CC BY
41
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ
Научная статья УДК 579.2; 543.42:57
DOI: https://doi.org/10.21285/2227-2925-2022-12-3-406-416
Применение сканирующей электронной микроскопии и ИК-спектроскопии для экспресс-оценки морфологии и химического состава бактериальных пленок при периодическом культивировании
Джигангир Асхатович Файзуллин*, Алексей Витальевич Кобелев**, Святослав Владимирович Клементьев**, Александр Семенович Сироткин**, Алексей Михайлович Рогов***, Вадим Владимирович Сальников*, Ольга Николаевна Макшакова*, Юрий Федорович Зуев*
*Казанский институт биохимии и биофизики ФИЦ КазНЦ РАН, г. Казань, Российская Федерация **Казанский национальный исследовательский технологический университет, г. Казань, Российская Федерация
***Казанский федеральный университет, г. Казань, Российская Федерация Автор, ответственный за переписку: Кобелев Алексей Витальевич, alexei-ksu@mail.ru
Аннотация. Основной формой существования бактерий в природе являются биопленки - прикрепленные к субстрату ассоциации клеток, окруженные полимерным матриксом. Изучение образования и функционирования биопленок имеет фундаментальное значение для управления процессами формирования микробных ассоциатов в экологии, биотехнологии и медицине. Поставленная цель требует разработки аналитических подходов, позволяющих при сохранении интактной структуры биопленок получать оперативную информацию на протяжении всего цикла жизнедеятельности микробного сообщества. В задачу работы входила адаптация методов сканирующей электронной микроскопии и ИК-спектроскопии в качестве экспресс-метода анализа микробных биопленок. Для этого проведено сопоставительное изучение кинетики роста культуры бактерий Bacillus subtilis в течение 24 ч культивирования на твердом субстрате методами классической микробиологии и биохимии, электронной сканирующей микроскопии и Фурье ИК-спектроскопии. Установлено, что морфология биопленки меняется от равномерного заселения поверхности носителя планктонными клетками на начальной стадии роста (6 ч) до накопления внеклеточного матрикса и образования микроколоний в экспоненциальной и стационарной фазе (12-18 ч) и постепенного истощения матрикса в фазе отмирания клеток (24 ч). Результаты ИК-спектроскопии коррелируют с результатами биохимических исследований, что, в свою очередь, позволяет проводить оперативную оценку накопления белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот и получать информацию об их структурном состоянии в биопленке. По итогам исследования можно заключить, что сканирующая электронная микроскопия и Фурье ИК-спектроско-пия в предложенном варианте применения позволяют получать взаимодополняющую информацию о морфологии и химическом составе микробных биопленок в процессе культивирования.
Ключевые слова: Bacillus subtilis, микробные биопленки, Фурье ИК-спектроскопия, сканирующая электронная микроскопия
Благодарности. Авторы выражают благодарность коллективному спектро-аналитическому Центру физико-химических исследований строения, свойств и состава веществ и материалов (ЦКП-САЦ) ФИЦ «Казанский научный центр РАН» за возможность проведения экспериментальных исследований, а также Казанскому (Приволжскому) федеральному университету за электронную микроскопию образцов в Междисциплинарном центре «Аналитическая микроскопия».
Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания Казанского научного центра РАН № 122011800137-0.
Для цитирования: Файзуллин Д. А., Кобелев А. В., Клементьев С. В., Сироткин А. С., Рогов А. М., Сальников В. В., Макшакова О. Н., Зуев Ю. Ф. Применение сканирующей электронной микроскопии и ИК-спектроскопии для экспресс-оценки морфологии и химического состава бактериальных пленок при периодическом культивировании // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2022. Т. 12. N 3. С. 406-416. https://doi.org/10.21285/2227-2925-2022-12-3-406-416.
© Файзуллин Д. А., Кобелев А. В., Клементьев С. В., Сироткин А. С., Рогов А. М., Сальников В. В., Макшакова О. Н., Зуев Ю. Ф., 2022
PHISICOCHEMICAL BIOLOGY
Original article
Application of scanning electron microscopy and IR spectroscopy for a timely evaluation of the morphology and chemical composition of bacterial films during batch
cultivation
Djigangir A. Faizullin*, Aleksei V. Kobelev**, Svyatoslav V. Klement'ev**, Alexander S. Sirotkin**, Aleksei M. Rogov***, Vadim V. Salnikov*, Olga N. Makshakova*, Yurii F. Zuev*
*Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics FRC KazSC RAS, Kazan, Russian Federation **Kazan National Research Technological University, Kazan, Russian Federation ***Kazan Federal University, Kazan, Russian Federation Corresponding author: Aleksei V. Kobelev, alexei-ksu@mail.ru
Abstract. Bacteria most commonly exist in nature in the form of bacterial biofilms, i.e. associations of cells attached to a substrate surrounded by a polymer matrix. Research into biofilm formation and functioning is fundamental to the management of microbial associations in ecology, biotechnology and medicine. This task requires the development of analytical approaches capable of providing timely information throughout the life cycle of microbial communities at the same time as maintaining their intact structure. In this paper, we apply scanning electron microscopy and IR spectroscopy as rapid methods for analysing microbial biofilms. To this end, the growth kinetics of a Bacillus subtilis culture cultivated on a solid substrate for 24 h was comparatively studied by the methods of classical microbiology and biochemistry, electron scanning microscopy and Fouriertransform IR spectroscopy. The biofilm morphology was found to vary from a uniform settlement of planktonic cells over the substrate surface at the initial stage of growth (6 h) followed by the accumulation of the extracellular matrix and the formation of microcolonies at the exponential and stationary stage (12-18 h) and a gradual depletion of the matrix at the stage of cell death (24 h). The results of IR spectroscopy were established to agree well with those of biochemical studies, thereby demonstrating the potential of the method for a timely evaluation of the accumulation of proteins, polysaccharides and nucleic acids and for obtaining information about their structural state in the studied biofilm. It is concluded that scanning electron microscopy and Fourier-transform IR spectroscopy can be used for obtaining complementary information about the morphology and chemical composition of microbial biofilms during their cultivation.
