хлороформ (4 : 1). Однако на следующем этапе фракционирования был использован ЛГС, а в качестве элюента применялась менее полярная элюирующая система — МеОН : вода (1 : 1).
Дитерпены рассматриваются некоторыми авторами как самостоятельный класс БАВ, и составная часть смол и бальзамов [41], могут быть успешно очищены на ЛГС [42]. Описана возможность применения ЛГС для разделения и очистки тритерпе-новых [43] и стероидных [44] сапонинов.
Универсальные свойства ЛГС позволяют использовать для хроматографии образцы без предварительной подготовки. Такой подход применен для разделения и количественного определения фенольных и полифенольных соединений, содержащихся в винах, что позволяет определять их возраст и критерии качества [45-46]. При этом монофенолы с ЛГС элюируются 60 %-м МеОН, а последующее вымывание с 50 %-м ацетоном позволяет количественно элюировать сумму полимерных фенолов. Сравнительные хроматографические профили оказались практически подобными при разделении фенолов и полифенолов в подходе с использованием ЛГС и в методе ВЭЖХ [47]. Однако, к сожалению, авторами работы не указан тип используемого ВЭЖХ сорбента.
Другое существенное свойство ЛГС (разделять цис-, транс-изомеры) можно проиллюстрировать следующим примером. При определении антиоксидан-тной активности стильбена, выделенного из винограда, используя ЛГС (в качестве элюента применя-
Группа веществ Подвижная фаза Лит. ссылка
Эстрогены Циклогексан : хлороформ : МеОН (8 : ' I : 1) [27]
Эстрогены, стероиды Бензол : МеОН [31]
Стероиды желчи МеОН : хлороформ (1 : 1) [32]
Кортикоиды, 17-кетостероиды н-бутанол 99 % [33]
Стеролы Дихлорметан [34]
ли 20 % раствор МеОН) с колонки удалось выделить цис-стильбен, тогда как транс-стильбен (транс-реве-ратрол) элюировался только при использовании 30 % МеОН [48-49]. При этом степень очистки и конфар-мационые особенности строения подтверждены методом ВЭЖХ и комплексом спектральных методов. Некоторые данные по использованию ЛГС для выделения и очистки фенольных соединений приведены в таблице 3.
Другой класс природных фенольных соединений лигнаны являются димерами фенилпропана. Как правило, это твердые, бесцветные или окрашенные кристаллические вещества, хорошо растворимые в спирте, хлороформе, жирных и эфирных маслах; нерастворимы в воде (за исключением гликозидов) [56]. Наличие таких физико-химических характеристик обуславливает эффективное использование ЛГС для выделения и очистки индивидуальных веществ класса лиг-нанов различного функционального строения [57]. Наиболее ярким примером является недавняя работа группы исследователей из Китая, в которой упаренный этанольный экстракт из стеблей Schisandra henryi, обрабатывали различными по полярности органическими растворителями, а полученные вторичные извлечения были доочищены на колонках с силикагелем и ЛГС, что позволило не только разделить, но и осуществить препаративное накопление десяти веществ класса лигнанов, среди которых описано два новых: генрицин (А) и генрицин (В) [58].
Несомненно, что ЛГС имеет первостепенное значение для выделения флавоноидов из растительного материала, а также их метаболитов при определении физиологической активности в опытах in vivo.
Известно, что хроматография флавоноидов на сефа-дексах получила развитие с начала 1970-х годов. Изначально используемый сефадекс G-25 оказался непригодным в связи с разрушением его под действием крепких растворов спиртов и невозможностью использования других органических растворителей в качестве элюентов [27]. Поэтому исследования фла-воноидов, их очистку и разделение, по современным представлениям, оптимально проводить на более ста-
бильном липофильном ЛГС [59-61]. Хроматография на ЛГС в МеОН позволяет разделять как флавоны, так и флавононы. В данных условиях флавоны (например, лютеолин) элюируются с колонки раньше фла-вононов (например, кверцетин), при этом кверцетин удерживается сильнее своих метильных производных [62]. Оказалось успешным разделение кверцетина и кемпферола на ЛГС при элюции МеОН [63]. Для выделения флавоноидных компонентов из этанольно-го экстракта Viscum coloratum также использована система с колонкой ЛГС. Основными идентифицированными компонентами оказались гликозиды го-моэриодиктола и нарингенина, рутин [51, 64].
Таким образом, на адсорбцию флавоноидов влияет наличие гидроксильных групп у С3 и С5 атомов углерода. Флавоны и монометоксилированные флавонолы элюируются значительно быстрее, чем аналогичные им флавонолы. Флавононы, не имеющие цепи сопряжения (нарингенин, гесперидин), при элюировании почти не отделяются друг от друга [59]. В исследовании L. Xiaoli и соавт., используя в качестве подвижной фазы смесь МеОН: хлороформ (1 : 1) на ЛГС были успешно разделены 12 веществ флавоноидной природы, выделенные из экстракта Erythrina variegata [65]. В экспериментах in vitro исследован метаболизм генистеина, содержащегося в натуральных пищевых продуктах из сои [66]. Поскольку метаболизм происходит в печени с последующей желчной экскрецией, то образцы, содержащие глюкураниды генистеина были сильно загрязнены солями желчных кислот таурохолатами, частично очищенный материал был подвергнут ферментативному гидролизу. Очистить основной продукт от образовавшихся холевой кислоты и таурина оказалось возможным только используя колонки с ЛГС [66]. Оптимизация хроматографического разделения и очистки флавоноидов может быть достигнута различными подходами, применением рехроматографии (последовательного применения ЛГС, а также других сорбентов, например силикагеля, ионообменных смол и др.) [67-68]. Описано тандемное использование полиакриламидного геля и ЛГС при выделении и очистке
Таблица 3
Элюенты, используемые при хроматографировании некоторых растительных БАВ
Вещество или группа веществ Растительный источник Используемые элюенты или их смесь Дополнительный метод или сорбент Лит. ссылка
Флавононы Листья Жасмина (]аБт1пит 1апсво1аг1ит) MeOH 50 % Силикагель [50]
Флавоноиды гликозиды производные гомоэриодиктола и нарингенина Стебли и листья Viscum со!огаЮт MeOH градиент 50-80 % ИОХ [51]
Дитерпены CHCI3:MeOH (1:1) Силикагель [52]
( + ) - 5-диоксистригол MeOH : CHCI3 (4 : 1) ^ MeOH : Н2О (1 : 1) - [40]
Иридоиды MeOH : H2O (80 : 20) ВЭЖХ, ИОХ [39]
Лигнаны Листья и стебли Kadsura philippinensis MeOH Силикагель [53]
Ксантоны Стебли Garcinia сома MeOH (95 : 5) Силикагель [54]
Фенилпропаноиды Трава Boschniakia rossica MeOH градиент 0 ^ 20% ИОХ, ВЭЖХ [55]
флавоноидов Hypericum perforatum [69]. В недавней работе [70] использование ЖКХ с применением тандема, гель-хроматографии на ЛГС, и ТСХ позволило разделить экстракт Cistus laurifolius на 6 хроматографических фракций, при этом фракция, содержащая 3-метиловый эфир кверцетина (изорамнетин) показала относительно высокую активность in vitro против микроорганизма Helicobacter pylori. С другой стороны, применение различных комбинаций органических растворителей (MeOH-хлорофарм, MeOH-дихлорметан и др.) [71-73]. Некоторые варианты разделения и дополнительные сорбенты, используемые для выделения и очистки флавоноидов, обобщены в таблице 3.
Вторичный этилацетатный экстракт МеОН извлечения из корней Ostericum koreanum (Max.) первоначально был хроматографирован на ЛГС элюированных MeOH, это позволило выделить четырнадцать фракций, среди которых был выделен новый хро-мон (11-гидрокси-цис-О-глюкозилгамаудол) [74]. В этом исследовании для полноты очистки и разделения одна из ключевых фракций была повторно хроматографирована на ЛГС, где в качестве элюента был использован этанол.
В химии природных соединений ксантоны занимают важное место, проявляют различные биологические эффекты: антимикробное, противомалярийное, противоопухолевое действие, а некоторые производные обладают противовоспалительными эффектами [56, 75]. Данные соединения имеют структуру дибен-зо-у-пирона и родственны флавоноидам, поэтому хроматографическое поведение этих групп достаточно сходно. При хроматографической очистке данной группы на ЛГС в качестве элюентов используют крепкие растворы алифатических спиртов (табл. 3.). При изучении Garcinia cowa из извлечения, полученного экстракцией 95 % этанолом, элюируя ЛГС достаточно крепким раствором МеОН, было выделено 7 различных ксантонов, три из которых были описаны впервые [54].