Keywords: Bacillus subtilis, microbial biofilms, Fourier-transform IR spectroscopy, scanning electron microscopy
Acknowledgements. The authors express their gratitude to the collective Spectro-Analytical Center for Physical and Chemical Studies of the Structure, Properties, and Composition of Substances and Materials (CKP-SAC) of the Federal Research Center "Kazan Scientific Center of the Russian Academy of Sciences" for the opportunity to conduct experimental studies. The authors thank the Kazan (Volga Region) Federal University for the electron microscopy of samples at the Interdisciplinary Center "Analytical Microscopy".
Funding. The work was carried out within the framework of the government assignment 122011800137-0 for Federal Research Center Kazan Scientific Center of RAS.
For citation: Faizullin D. A., Kobelev A. V., Klement'ev S. V., Sirotkin A. S., Rogov A. M., Salnikov V. V., Makshakova O. N., Zuev Yu. F. Application of scanning electron microscopy and IR spectroscopy for a timely evaluation of the morphology and chemical composition of bacterial films during batch cultivation. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya = Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology. 2022;12(3):406-416. (In Russian). https://doi.org/10.21285/2227-2925-2022-12-3-406-416.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что в большинстве случаев в медицинской и биотехнологической практике активность микробных сообществ обусловлена образованием и функционированием микробных биопленок, представляющих собой полимерный матрикс с
иммобилизованными клетками, потребляющих питательные вещества и выделяющих во внешнюю среду продукты метаболизма и сигнальные моле-кулы1. Для понимания этих процессов требуются методы изучения, позволяющие сохранить интакт-ную структуру биопленок и получать оперативную
1Марданова А. М., Кабанов Д. А., Рудакова Н. Л., Шарипова М. Р. Биопленки: основные методы исследования: учеб.-метод. пос. Казань: К(П)ФУ 2016. 42 с.
информацию на протяжении всего цикла жизнедеятельности микробного сообщества.
«Золотым стандартом» для исследования морфологии биопленок считается метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) [1]. Однако он является дорогостоящим, требует длительной и квалифицированной подготовки образцов, в ходе которой биопленки теряют жизнеспособность, а их дальнейшее использование для анализа или рекультивации становится невозможным.
Использование классических методов микробиологии и биохимии для анализа химического состава связано с разрушением биопленок, выделением и раздельным анализом их компонентов. Таким образом, несмотря на то, что эти методы характеризуются высокой точностью и селективностью, они являются трудоемкими и недостаточными для характеристики динамики развития микробного сообщества. Совершенствование и применение спектроскопических методов позволяет в значительной степени решить задачу недеструктивного анализа сложных объектов, к каковым относятся биопленки.
Метод инфракрасной спектроскопии успешно применяется для характеристики вегетативных клеток микроорганизмов, спор бактерий, а также биопленок [2-4]. Установлено [2, 4], что разные виды микроорганизмов характеризуются индивидуальными ИК-спектрами, что обусловлено уникальным для каждого вида набором макромолекул (белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот). Показано, что с помощью ИК-спектроскопии можно дифференцировать штаммы одного рода бактерий с высокой точностью (до 97%) [5] и получать информацию о химической структуре определенных компонентов бактерий - клеточных стенок, цито-плазматического вещества, пептидогликана, тейхо-евых кислот, ДНК [6-8]. Исследования бактериальных культур с равным успехом могут проводиться в виде водных суспензий или сухих порошков. Исследование биопленок затрудняется тем, что биопленки формируются на поверхности субстратов, которые могут иметь собственное поглощение в ИК-диапазоне. В ряде работ перед снятием спектров зрелые биопленки отделяли от субстрата [9]. Однако этот способ неприемлем для изучения биопленок на ранних стадиях роста из-за их низкой механической прочности. Выращивание и исследование биопленок in situ на поверхности элемента нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) [10] позволяет устранить это ограничение, однако это технически сложно осуществимо из-за необходимости длительное время поддерживать температуру и условия стерильности в измерительном отсеке спектрометра.
Выращивание биопленок ex situ на подложках из оптически прозрачного материала в ИК-диа-пазоне [11] представляется с практической точки зрения наиболее приемлемым, хотя требование прозрачности и биологической инертности ограничивает выбор подложек по химическому составу.
Регистрация спектров биопленок на просвет имеет преимущество перед методом НПВО также в том, что основной вклад в интенсивность спектра дает вещество в объеме биопленки, а не с ее поверхности, на которой могут адсорбироваться элементы питательной среды.
Настоящее исследование посвящено сопоставительному изучению кинетики роста модельной микробной культуры Bacillus subtilis на твердом субстрате с использованием комплекса методов классической микробиологии и биохимии, СЭМ и ИК-Фурье спектроскопии с целью оценки релевантности применения методов ИК-спектроскопии и СЭМ для получения оперативной информации о структуре и химическом составе биопленки на разных стадиях роста.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовалась культура Bacillus subtilis [12], полученная из лекарственного препарата «Споробактерин» (ООО «Бакорен», г. Оренбург, Россия).
Культивирование бактерий и получение образцов биопленок. Периодическое культивирование бактерий B. subtilis проводили в конических колбах на 250 мл на перемешивающем устройстве Incubator ES-20/60 (SIA Biosan, Латвия) при температуре 37 °C, скорости перемешивания 120 об/мин в течение 36 ч с отбором проб через каждые 6 ч. В качестве питательных сред использовался мясопептонный бульон (МПБ) и МПБ с красителем Конго красным (0,8 г/л), стерилизация которых проводилась в автоклаве в течение 30 мин при 0,5 ати2.
Биопленки выращивали на подложках из фтористого кальция или предметных стеклах путем внесения в чашки Петри со стерильной средой и подложками 18-часового инокулята в соотношении 1:45 и последующей инкубации в течение 24 ч с отбором проб через каждые 6 ч.
Анализ формирования и микроструктуры биопленок. Отбор проб биопленки для анализа бактериального роста осуществляли в процессе культивирования B. subtilis вплоть до 36 ч. Число клеток B. subtilis в биопленке определяли путем их окрашивания генцианвиолетом [13, 14]. По полученным данным строили кривую роста. Количество жизнеспособных клеток определяли методом Коха.
Количество белка в биопленке B. subtilis определяли по методу Брэдфорда3. Предварительно биопленку, сформированную на поверхности предметных стекол, гидролизовали с помощью 2н NaOH в термоблоке при 90 °С в течение 30 мин. В полученных растворах определяли содержание белка.
Для оценки биосинтеза экзополисахаридов в биопленке B. subtilis исследуемые образцы, выращенные на МПБ с красителем Конго красным, отмывали в физиологическом растворе, проводили экстракцию красителя 96%-м раствором этанола и измеряли оптическую плотность экстракта [14, 15].
2Нетрусов А. И. Практикум по микробиологии. М.: Академия, 2005. 608 с.
Для проведения анализа ИК-спектроскопией биопленки выращивали по методу, описанному выше, используя в качестве подложек пластины из CaF2. В отличие от традиционного способа подготовки образцов биопленок для регистрации ИК-спектров, состоящего в соскабливании пленки с подложки, измельчении и запрессовке в матрицу из KBr [16], в данном исследовании использовались интактные биопленки. Для этого пластины на разных стадиях роста биопленки извлекали из питательной среды и высушивали при комнатной температуре и влажности. Биопленки не промывали, чтобы не нарушить их структуру. Пластины помещали в кюветный отсек Фурье Ик-спектрофо-тометра IR-Affinity 1 (Shimadzu, Япония) и регистрировали спектры на просвет в интервале волновых чисел 4000-900 см-1 при спектральном разрешении 4 см-1 с усреднением 64 индивидуальных сканов. Спектрометр продували сухим азотом для устранения мешающего влияния паров воды и углекислого газа. Для каждого образца регистрировали спектры с нескольких участков поверхности, которые затем усредняли.
ИК-спектры бактерий снимали аналогично, предварительно высушив водную суспензию клеток на поверхности пластины из CaF2.
Исходные спектры подвергали предварительной обработке, состоящей в вычитании базовой линии и сглаживании.
Для выделения отдельных компонентов многокомпонентных полос поглощения вычисляли вторую производную спектров. Отнесение полос проводили на основе данных работ [17-19].
Для исследования методом СЭМ биопленки выращивали на предметных стеклах. После извлечения из питательной среды подложки с биопленками высушивали и фиксировали в 2%-м глутаровом альдегиде на фосфатном буфере (рН 7,3) в течение 1 ч. После постфиксации в 1%-й осмиевой кислоте в течение 1 ч образцы промывали в буфере и дистиллированной воде и подвергали ступенчатой дегидратации в растворах спирта, после чего покрывали золотом [20]. Образцы исследовали на сканирующем электронном микроскопе Merlin (CarlZeiss, Германия) Междисциплинарного центра аналитической микроскопии Казанского федерального университета.
Обработка результатов экспериментов проводилась с помощью пакета программ Microsoft Excel 2007 с оценкой достоверности по критерию Стью-дента-Фишера4. Использовали параметрический t-критерий Стьюдента, достоверными считали различия при вероятности ошибки р<0,05.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Формирование биопленок в процессе микробного роста. На рис. 1 представлены микрофотографии поверхности субстрата после 6 и 24 ч роста
биопленки, полученные методом СЭМ. Изображения показывают, что по истечении 6 ч на поверхности субстрата (подложки) присутствуют преимущественно разрозненные палочкообразные образования без заметного количества матрикса (рис. 1, а). Размеры объектов соответствуют ожидаемым для бактерийВ. subt/l/s:длинаотдельныхклетокварьиру-ется от 0,7 до 3 мкм, диаметр составляет 0,5-0,6 мкм. Клетки образуют линейные цепочки, состоящие из 2 и более (до 10) звеньев, что указывает на их активное деление. Часто попадаются клетки, от которых отходят тяжи различной длины к субстрату или к другим клеткам (рис. 1, b). Через 24 ч роста обнаруживаются округлые плотные скопления клеток (рис. 1, с). Размеры скоплений варьируются от нескольких мкм до нескольких десятков мкм, а длина клеточных цепочек сокращается до 1-3 звеньев. На этом этапе роста отчетливо проявляется внеклеточный матрикс, заполняющий межклеточные промежутки в скоплениях в виде диффузного вещества (рис. 1, d).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что структура биопленки на всем протяжении роста не является однородной и состоит из дискретных клеточных ассоциатов переменного размера. Внутри ассоциатов клетки объединены веществом внеклеточного матрикса. Промежутки между ассоциатами заполняются либо питательной средой, либо матриксом.
Накопление белков и экзополисахаридов в биопленке. Результаты определения биомассы, накопления белка и экзополисахаридов в биопленке в процессе периодического культивирования культуры B. subtilis продемонстрированы на рис. 2-4.
На рис. 2 представлена кривая роста культуры B. subtilis в биопленке, полученная по результатам измерения оптической плотности раствора генцианвиолета, экстрагированного этанолом из биопленки: чем больше красителя первоначально было связано в биопленке, тем большее значение оптической плотности раствора было зарегистрировано в результате экстракции.
Полученные результаты показали, что число клеток в биопленке в первые 6 ч принципиально не увеличивается, что связано с первичной иммобилизацией небольшого количества клеток на поверхности и началом образования биопленки. Затем были отмечены фазы ускорения и экспоненциального роста биопленки (6-18 ч), после чего наступала стационарная фаза роста, когда дальнейшее накопление клеток прекращается вследствие истощения питательной среды и накопления продуктов метаболизма [13].
При этом было отмечено, что концентрация белка в биопленке возрастает до 12 ч роста, что связано с активным формированием биопленки на поверхности, после которого наступает фаза
3Общая фармакопейная статья. Определение белка. ОФС. 1.2.3.0012.15 МЗ РФ. 2015. 16 с. [Электронный ресурс]. URL: https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-3-0012-15-opredelenie-belka (24.02.2022). "Воробьев В. Я., Елсуков А. И. Теория и эксперимент. Минск: Высшая школа, 1989. 109 с.