Димерные производные антрацена по типу би-сантрохинона выделены из культивированной грибковой массы Diaporthe sp. и успешно очищены на 150 мл колонке с ЛГС с этанолом в качестве подвижной фазы[76].
По данным [77], полифенолы являются функциональными компонентами в яблоках и могут быть разделены на 4 группы с помощью ЛГС на эпика-техиновые, полицианидоловые олигомеры, хлорогеновую кислоту и процианидоловые полимеры.
В обзоре [78] по жидкостной колоночной хроматографии (ЖКХ) дубильных веществ приведены данные по разделению на ЛГС смесей дубильных веществ в соответствии с их молекулярной массой. Их можно выделить и в виде индивидуальных компонентов в чистом виде.
Для получения очищенных полимеров проанто-цианидинов из экстракта растений семейства Legu-minosae Jones et al. [79] первоначально хроматографировали на сефадексе G-50, элюируя их 50 %-ным ацетоном, а затем выделяя их на колонке с ЛГС.
В недавней работе [80] полимерные танины Ca-narium album были очищены на ЛГС, для чего, используя систему MeOH : вода (1 : 1) с колонки, были элюированы олигомерные танины, а подключив систему ацетон : вода (70 : 30), успешно выделены полимерные танины. Из олигомерных фракций спиртового экстракта корней Polygonum coriarium на ЛГС и изократическом режиме элюирования 80 % этанолом авторами работы [81] получено 6 индивидуальных проантоцианидинов с различной степенью полимеризации, в том числе: таранин (Мм 2400), таранозид А (Мм 2500) и таранозид В (Мм 3100). Новый элла-готаниновый димер, обозначенный как эускафинин, был изолирован из листьев Euscaphis japonica, где на этапе доочистки использован также ЛГС, а в качестве элюента — система МеОН-вода-ацетон [82]. Специфическое наличие липофильно-гидрофильных свойств в полной мере продемонстрировано в работе K. Komatsu et al. [83], которые использовали ЛГС для разделения БАВ из корней различных видов Рев-ня (R. tanguticum, R. palmatum и R. officinale). Так, элюирование водой позволило очистить танины от низкомолекулярных примесей, а повышая градиентную концентрацию МеОН до 99 %, позволило выделить фракции моно-, ди-, тримерных танинов, при этом процианидины были элюированы 60 % ацетоном.
Известно, что алкалоиды представляют достаточно большую часть органических азотсодержащих соединений основного характера, обладают сильным физиологическим действием. Поэтому поиск и выделение новых типов алкалоидов является приоритетным направлением для нужд современной медицины. К сожалению, исследования, описывающие выделение алкалоидов из объектов природного происхождения, где в качестве основного сорбента используется ЛГС, характеризуются единичными публикациями. Так, описано выделение алкалоидов животного происхождения из морского моллюска Jorunna fu-nebris, элюируя системой хлороформ-этилацетат на ЛГС были выделены три фракции рениерамицины O и Q, юорунамицин Б и мимозамицин, первичное испытание которых показало при очень низких концентрациях выраженные цитотоксические эффекты против некоторых видов раковых клеток [84]. В другой работе модифицированные производные нафти-лизохинолина очищали при помощи ЛГС, а затем исследовали их антилишманиазную активность [85].
При использовании ЛГС в качестве сорбента возможны разделение и очистка высокомолекулярных соединений, а также продуктов их химической или биологической деполимеризации [5]. Низкомолекулярные продукты деградации лигнина (некоторыми микроорганизмами) были отделены от высокомолекулярных компонентов при элюировании ДМФА на ЛГС [86].
Высокая химическая стабильность ЛГС позволяет использовать его для фракционирования от низкомолекулярных компонентов уникальных полимеров природного происхождения — гуминовых кислот. В данном случае применение ЛГС обусловлено воз-
^■
можностью осуществлять хроматографирование в режиме водной элюции с последующей многократной «регенерацией» сорбента с практически полным десорбированием низкомолекулярных фрагментов с его поверхности [87]. Это выгодно отличает его от других типов гелей, позволяя оптимизировать работу по выделению, очистке и препаративному накоплению хроматографически очищенных фракций гуминовых кислот и гуминоподобных веществ [88].