Рис. 1. Изображения сканирующей электронной! микроскопии поверхности субстрата после 6 (а, b) и24ч (c, d) роста биопленки. Размер масштабного отрезка равен 10(а,с)и 1 мкм (b, d)
Fig. 1. Scanning (electron microscopy images ofthe substrate surface after£> (a, b) and 24 h (c, d) biofilm growth.
The size ofthe scale bar is 10 (a, c) and 1 jm (b, d)
плато до 18 ч включительно (см. рис. 3). Дальнейшее увеличение концентрации белка в биопленке, по-видимому, связано слизисом клоток.
Синтез экзополисахаиидов (Э ПС) в биоплени ке У. зиЬ/Лю (сме рис. 4) определяли по количеству экстрагируемого этасолол красителя Конго красного, связывающегося с ЭПС в процессе инкубации [21]. Результаты никазалн замедленный синтез ЭПС до 12 ч °ента и дальнвсшим резким увеличе нием на 18 ч е последующим выходом на плато. Полученные данные коррелируют о кривой
роста матрикса биопленки культуры (см. рис. 2). Эки сведения подт верждаются проведен ны ми ранее исследованиями [22], кокарые показали, что синтез ЭПС и |аеат матрикса еиопленка B. eubfOis проесходитсимбатно (аоэффиа|иеат корреляции г=0,998), что свидктеаьствует о тее, что матрикс состорт из ЭПС.
ИК-спектроспопия офизцавбиоиленки. ИК/спек-тры сухой суспензии и сухой биопленки (24 ч) B. subf/7/s выявляют рааличия it составе етих уб-разцов. Прежде всего следует отметать разнацу
12
Время, ч
12
Время, ч
Рис. 2. Кинетика роста культуры Bacillus subtilis в биопленке в процессе периодического культивирования
Fig. 2. Growth kinetics of Bacillus subtilis culture in biofilm during batch cultivation
Рис. 3. Концентр ация белка в биопленке Bacillus subtilis в проце ссе периодического культивирования
Fig. 3. Protein concentration in Bacillus subtilis biofilm during batch cultivation
b
a
18
24
0 6 12 18 24
Время, ч
Рис. 4. Кои центрация экзополисахаридов в биопленке Bacillus subtilis Ei процессе периодического культивирования
Fig. 4. Concentiation of exopolysaccharides in Bacillus subtilis biofilm during batch cultivation
1300 1400
Волновое число, см-1
Рис.
, 55. MK-eneKTpbi oyxoi) oyoneH3Mi) KieToK Bacillus subtilis (wTpuxu) m oyxoi) 6-io run eHKM nooie 24 h MHKy6aqum (o nncLUHaa i^i-fiMi^^. (ICms;K-rppt^i Hopof MfJOEEiiJ Hibi k MaKOMMyMy ncioobi nomoL^eHua aMiifl II 6eiKa (1550 OM-1)
Fig. 5. R spectra of Bacillus subtiHs ce11 diy suspensbn
(dashes) and dry biofilm after 24 h of incubation (soiid line). The spectra are noimalized to the maximum absorption band of the amide II protein (1550 cm-1)
? 0,8 с
ÍC
Ü
« 0,4
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700
Волновое число, см-1
Рис. 6. ИК-спектры сухих биопленок Bacillus subtilis ига разныых стади ях роста: 6 ( точки ), 12 (пунктир),18 (штрихи) и 2!4 (сплошная линия) ч. Нижняя пунктирная линия соответствует спектру питательной средыы
l^ig. (6. IF? spectra of dry Bacillus subtilis biofilms at different growth stages: 6 (points»), 122 (dotted line)? 18 (dashed lines), and 24 (solid line) F) The blue dotted l ine indicate the nutrient medium spectrum
в форме амид-1 - наиболее интенсивной полосы в спектрах, обусловленной поглощением карбонильных групп в составе полипептидной цепи белков (рис. 5).
Более узкая и интенсивная полоса в спектре биопленки с максимумом на 1655 см-1 и плечом на 1637 см-1 указывает на присутствие высокоупоря-доченных белков с большой долей альфа-спиралей и вытянутых бета-структур [17]. Известно, что в белково-полисахаридном матриксе биопленки преобладает белок TasA [23], имеющий спиральную структуру, что соответствует наблюдаемому спектру. В спектре суспензии полоса амид-1 уширена и за счет этого менее интенсивна. Уширение свидетельствует о большой доле неупорядоченных структур. Интенсивности полос фосфатных групп ДНК (1240 и 1080 см-1) и углеводов (1060 см-1) в суспензии и пленке примерно равны, однако отличаются по форме, указывая на различия в составе.
На рис. 6 представлены спектры образцов биопленок на разных стадиях роста. Спектр образца после 6 ч роста в основном мало отличается от спектра питательной среды для образования биопленки. Изменения проявляются лишь в некоторых полосах - 1425, 1550, 1680 см-1, что, по-видимому, соответствует вкладу белков. Спектр МПБ представляет собой широкие плохо разрешенные полосы, соответствующие суммарному поглощению различных аминокислот, коротких полипептидов и прочих компонент. Однако на более поздних сроках роста в спектре преобладают узкие полосы, соответствующие поглощению структурно упорядоченных белков. Резкое сокра-
s
с
£ 0,6 Í
¡É 0,2
0 □ 0
?
0,2 I
Í ¡
ц
0,1 §
12
Время, ч
Рис. 7. Интенсивность в максимуме полосы амид1 (1655 см-1) белка (темные символы), интенсивность в максимум е 10 60 см-1 полосы поглощения полисахаридов (светлы е символы) от в ремени роста биопленки. Точки, соответствующие 6 ч, получены вычитанием спектра мясопептонного бульона из спектра 6-часовой биопленки
Fig. 7. Intensity at the maximum of the amide1 band (1655 cm-1) ofthe protein (dark symbols), intensity at fhe maximum of 1060 cm-1 ofthe absorption band of polysaccharides (lighf symbols) versus the bio film growth time. The points corresponding to 6 h were obtained by subtracting fhe MPB spectrum from the 6 hi biofNm spectrum
1100
1200
1.2
0,4
0,3
0,8
1,2
0,4
0,6
18
24
0,2
щение спектрального вклада питательной среды связано, по нашему мнению, с изменением гидро-фобности поверхности. На ранних стадиях роста гидрофильная поверхность подложки с адсорбированными одиночными клетками хорошо удерживает воду с растворенными в ней элементами МПБ. После 12 ч бактериального роста образуется развитая бактериальная пленка с гидрофобной поверхностью [24], которая лучше освобождается от остатков культуральной жидкости в процессе подготовки образцов.
Зависимость интенсивности поглощения белка на 1655 см-1 и суммарной полосы фосфатных групп и полисахаридов на 1060 см-1 от времени роста представлена на рис. 7. На зависимости можно выделить характерные участки роста биопленки: лаг-период до 6 ч, постоянная скорость накопления - 6-24 ч. При сравнении зависимостей, полученных при определении концентрации белков и ЭПС (см. рис. 3, 4), а также из ИК-спек-тров (см. рис. 7), обнаруживается их близкое сходство (гбелков = 0,913; гэпс = 0,881), что указывает на идентичность химической природы исследуемых веществ. Обращает на себя внимание тот факт, что суммарное поглощение белка и суммарное поглощение фосфатных групп ДНК и полисахаридов в спектре меняется симбатно (г = 0,998) (см. рис. 7).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Результаты исследования химического состава и морфологии биопленок В. subtШs на разных стадиях роста комплексом спектральных, микробиологических и микроскопических методов согласуются с литературными данными [25, 26].
2. Показано, что увеличение биомассы в биопленке В. subtШs коррелирует с накоплением белка (г = 0,795) и ЭПС (г = 0,998), что отражает зависимость между биосинтезом необходимых метаболитов, ростом клеток и продукцией полимерного матрикса.
3. Результаты ИК-спектроскопии коррелируют (г = 0,913; г = 0,881) с данными биохимиче-
белков эпс
ских исследований и позволяют проводить оперативную оценку накопления белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот, а также дают информацию об их структурном состоянии в биопленке в процессе культивирования микробной культуры и образования биопленки.
4. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что СЭМ и Фурье ИК-спектроскопия в предложенном варианте применения дают возможность получать взаимодополняющую информацию о морфологии и химическом составе микробных биопленок в процессе культивирования.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Abed S. E., Ibnsouda S. K., Latrache H., Hamadi F. Scanning electron microscopy (SEM) and environmental SEM: suitable tools for study of adhesion stage and biofilm formation. IntechOpen, 2012. 830 p. https://doi.org/10.5772/34990.
2. Preisner O., Lopes J.A., Guiomar R., Machado J., Menezes J. C. Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy in bacteriology: towards a reference method for bacteria discrimination // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2007. Vol. 387, no. 5. P. 1739-1748. https://doi.org/10.1007/s00216-006-0851-1.
3. Уткин Д. В., Куклев В. Е., Ерохин П. С., Осина Н. А. Применение методов спектроскопии для индикации и идентификации патогенных биологических агентов // Проблемы особо опасных инфекций. 2011. N 2. С. 68-71. https://doi. org/10.21055/0370-1069-2011-2(108)-68-71.
4. Рой А. А., Курдиш И. К., Остапюк С. Н., Савельев Ю. В. Влияние условий культивирования Bacillus subtilis ИМВ B-7023 и его стрептомицину-стойчивого мутанта на свойства поверхности этих бактерий // Мiкробiологiчний журнал. 2017. Т. 79. N 4. С. 12-20.
5. Сунцова А. Ю., Гулиев Р. Р., Попов Д. А., Вос-трикова Т. Ю., Дубоделов Д. В., Щеголихин А. Н. [и др.]. Идентификация микроорганизмов с помощью инфракрасных Фурье-спектров // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2018. N 4. С. 57-65. https://doi. org/10.24075/vrgmu.2018.046.
6. Rodriguez-Saona L. E., Khambaty F. M., Fry F. S., Dubois J., Calvey E. M. Detection and identification of ba^na in a juce matrix with Fourier
transform-near infrared spectroscopy and multivariate analysis // Journal of Food Protection. 2004. Vol. 67, no. 11. P. 2555-2559. https://doi.org/10.4315/0362-028x-67.11.2555.
7. Rebuffo C. A., Schmitt J., Wenning M., von Stetten F., Scherer S. Reliable and rapid identification of Listeria monocytogenes and Listeria species by artificial neural network-based Fourier transform infrared spectroscopy // Applied and Environmental Microbiology. 2006. Vol. 72, no. 2. P. 994-1000. https://doi.org/10.1128/ AEM.72.2.994-1000.2006.
8. Wenning M., Buchl N. R., Scherer S. Species and strain identification of lactic acid bacteria using FTIR spectroscopy and artificial neural networks // Journal of Biophotonics. 2010. Vol. 3, no. 8-9. P. 493-505. https://doi.org/10.1002/jbio.201000015.
9. Ma W., Peng D., Walker S. L., Cao B., Gao C.-H., Huang Q., et al. Bacillus subtilis biofilm development in the presence of soil clay minerals and iron oxides // NPJ. Biofilms and Microbiomes. 2017. Vol. 3. Article number: 4. https://doi.org/10.1038/s41522-017-0013-6.
10. Humbert F., Quiles F. In-situ study of early stages of biofilm formation under different environmental stresses by ATR-FTIR spectroscopy. In: Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances. Badajoz: Formatex Research Center, 2011. P. 889-895.
11. Tugarova A. V., Scheludko A. V., Dyatlova Yu. A., Filip'echeva Yu. A., Kamnev A. A. FTIR spectroscopic study of biofilms formed by the rhizobacterium Azospirillum brasilense Sp245 and its mutant Azospirillum brasilense Sp245.1610 // Journal
of Molecular Structure. 2017. Vol. 1140. P. 142-147. https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2016.12.063.