Отдельно необходимо рассматривать вопрос, связанный с возможностью модификации сорбента для оптимизации хроматографического разделения ключевых биологически-активных соединений. Известны модифицированные производные: оксиалкоксипро-пилированный, карбоксиметоксипропилированный, диэтиламиноэтоксипропилированный ЛГС [25]. Эпок-симодифицированные производные ЛГС, сконструи-
ЛИТЕРАТУРА:
рованные по принципу адсорбентов аффинного типа и содержащие различные лиганды (новокаиновый, троксерутиновый, п-нитроанилиовый и др.), оказались эффективными не только для выделения низкомолекулярных веществ, но и для стандартизации лекарственных препаратов [87-89].
Достаточно перспективными видятся возможности модифицированных сорбентов на основе ЛГС в режиме неводного элюирования, которое в настоящее время остается практически не исследованным.
Подводя определённый итог успешного применения ЛГС для выделения, разделения и очистки различных классов физиологически активных веществ, а также уникальность хроматографических параметров, очевидна перспективность его применения в современных медико-биологических исследованиях и химии природных соединений.
1. Яшин, Я.И. Аналитическая хроматография. Методы, аппаратура, применение /Я.И. Яшин,
A.Я. Яшин //Успехи химии. - 2006. - Т. 75, № 4. - С. 366-379.
2. Лебедева, К.В. Феромоны насекомых /К.В. Лебедева, В.А. Миняйло, Ю.Б. Пятнова. -
М., 1984. - 152 с.
3. Микеш, О. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам /О. Ми-кеш. - М., 1982. - Т. 1. - 290 с.
4. Лурье, А.А. Сорбенты и хроматографические носители: Справочник /А.А. Лурье. - М., 1972. - 320 с.
5. Хенке, Х. Жидкостная хроматография /Х. Хенке. - М., 2009. - 264 с.
6. Справочник биохимика /Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот и др. - М., 1991. - 544 с.
7. Jia, J.M. Cordyceamides A and B from the culture liquid of Cordyceps sinensis /J.M. Jia, H.H. Tao,
B.M. Feng //Chem. Pharm. Bull. - 2009. - V. 57, N 1. - P. 99-101.
8. Daidzein and genistein glucuronides in vitro are weakly estrogenic and activate human natural killer cells at nutritionally relevant concentrations /Y. Zhang, T. Song, J.E. Cunnick et al. //J. Nutr. - 1999. - V. 129. - P. 399-405.
9. Кротью, Р. Терпены /Р. Кротью, Р.К. Рональд //Хроматография. Практическое приложение метода. - М., 1986. - С. 229-285.
10. Cyclic peptides from the seeds of Annona glauca and A. cherimola /A. Wele, Y. Zhang, L. Du-bost et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2006. - V. 54, N 4. - P. 690-692.
11. Simultaneous optical and electrical recording of single gramicidin channels /V. Borisenko, T. Lo-ugheed, J. Hesse et al. //J. Biophysical. - 2003. - V. 84. - P. 612-622.
12. Нефёдов, П.П. Высокоэффективная эксклюзионная жидкостная хроматография защищённых пептидов на мягких и полужестких гелях /П.П. Нефёдов, Т.П. Жмакина, Б.Г. Беленький //Биоорганическая химия. - 1983. - Т. 9, № 5. - С. 616-627.
13. Apolar chromatography on Sephadex LH-20 combined with high-speed counter-current chromatography: High yield strategy for structurally closely related analytes-destruxin derivatives from Metarhizium anisopliae as a case study /C. Seger, K. Eberhart, S. Sturm et al. //J. Chro-matog. A. - 2006. - V. 1117, Issue 1. - P. 67-73.
14. Solid-phase synthesis of backbone-cyclized в-helical peptides /T.D. Clark, M. Sastry, C. Brown et al. //Tetrahedron. - 2006. - V. 62, Issue.41. - P. 9533-9540.
15. Apolar chromatography on Sephadex LH-20 combined with high-speed counter-current chromatography high yield strategy for structurally closely related analytes- destruxin derivatives from Metarhizium anisopliae as a case study /C. Seger, K. Eberhart, S. Sturm et al. //J. Chro-matog. A. - 2006. - V. 1117, N 1. - P. 67-73.
16. Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from porcine hemoglobin /Yike Yu, Jianen H., Yuji Miyaguchi et al. //Peptides. - 2006. -V. 27, Issue 11. - P. 2950-2956.