12. КобелевА.В.,КлементьевС.В.,ВдовинаТ.В., Сироткин А. С. Оценка активности внеклеточных лектинов бактерий в формировании агрегированных микробных форм // Бутлеровские сообщения. 2021. Т. 65. N 1. С. 105-113. https://doi. org/10.37952/R0I-jbc-01/21-65-1-105.
13. Merritt J. H., Kadouri D. E., O'Toole G. A. Growing and analyzing static biofilms // Current Protocols in Microbiology. 2005. https://doi. org/10.1002/9780471729259.mc01b01.
14. Хабибуллина А. Р., Вдовина Т. В., Кобеле-ва Й. В., Сироткин А. С. Исследование процесса биологической дефосфотации модельных сред с использованием фосфатаккумулирующих бактерий // Вестник технологического университета. 2017. Т. 20. N 19. С. 131-133.
15. Годовалов А. П., Карпунина Т. И. Определение компонентного состава биопленок грамполо-жительных бактерий // Клиническая лабораторная диагностика. 2019. Т. 64. N 10. С. 632-634. https:// doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-10-632-634.
16. Nayak N., Nag T. C., Satpathy G., Ray S. B. Ultrastructural analysis of slime positive & slime negative Staphylococcus epidermidis isolates in infectious keratitis // Indian Journal of Medical Research. 2007. Vol. 125, no. 6. P. 767-771.
17. Litvinov R. I., Faizullin D. A., Zuev Yu. F., Weisel J. W. The a-helix to p-sheet transition in stretched and compressed hydrated fibrin clots // Biophysical Journal. 2012. Vol. 103, no. 5. P. 10201027. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2012.07.046.
18. Wang H., Ding S., Wang G., Xu X., Zhou G. In situ characterization and analysis of Salmonella biofilm formation under meat processing environments using a combined microscopic and spectroscopic approach // International Journal of Food Microbiology. 2013. Vol. 167, no. 3. P. 293-302. https://doi.org/10.1016/j. ijfoodmicro.2013.10.005.
19. Gieroba B., Krysa M., Wojtowicz K., Wiater A., Pleszczynska M., Tomczyk M., et al. The FTIR and raman spectroscopies as tools for biofilm characterization created by cariogenic streptococci //
International Journal of Molecular Sciences. 2020. Vol. 21, no. 1. P. 3811. https://doi.org/10.3390/ijms21113811.
20. McCutcheon J., Southam G. Advanced biofilm staining techniques for TEM and SEM in geomicro-biology: Implications for visualizing EPS architecture, mineral nucleation, and microfossil generation // Chemical Geology. 2018. Vol. 498. P. 115-127. https://doi.org/10.1016/j.chemgeo.2018.09.016.
21. Ярец Ю. И., Шевченко Н. И. Новый метод анализа бактериальной биопленки // Наука и инновации. 2016. N 10. С. 64-68.
22.КлементьевС.В.,КобелевА.В.,СироткинА.С. О формировании клеточных агрегатов под действием бактериальных лектинов // Пищевые технологии и биотехнологии: материалы XVII Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием, посвященная Году науки и технологий в Российской Федерации (г. Казань, 20-23 апреля 2021 г.). Казань: КНИТУ, 2021. С. 453-458.
23. Branda S. S., Chu F., Kearns D. B., Losick R., Kolter R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix // Molecular Microbiology. 2006. Vol. 59, no. 4. P. 1229-1238. https://doi.org/10.1111/ j.1365-2958.2005.05020.x.
24. Epstein A. K., Pokroy B., Seminara A., Aizenberg J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2010. Vol. 108, no. 3. P. 995-1000. https://doi. org/10.1073/pnas.1011033108.
25. Бисенова Г. Н., Торина А. К., Шегебаева А. А. Изучение динамики роста бактерий родов Bacillus и Pseudomonas при периодическом культивировании // Вестник науки Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина. 2014. Т. 82. N 3. C. 3-9.
26. ШариповаМ.Р.,МардановаА.М.,РудаковаН.Л., Пудова Д. С. Бистабильность и формирование матрикса биопленки как механизмы адаптации Bacillus subtilis в стационарной фазе // Микробиология. 2021. Т. 90. N 1. С. 24-42. https://doi.org/10.31857/ S0026365620060178.
REFERENCES
1. Abed S. E., Ibnsouda S. K., Latrache H., Hama-di F. Scanning electron microscopy (SEM) and environmental SEM: suitable tools for study of adhesion stage and biofilm formation. IntechOpen; 2012. 830 p. https://doi.org/10.5772/34990.
2. Preisner O., Lopes J.A., Guiomar R., Machado J., Menezes J. C. Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy in bacteriology: towards a reference method for bacteria discrimination. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2007;387(5):1739-1748. https://doi.org/10.1007/s00216-006-0851-1.
3.UtkinD.V.,KouklevV.E.,ErokhinP.S.,OssinaN.A. Application of spectroscopy methods for indication and identification of pathogenic biological agents. Problemy osobo opasnykh infektsii = Problems of Particularly Dangerous Infections. 2011;(2):68-71. (In Russian). https://doi.org/10.21055/0370-1069-2011-
2(108)-68-71.
4. Roy A. A., Kurdish I. K., Ostapyuk S. N., Save-lyev Yu. V. Influence of the cultivation conditions of Bacillus subtilis IMV B-7023 and its streptomycin-resistant mutant on the surface properties of these bacteria. Mikrobiologichnii zhurnal. 2017;79(4):12-20. (In Russian). https://doi.org/10.15407/microbi-olj79.04.012.
5. Suntsova A. Yu., Guliev R. R., Popov D. A., Vostrikova T. Yu., Dubodelov D. V., Shchegolikh-in A. N., et al. Identification of microorganisms by fourier-transform infrared spectroscopy. Vestnik Rossiiskogo gosudarstvennogo meditsinskogo uni-versiteta = Bulletin of Russian State Medical University. 2018;(4):57-65. https://doi.org/10.24075/vrg-mu.2018.046.
6. Rodriguez-Saona L. E., Khambaty F. M., Fry F. S.,
Dubois J., Calvey E. M. Detection and identification of bacteria in a juce matrix with Fourier transform-near infrared spectroscopy and multivariate analysis. Journal of Food Protection. 2004;67(11):2555-2559. https://doi.org/10.4315/0362-028x-67.11.2555.
7. Rebuffo C. A., Schmitt J., Wenning M., von Stetten F., Scherer S. Reliable and rapid identification of Listeria monocytogenes and Listeria species by artificial neural network-based Fourier transform infrared spectroscopy. Applied and Environmental Microbiology. 2006;72(2):994-1000. https://doi.org/10.1128/ AEM.72.2.994-1000.2006.
8. Wenning M., Buchl N. R., Scherer S. Species and strain identification of lactic acid bacteria using FTIR spectroscopy and artificial neural networks. Journal of Biophotonics. 2010;3(8-9):493-505. https:// doi.org/10.1002/jbio.201000015.
9. Ma W., Peng D., Walker S. L., Cao B., Gao C.-H., Huang Q., et al. Bacillus subtilis biofilm development in the presence of soil clay minerals and iron oxides. NPJ. Biofilms and Microbiomes. 2017;3. Article number: 4. https://doi.org/10.1038/s41522-017-0013-6.
10. Humbert F., Quilès F. In-situ study of early stages of biofilm formation under different environmental stresses by ATR-FTIR spectroscopy. In: Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances. Badajoz: Formatex Research Center; 2011, p. 889-895.
11. TugarovaA. V., ScheludkoA. V., Dyatlova Yu.A., Filip'echeva Yu. A., Kamnev A. A. FTIR spectroscopic study of biofilms formed by the rhizobacterium Azo-spirillum brasilense Sp245 and its mutant Azospirillum brasilense Sp245.1610. Journal of Molecular Structure. 2017;1140:142-147. https://doi.org/10.1016/j. molstruc.2016.12.063.
12. Kobelev A. V., Klementyev S. V., Vdovina T. V., Sirotkin A. S. Evaluation of the activity of bacterial extracellular lectins in the formation of aggregated microbial forms. Butlerovskie soobshcheniya = But-lerov Communications. 2021;65(1):105-113. https:// doi.org/10.37952/R0I-jbc-01/21-65-1-105.
13. Merritt J. H., Kadouri D. E., O'Toole G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. 2005. https://doi. org/10.1002/9780471729259.mc01b01.
14. Chabibullina A. P., Vdovina T. V., Kobeleva J. V., Sirotkin A. S. Study of the process of biological de-phosphatization of model media using phosphate-accumulating bacteria. Vestnik tekhnologicheskogo universiteta. 2017;20(19):131-133. (In Russian).
15. Godovalov A. P., Karpunina T. I. The determination of biofilm composition of gram-positive bacteria. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika = Russian Clinical Laboratory Diagnostics. 2019;64(10):632-634. https://doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-10-632-634.
16. Nayak N., Nag T. C., Satpathy G., Ray S. B. Ultrastructural analysis of slime positive & slime negative Staphylococcus epidermidis isolates in infectious keratitis. Indian Journal of Medical Research. 2007;125(6):767-771.
17. Litvinov R. I., Faizullin D. A., Zuev Yu. F., Weisel J. W. The a-helix to p-sheet transition in
stretched and compressed hydrated fibrin clots. Biophysical Journal. 2012;103(5):1020-1027. https://doi. org/10.1016/j.bpj.2012.07.046.
18. Wang H., Ding S., Wang G., Xu X., Zhou G. In situ characterization and analysis of Salmonella biofilm formation under meat processing environments using a combined microscopic and spectroscopic approach. International Journal of Food Microbiology. 2013;167(3):293-302. https://doi.org/10.1016/j. ijfoodmicro.2013.10.005.
19. Gieroba B., Krysa M., Wojtowicz K., Wiater A., Pleszczynska M., Tomczyk M., et al. The FT-IR and raman spectroscopies as tools for biofilm characterization created by cariogenic streptococci. International Journal of Molecular Sciences. 2020;21(1):3811. https://doi.org/10.3390/ijms21113811.
20. McCutcheon J., Southam G. Advanced biofilm staining techniques for TEM and SEM in geomicro-biology: Implications for visualizing EPS architecture, mineral nucleation, and microfossil generation. Chemical Geology. 2018;498:115-127. https://doi. org/10.1016/j.chemgeo.2018.09.016.
21. Yarets Yu. I., Shauchenka N. I. A new method for the bacterial biofilms analysis in medicine. Nauka i innovatsii. 2016;(10):64-68. (In Russian).
22. Klementev S. V., Kobelev A. V., Sirotkin A. S. About formation of cell aggregates under the action of bacterial lectins. In: Pishchevye tekhnologii i biotekhnologii: materialy XVII Vserossiiskoi konfer-entsii molodykh uchenykh, aspirantov i studentov s mezhdunarodnym uchastiem, posvyashchennaya Godu nauki i tekhnologii v Rossiiskoi Federatsii = Food technologies and biotechnologies: materials of the XVII All-Russian Conference of Young Scientists, Postgraduates and Students with International Participation, dedicated to the Year of Science and Technology in the Russian Federation. Kazan: Kazanskii natsional'nyi issledovatel'skii tekhnologicheskii uni-versitet, 2021; p. 453-458. (In Russian).
23. Branda S. S., Chu F., Kearns D. B., Losick R., Kolter R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Molecular Microbiology. 2006;59(4):1229-1238. https://doi.org/10.1111/ j.1365-2958.2005.05020.x.
24. Epstein A. K., Pokroy B., Seminara A., Aizen-berg J. Bacterial biofilm shows persistent resistance to liquid wetting and gas penetration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2010;108(3):995-1000. https://doi.org/10.1073/pnas.1011033108.
25. Bisenova G. N., Torina A. K., Shegebaeva A. A. Study of the dynamics of growth of bacteria of the genera Bacillus and Pseudomonas during periodic cultivation. Vestnik nauki Kazakhskogo agrotekh-nicheskogo universiteta im. S. Seifullina = Herald of Science of S Seifullin Kazakh Agro Technical University. 2014;82(3):3-9. (In Russian).