17. L-5-Hydroxytryptophan: antioxidant and anti-apoptotic principle of the intertidal sponge hymeniacidon heliophila /N. Lyseka, R. Kinscherfb, R. Clausc et al. //Z. Naturforsch. - 2003. -V. 58. - P. 568-572.
18. Обнаружение и выделение антибактериальных пептидов из экстрактов личинок Galleria mellonella /П.П. Пурыгин, Н.А. Кленова, Е.Г. Литвинова и др. //Вестник СамГУ - Естественно-научная серия. - 2006. - Т. 46, № 6. - С. 201-211.
19. Синтез циклического аналога энкефалина пролонгированного действия /И.В. Боброва, Н.А. Мышлякова, О.С. Папсуевич и др. //Биоорганическая химия. - 1995. - Т. 21, № 4. -С. 275-281.
20. Синтез, биологическая активность и конфармационные исследования аналогов энке-фалина, структурно родственных киоторфину /И.В. Боброва, Н.А. Абиссова, Л.У Но-диньш и др. //Биоорганическая химия. - 1988. - Т. 14, № 6. - С. 746-758.
21. Покорны, Я. Липиды /Я. Покорны //Жидкостная колоночная хроматография. - М., 1978. -С. 197-210.
22. Fractionation of lipids and proteolipids from cat grey and white matter by chromatography on an organophilic dextran gel /E.F. Soto, J.M. Pasquini, R. P^cido et al. //J. Chromatog. A. -1964. - V. 41. - P. 400-409.
23. Konishi, K. Analysis of sucrose esters of long-chain fatty acids on sephadex LH-20 /K. Ko-nishi, H. Inoue, N. Taniguchi //J. Chromatog. A. - 1971. - V. 54. - P. 367-372.
24. Determination of tocopherols, tocopherolquinones and tocopherolhydroquinones by gas chromatography-mass spectrometry and preseparation with lipophilic gel chromatography /H.U. Melchert, D. Pollok, E. Pabel et al. //J. Chromatogr. A. - 2002. - N 1-2. - P. 215-220.
25. Прохазка, Ж. Стероиды /Ж. Прохазка //Жидкостная колоночная хроматография. - М., 1978. - С. 211-248.
26. Serum concentrations of estrogens, sex hormone binding globulin, and androgens and risk of breast hyperplasia in postmenopausal women /C. Schairer, D. Hill, S.R. Sturgeon et al. //Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. - 2005. - V. 14. - P. 1660-1665.
27. Hollis, B.W. The assessment of circulating 25(OH)D and 1,25(OH)2D: Where we are and where we are going /B.W. Hollis, R.L. Horsta //J. Steroid Biochem. Mol. Biol. - 2007. - V. 103, N 3. - P. 473-476.
28. Хефтман, Э. Стероиды /Э. Хефтман //Хроматография. Практическое приложение метода. - М., 1986. - Т. 1. - С. 286-326.
29. Стероидные эфиры или их стереоизомеры, способы их получения, фармацевтическая композиция /Б. Аксельссон, Р. Браттсанд, Л. Келльстрем и др. - Описание изобретения A61K31/57 к патенту № 2112775; заявл. 29.01.1991; опубл. 10.06.1998.
30. Metabolism of thyroid hormones in cultured cardiac fibroblasts of neonatal rats /S. Heide, T. Visser, M. Everts et al. //J. Endocrinology. - 2002. - V. 174. - P. 111-119.
31. Mikhail, G. Radioimmunoassay of plasma estrone end estradiol /G. Mikhail, C. Wu, M. Fe-rin //J. Steroids. - 1970. - V. 15, Issue 3. - P. 333-352.
32. Laatikainen, T. Identification of C19O2 and C21O2 steroids in the glucuronide fraction of human bile /T. Laatikainen, R. Vihko //Eur. J. Biochem. - 1969. - V. 10. - P. 165-171.
33. Seki, T. Chromatographic separation of 17-ketosteroids and 17-hydroxycorticosteroids on sephadex LH-20 /T. Seki, T. Sugase //J. Chromatog. - 1969. - V. 42. - P. 503-508.
34. Van Lier, J.E. Sterol metabolism: Epimeric 23-hydroxycholesterols /J.E. Van Lier, L.L. Smith //J. Pharm. Sci. - 1970. - V. 59, N 5. - P. 719-721.
35. Axelson, M. Selective liquid chromatographic isolation procedure for gas chromatographic-mass spectrometric analysis of 3-ketosteroids in biological materials /M. Axelson, J. Sj^all //J. Chromatog. - 1976. - V. 126. - P. 705-716.
36. Axelson, M. Strong non-polar cation exchangers for the separationof steroids in mixed chromatographic systems /M. Axelson, J. Sj^all //J. Chromatog. - 1979. - V. 186. - P. 725-732.
37. Реконструкция генетической системы митохондрий кукурузы в митосомах при гель-фильтрации на колонке с сефадексом LH-20 /Константинов Ю.М., Луценко Г.Н., Под-сосоный В.А. и др. //Биологические мембраны. - 1990. - Т. 7, № 12. - С. 1295-1301.
38. Mishin, V.M. The reconstitution of microsomal monooxygenase during sephadex LH-20 gel filtration /V.M. Mishin, A.Yu. Grishanova, V.V. Lyakhovich //FEBS Lett. - 1979. - V. 104. -P. 300-302.
39. On the chemical constituents of Dipsacus asper /X. Tian, Y. Wang, H. Liu et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2007. - V. 55, N 12. - P. 1677-1681.
40. Sugimoto, Y. Production of (+)-5-deoxystrigol by Lotus japonicus root culture /Y. Sugimo-to, T. Ueyama //Phytochem. - 2008. - V. 69. - P. 212-217.
41. Куркин, В.А. Фармакогнозия /В.А. Куркин. - Самара, 2007. - 1239 с.
42. Nagashima, F. Diterpenoids and aromatic compounds from the three new zealand liverworts Jamesoniella kirkii, Balantiopsis rosea, and Radula species /F. Nagashima, Y. Kuba, Y. Asa-kawa //Chem. Pharm. Bull. - 2006. - V. 54, N 6. - P. 902-906.
43. New oleanene glucuronide obtained from the aerial parts of Melilotus officinalis /T. Hiraka-wa, M. Okaawa, J. Kinjo et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2000. - V. 48, N 2. - P. 286-287.
44. Two new steroidal saponins from gualou-xiebai-baijiu-tang consisting of Fructus trichosan-this and Bulbus allii macrostemi /X. He, F. Qiu, Y. Shoyama et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2002. -V. 50, N 5. - P. 653-655.
45. Kantz, K. Isolation and determination of polymeric polyphenols in wines using sephadex LH-20 /K. Kantz, V.L. Singleton //Am. J. Enol. Vitic. - 1991. - V. 42, N 4. - P. 309-316.
46. Jianxiong, T. Effect of SO2 concentration on polyphenol development during red wine micro-oxygenation /T. Jianxiong, S.I. Dykes, P.A. Kilmartin //J. Agr. and Food Chem. - 2007. -N 15. - P. 6104-6109.
47. Kantz, K. Isolation and determination of polymeric polyphenols using sephadex LH-20 and analysis of grape tissue extracts /K. Kantz, V.L. Singleton //Am. J. Enol. Vitic. - 1990. - V. 41, N 3. - P. 223-228.
48. Chen, L.G. Preparative separation of oligostilbenes from Vitis thunbergii var. taiwaniana by centrifugal partition chromatography followed by sephadex LH-20 column chromatography /L.G. Chen, C.C. Wang //Separation and purification technology. - 2009. - V. 66, N 1. - P. 65-70.
49. Production purification et activite biologique des piceides (Stilbenes) extraits de cultures cel-lulares de Vitis vinifera (L.) /S. Krisa, P. Waffo Teguo, A. Decendit et al. //Bul. Soc. Pharm. Bordeaux. - 1997. - V. 136. - P. 7-18.
50. Sun, J.M. Two new flavanone glycosides of Jasminum lanceolarium and their anti-oxidant activities /J.M. Sun, J.S. Yang, H. Zhang //Chem. Pharm. Bull. - 2007. - V. 55, N 3. - P. 474-476.
51. Antioxidative flavanone glycosides from the branches and leaves of Viscum coloratum /H. Yao, Z.X. Liao, Q. Wuet et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2006. - V. 54, N 1. - P. 133-135.
52. Antifungal rosane diterpenes and other constituents of Hugonia castaneifolia /L. Baraza, C. Joseph, J. Munissi et al. //Phytochem. - 2008. - V. 69. - P. 200-205.