26. Sharipova M. R., Mardanova A. M., Rudako-va N. L., Pudova D. S. Bistability and formation of the biofilm matrix as adaptive mechanisms during the stationary phase of Bacillus Subtilis. Mikrobi-ologiya. 2021;90(1):24-42. https://doi.org/10.31857/ S0026365620060178.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ
Д. А. Файзуллин,
старший научный сотрудник,
Казанский институт биохимии и биофизики ФИЦ
КазНЦ РАН,
420111, г. Казань, ул. Лобачевского, 2, Российская Федерация, dfaizullin@mail.ru
https://orcid.org/ 0000-0002-2872-732
А. В. Кобелев,
ведущий инженер,
Казанский национальный исследовательский технологический университет, 420015, г. Казань, ул. Карла Маркса, 68, Российская Федерация, alexei-ksu@mail.ru
https://orcid.org/ 0000-0001-9070-739Х
С. В. Клементьев,
магистрант, техник 1 категории, Казанский национальный исследовательский технологический университет, 420015, г. Казань, ул. Карла Маркса, 68, Российская Федерация, slava_klementev3715@mail.ru https://orcid.org/ 0000-0001-5459-974Х
А. С. Сироткин,
д.т.н., профессор, заведующий кафедрой промышленной биотехнологии, Казанский национальный исследовательский технологический университет, 420015, г. Казань, ул. Карла Маркса, 68, Российская Федерация, asirotkin66@gmail.com https://orcid.org/ 0000-0002-4480-9907
A. М. Рогов,
инженер,
Казанский федеральный университет, 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, Российская Федерация, alexeyrogov111 @gmail.com https://orcid.org/ 0000-0002-7086-4280
B. В. Сальников,
заведующий лабораторией,
Казанский институт биохимии и биофизики ФИЦ
КазНЦ РАН,
420111, г. Казань, ул. Лобачевского, 2, Российская Федерация,
vadim.salnikov.56@mail.ru https://orcid.org/ 0000-0002-2367-672Х
О. Н. Макшакова,
старший научный сотрудник,
Казанский институт биохимии и биофизики ФИЦ
КазНЦ РАН,
420111, г. Казань, ул. Лобачевского, 2, Российская Федерация,
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Djigangir A. Faizullin,
Senior Researcher,
Kazan Institute of Biochemistry
and Biophysics, Federal Research Center
KazSC RAS,
2, Lobachevsky St., 420111, Kazan, Russian Federation, dfaizullin@mail.ru
https://orcid.org/ 0000-0002-2872-732X
Aleksei V. Kobelev,
Lead Engineer,
Kazan National Research Technological University, 68, Karl Marx St., 420015, Kazan, Russian Federation, alexei-ksu@mail.ru
https://orcid.org/ 0000-0001-9070-739X
Svyatoslav V. Klement'ev,
Master's Student, Technician of the 1st category, Kazan National Research Technological University, 68, Karl Marx St., 420015, Kazan, Russian Federation, slava_klementev3715@mail.ru https://orcid.org/ 0000-0001-5459-974X
Alexander S. Sirotkin,
Dr. Sci. (Engineering), Professor,
Head of Industrial Biotechnology Department,
Kazan National Research Technological University,
68, Karl Marx St., 420015, Kazan,
Russian Federation,
asirotkin66@gmail.com
https://orcid.org/ 0000-0002-4480-9907
Aleksei M. Rogov,
Engineer,
Kazan Federal University, 18, Kremlevskaya St., 420008, Kazan, Russian Federation, alexeyrogov111@gmail.com https://orcid.org/ 0000-0002-7086-4280
Vadim V. Salnikov,
Head of Laboratory,
Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, Federal Research Center KazSC RAS, 2, Lobachevsky St., 420111, Kazan, Russian Federation, vadim.salnikov.56@mail.ru https://orcid.org/ 0000-0002-2367-672X
Olga N. Makshakova,
Senior Researcher,
Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics Federal Research Center KazSC RAS, 2, Lobachevsky St., 420111, Kazan, Russian Federation,
omega12@inbox.ru
https://orcid.org/ 0000-0002-2367-672Х Ю. Ф. Зуев,
руководитель лаборатории биофизической химии наносистем,
Казанский институт биохимии и биофизики ФИЦ КазНЦ РАН,
420111, г. Казань, ул. Лобачевского, 2, Российская
Федерация,
yufzuev@mail.ru
https://orcid.org/0000-0002-6715-2530
Вклад авторов
Д. А. Файзуллин - проведение экспериментов по ИК-спектроскопии.
А. В. Кобелев, С. В. Клементьев - подготовка образцов биопленок, биохимический анализ биопленок.
А. М. Рогов, В. В. Сальников - подготовка
образцов для СЭМ.
Д. А.Файзуллин, О. Н. Макшакова,
А. В. Кобелев, А. С. Сироткин, Ю. Ф. Зуев -
проведение общего анализа результатов.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.
Информация о статье
Поступила в редакцию 11.07.2022. Одобрена после рецензирования 05.09.2022. Принята к публикации 15.09.2022.
omega12@inbox.ru
https://orcid.org/ 0000-0002-2367-672X Yurii F. Zuev,
Head of the Laboratory of Biophysical Chemistry of Nanosystems,
Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, Federal Research Center KazSC RAS, 2, Lobachevsky St., 420111, Kazan, Russian Federation, yufzuev@mail.ru
https://orcid.org/0000-0002-6715-2530
Contribution of the authors
D. A. Faizullin - IR spectroscopy. A. V. Kobelev, S. V. Klementiev - biofilm samples preparation, biochemical analysis of biofilms. A. M. Rogov, V. V. Salnikov - samples preparation for SEM.
D. A. Faizullin, O. N. Makshakova, A. V. Kobelev, A. S. Sirotkin, Yu. F. Zuev - general analysis of the results.
Conflict interests
The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.
The final manuscript has been read and approved by all the co-authors.
Information about the article
The article was submitted 11.07.2022. Approved after reviewing 05.09.2022. Accepted for publication 15.09.2022.