53. Dibenzocyclooctadiene lignans from Kadsura philippinensis /Y.C. Shen, Y.C. Lin, Y.B. Cheng et al. //Phytochem. - 2009. - V. 70. - P. 114-120.
54. Shen, J. Two new xanthones from the stems of Garcinia cowa /J. Shen, J.S. Yang //Chem. Pharm. Bull. - 2006. - V. 54, N 1. - P. 126-128.
55. Shyr, M.H. Rossicasins A, B and rosicaside F, three new phenylpropanoid glycosides from Boschniakia rossica /M.H. Shyr, T.-H. Tsai, L.C. Lin //Chem. Pharm. Bull. - 2006. - V. 54, N 2. - P. 252-254.
56. Лекарственное сырьё растительного и животного происхождения. Фармакогнозия /под ред. Г.П. Яковлева. - СПб., 2006. - 845 с.
57. Four new nonaoxygenated C18 dibenzocylcooctadiene lignans from Kadsura philippinen-sis /Y.-C. Shen, Y.-C. Lin, A.F. Ahmed et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2007. - V. 55, N 2. -P. 280-283.
58. Two new lignans from Schisandra henryi /H.T. Liu, L.J. Xu, Y. Peng et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2009. - V. 57, N 4. - P. 405-407.
59. Бандюкова, З.А. Хроматография флавоноидов на сефадексах /З.А. Бандюкова, Г.Н. Земцова //Хроматографические и электрофоретические методы исследования биологически активных веществ: Сб. науч. тр. - Свердловск, 1976. - С. 15-26.
60. Identification of antioxidants from Taraxacum mongolicum by high-performance liquid chro-
matography-diode array detection-radical-scavenging detection-electrospray ionization mass spectrometry and nuclear magnetic resonance experiments /S. Shi, Y. Zhao, H. Zhou et al. //J. Chromatog. A. - 2008. - V. 1209, Issue 1-2. - P. 145-152.
61. Synthesis of various kinds of isoflavones, isoflavanes, and biphenyl-ketones and their 1,1-dip-
henyl-2-picrylhydrazyl radical-scavenging activities /H. Goto, Y. Terao, S. Akai et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2009. - V. 57, N 4. - P. 346-360.
62. Jonston, K.M. Separation of flavonoid compounds on sephadex LH-20 /K.M. Jonston, D.J. Stern, A.C. Waiss //J. Chromatogr. - 1968. - V. 33. - P. 539-541.
63. Chin, Y.W. Three new flavonol glycosides from the aerial parts of Rodgersia Podophylla /Y.-W. Chin, J. Kim //Chem. Pharm. Bull. - 2006. - V. 54, N 2. - P. 234-236.
64. Major flavonoid components of heartsease (Viola tricolor L.) and their antioxidant activities /V. Vukics, A. Kery, G.K. Bonn et al. //Anal. and Bioanal. Chem. - 2008. - N 7. - P. 1917-1925.
65. Four new isoflavonoids from the stem bark of Erythrina variegate /L. Xiaoli, W. Naili, W. M. Sau et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2006. - V. 54, N 4. - P. 570-573.
66. Intestinal uptake and biliary excretion of the isoflavone genistein in rats /J. Sfakianos, L. Coward, M. Kirk et al. //J. Nutr. - 1997. - V. 127. - P. 1260-1268.
67. Flavonoid and a rare benzophenone glycoside from the leaves of Aquilaria sinensis /J. Qi, J.J. Lu, J.H. Liu et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2009. - V. 57, N 2. - P. 134-137.
68. New flavonoid glycosides and cyanogenic glycosides from Dracocephalum peregrinum /P. Fu,
C.C. Zhao, J. Tang et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2009. - V. Б7, N 2. - P. 207-210.
69. Правдивцева, О.Е. Исследования по обоснованию новых подходов к стандартизации сырья и препаратов Зверобоя продырявленного /О.Е. Правдивцева, В.А. Курки //Химия растительного сырья. - 2008. - № 1. - С. 81-86.
70. Flavonoids with anti-Helicobacter pylori activity from Cistus laurifolius leaves /O. Ustun, B.
Ozcelik, Y. Akyon et al. //J. Ethnopharmacol. - 2006. - V. 108, N 3. - P. 4Б7-461.
71. Cytotoxic prenylated flavonoids from the stem bark of Maackia amurensis /X. Li, D. Wang,
M. Xia et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2009. - V. Б7, N 3. - P. 302-306.
72. Two new flavonol glycosides from Otostegia limbata /A. Khan, V.U. Ahmad, U. Farooq et al.
//Chem. Pharm. Bull. - 2009. - V. Б7, N 3. - P. 276-279.
73. Flavonol glycosides from Muehlenbeckia platyclada and their anti-inflammatory activity /C.T. Yen, P.W. Hsieh, T.L. Hwang et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2009. - V. Б7, N 3. - P. 280-282.
74. A new chromone, 11-hydroxy-sec-o-glucosylhamaudol from Ostericum koreanum /Y.J. Park, H.J. Kim, S.J. Lee et. al. //Chem. Pharm. Bull. - 2007. - V. ББ, N 7. - P. 106Б-1066.
7Б. Tanaka, N. Xanthones from stems of Hypericum chinense /N. Tanaka, Y. Takaishi //Chem. Pharm. Bull. - 2007. -V. ББ, N 1. - P. 19-21.
76. Agusta, A. Bisanthraquinone metabolites produced by the endophytic fungus Diaporthe sp. /A. Agusta, K. Ohashi, H. Shibuya //Chem. Pharm. Bull. - 2006. - V. Б4, N 4. - P. Б79-Б82.
77. Changes of contents and antioxidant activities of polyphenols during fruit development of four apple cultivars /J. Hui, J. Baoping, L. Jiangfen et al. //Eur. Food Res. and Technol. - 2006. -N 6. - P. 743-748.
78. Антипенко, Е.М. Полимерные ААфТ в исследовании физиологически-активных веществ. Перспективы жидкостной колоночной хроматографии дубильных веществ /Е.М. Антипенко, П.В. Кузнецов //Хим.-фарм. Журнал. - 199Б. - № 9. - С. Б6-71.
79. Jones, W.T. The condensed tannins of pasture legume species /W.T. Jones, R.B. Broadhurst, J.W. Lyttelton //Phytochem. - 1976. - V. 1Б. - P. 1407-1409.
80. Zhang, L. Tannins from Canarium album with potent antioxidant activity /L. Zhang, Y. Lin //J. Zhejiang. Univ. Sci. B. - 2008. - V. 9, N Б. - P. 407-41Б.
81. Проантоцианидины Polygonum coriarium /А.Б. Махматкулов, З.А. Кулиев, А.Д. Вдовин и др. //Химия природ соед. - 1991. - № 6. - С. 771-777.
82. Euscaphinin, a new ellagitannin dimer from Euscaphis japonica /H. Maeda, Y. Matsuo, T. Tanaka et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2009. - V. Б7, N 4. - P. 421-423.
83. Development of a high performance liquid chromatographic method for systematic quantitative analysis of chemical constituents in Rhubarb /K. Komatsu, Y. Nagayama, K. Tanaka et al. //Chem. Pharm. Bull. - 2006. - V. Б4, N 7. - P. 941-947.
84. Jorunnamycins A-C, new stabilized renieramycin-type bistetrahydroisoquinolines isolated from the thai nudibranch Jorunna funebris /K. Charupant, K. Suwanborirux, S. Amnuoypol et al. //Chem. Pharm. - 2007. - V. ББ, N 1. - P. 81-86.
8Б. Activities of naphthylisoquinoline alkaloids and synthetic analogs against Leishmania major /A. Ponte-Sucre, J. Faber, T. Gulder et all. //Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2007. -N.1. - P. 188-194.
86. Shary, S. New insights into the ligninolytic capability of a wood decay ascomycete /S. Shary,
S. A. Ralph, K. E. Hammel //Applied and environment. microbiol. - 2007. - N 11. - P. 66916694.
87. Сухих, А.С. Эпоксимодифицированные полисахаридные гели в химии гуминовых, гу-миноподобных веществ и препаратов на их основе. Автореф. дис. ... канд. фарм. наук /А.С. Сухих. - Кемерово, 2007. - 24 с.
88. Сухих, А.С. Гель универсального назначения - сефадекс LH-20 в разделении и очисте гуминовых кислот и гуминоподобных веществ /А.С. Сухих, П.В. Кузнецов //Сорбционные и хроматографические процессы. - 2009. - Т. 9, Вып. 2. - С. 266-274.
89. Кузнецов, П.В. Эпоксимодифицированные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ /П.В. Кузнецов. - Кемерово, 2002. - 104 с.
